מחקר זה נתמך על ידי מענקים מטייוואן (משרד המדע והטכנולוגיה, 100-2923-B-002-002-MY3 ביותר 106-2313-B-002-011-MY3 כדי H.J.L.), צ'כיה (גרנט אוניברסיטת סוכנות דרום בוהמיה, gaju ב להעניק 065/2017/P Y.H.L), ו (ספרד משרד הכלכלה הספרדית ואת התחרותיות, מעניקה CGL2012-36251 ו- CGL2015-64727-P X.B., הממשלה קטלאנית, להעניק 2014 SGR 619 X.B.); זה גם קיבלו תמיכה כספית מהקרן האירופאית כלכלי ולפיתוח אזורי (פדר כספים X.B.).

1. סינתזה והכנה של dsRNA
<ol><li>לזהות את האתרים היעד dsRNA באזור 3' לא מתורגם של גנים היעד. DsTub משמש עבור מיקוד הגן α-טובולין (באמבטיה) (מספר גישה GenBank: KX228233), dsEGFP כמו פקד dsRNA שלילי מתוכנן מרצף משופר פלורסצנטיות ירוק חלבון (EGFP; מספר גישה GenBank: LC311024).</li>
	<li>לבצע הגברה סטנדרטי PCR לסנתז את התבניות dsRNA עם גנים ספציפיים תחל המכיל את רצף יזם T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). ה-PCR הגברה תנאים ומידע פריימר להשתמש הם אלה דיווח מאת לין ואח. (2017) 12 (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להמשיך עם הכנה dsRNA באמצעות תיעוד T7 קיט (ראה טבלה של חומרים), ההוראות של היצרן. הערה: להניב כמות גבוהה dsRNA, לערבב שני בתגובות שפופרת אחת (ב µL 40 סה כ), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>להוסיף 2 µL של DNase (ראה טבלה של חומרים) לתוך dsRNA דגימות למשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לתבניות DNA תקציר.</li>
	<li>להוסיף 200 ריאגנט החילוץ µL (ראה טבלה של חומרים), 40 µL כלורופורם, ואז מערבולת.</li>
	<li>צנטריפוגה 10 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C, ואז לאסוף את תגובת שיקוע (150 µL) צינור microcentrifuge חדש.</li>
	<li>לזרז dsRNA ע י הוספת אלכוהול איזופרופיל µL 150 המקננת למשך 15 דקות על קרח.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 15 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C ולאחר מכן להסיר את תגובת שיקוע.</li>
	<li>להוסיף 200 µL של האתנול 70% לשטוף dsRNA כדורי. צנטריפוגה 10 דקות ב 13,000 g x-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר האתנול, חזור על השלבים שטיפת אתנול.</li>
	<li>להסיר את אתנול וביו -גלולה dsRNA יבש על ידי ריכוז ואקום צנטריפוגלי למשך 3 דקות, ולאחר מכן resuspend dsRNA עם RNase ללא מים.</li>
	<li>לקבוע את כמות dsRNA מטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטרים UV-Vis של מיקרו-נפח (ראה טבלה של חומרים) לפי הוראות היצרן ולהתאים לריכוז הרצוי (לדוגמה, µg/µL 0.25 עבור הכנת dsRNA lipoplexes).</li>
	<li>אחסן את הדגימות dsRNA ב-20 ° C עד 3 חודשים.</li>
</ol>2. הכנת dsRNA Lipoplexes
<ol><li>µL 4 מהתרכובת תרביות תאים למהול (ראה טבלה של חומרים) על-ידי הוספת 4 µL של תמיסת גלוקוז 5%. לדלל 4 µL של dsRNA (1 µg) על-ידי הוספת 4 µL של תמיסת גלוקוז 5%.</li>
	<li>להוסיף את הפתרון ריאגנט ליפוזום מדולל מיד לתוך הפתרון מדולל dsRNA בבת אחת. מערבולת בקצרה כדי לערבב אותם, ואז תקופת דגירה של 15 דקות ב 25 º C. הערה: לא מערבבים את הפתרונות בסדר הפוך.</li>
	<li>Lipoplexes dsRNA מוכנים לשימוש. בתוך שעה של הכנה ושימוש למחוק לאחר 1 שעה. הערה: על פי הוראות היצרן, lipoplexes אמור לשמש בהקדם האפשרי.</li>
</ol>3. אוסף של אנזימים חוץ-תאית מ Hemolymph ומיץ פיתול
<ol><li>
מאגר מלוחים חרקים (מניות x 10)
	<ol>
<li>מערבבים את 900 מ"ל מים מזוקקים כפול עם 109.3 g NaCl, 15.7 גרם אשלגן כלורי, 6.3 g CaCl2ו- 8.3 g MgCl2·6H2O.</li>
		<li>להתאים את ה-pH את 6.8, ולמלא עד 1,000 מ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אוסף hemolymph
	<ol>
<li>עזים ומתנגד הג'וקים על הקרח עד שהם לא זזים במשך 3 דקות.</li>
		<li>החזק את הג'וק עם שתי אצבעות (באגודל ובאצבע) ולאחר תגביר את הצד הבטני של המקק.</li>
		<li>השתמש את המספריים ויבתר כדי לחתוך את הקצה של coxa של רגל אחורית. הערה: חותכים לצומת המחובר בין coxa לבין תל הירך. הכריתה של החלק השני של coxa היה פחות יעיל כדי לאסוף את hemolymph.</li>
		<li>לסחוט את הבטן בעדינות עם האצבע האמצעית, ולאסוף את hemolymph לדמם החתך עם micropipette 10 µL.</li>
		<li>מאגר של hemolymph של כמה ג'וקים (5 אנשים) צינור microcentrifuge. הערה: שמור את צינורות microcentrifuge על הקרח כדי למנוע melanization. נפח ממוצע של hemolymph המתקבל מקק זכר הוא 2-3 µL.</li>
		<li>ספין למטה hemolymph בקצרה עם צנטריפוגה benchtop 10 s.</li>
		<li>העברת לנפח הרצוי של hemolymph (כלומר, 10 µL), ערבב את זה עם µL 50 x 1 מאגר מלוחים חרקים.</li>
		<li>צנטריפוגה 10 דקות ב g x 1,000 ב 4 ° C עד שיהיו תוצאות hemocytes. להעביר את תגובת שיקוע צינור נקי microcentrifuge.</li>
		<li>לכמת את ריכוז חלבון הכולל שימוש ספקטרופוטומטרים UV-Vis של מיקרו-נפח על ידי מדידת A28015.</li>
		<li>התאם כל מדגם יש ריכוז חלבון זהה (6 מ ג/µL של חלבון סה כ).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אוסף מיץ פיתול
	<ol>
<li>עזים ומתנגד הג'וקים על קרח. לשדך הג'וקים בצד הגחוני על הצלחת ניתוח קר 1 x מאגר מלוחים חרקים באמצעות סיכות חרקים.</li>
		<li>לנתח את הבטן עם פינצטה משובחים. הסר את הבטן כולה (כולל הבטן הקדמי, אמצע, האחוריות) כדי מאכל טריים עם 1 x מאגר מלוחים חרקים.</li>
		<li>להסיר את הבטן הקדמי ואת האחוריות, העבר במהירות את פיתול לרכבת התחתית microcentrifuge המכיל 100 µL מאגר מלוחים חרקים.</li>
		<li>מאגר של midguts של מקקים 6 באותו צינור ו מערבולת 10 s.</li>
		<li>צנטריפוגה 10 דקות ב g x 1,000 ב 4 ° C כדי לסובב את hemocytes ואת הבטן רקמות. להעביר את תגובת שיקוע צינור נקי microcentrifuge.</li>
		<li>לכמת את ריכוז חלבון הכולל שימוש ספקטרופוטומטרים UV-Vis של מיקרו-נפח על ידי מדידת A28015.</li>
		<li>התאם כל מדגם יש ריכוז חלבון זהה (6 מ ג/µL של חלבון סה כ).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. dsRNA Assay השפלה
<ol><li>להכין טרי 4 µL של dsRNA עירום או dsRNA lipoplexes (1 µg).</li>
	<li>מערבבים מיץ dsRNA אנזימים פתרונות עם µL 10 מאגר מלוחים חרקים (בקרה), שחולצו מן hemolymph, או פיתול.</li>
	<li>להוסיף 2 µL של EGTA (20 מ מ) או מים נטולי RNase כדי להפריד בין דגימות כפקדי עבור עיכוב של אנזים פעילויות.</li>
	<li>תקופת דגירה של שעה אחת או יותר (6, 12 או 24 שעות) ב 25 º C.</li>
	<li>להוסיף 200 ריאגנט החילוץ µL ו- 40 µL כלורופורם, ואז מערבולת.</li>
	<li>צנטריפוגה 10 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C, ואז לאסוף את תגובת שיקוע (150 µL) צינור microcentrifuge חדש.</li>
	<li>לזרז dsRNA ע י הוספת אלכוהול איזופרופיל µL 150 המקננת למשך 15 דקות על קרח.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 15 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C ולאחר מכן להסיר את תגובת שיקוע.</li>
	<li>להוסיף 200 µL של האתנול 70% לשטוף dsRNA כדורי. צנטריפוגה 10 דקות ב 13,000 g x-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר האתנול, חזור על השלבים שטיפת אתנול.</li>
	<li>להסיר את אתנול צניפה dsRNA יבש על ידי ריכוז ואקום צנטריפוגלי עבור 3 מינימלית dsRNA Resuspend עם מים ללא RNase µL 10.</li>
	<li>בדוק את תקינות dsRNA שטופלו באמצעות אלקטרופורזה בג'ל על 1.5% agarose ג'ל.</li>
</ol>5. אוראלי מינהל dsRNA
<ol><li>לשמור על ג'וקים בדיאטה ad libitum של מזון יבש (מזון). לשלול אספקת מים המקקים יום אחד לפני dsRNA בליעה ניסויים.</li>
	<li>החזק מקק על ידי גרירה כנפיו עם המלקחיים גמיש (איור 1, שלב 5). הערה: לא אתפוס את חלקי הגופות של ג'וקים.</li>
	<li>להכין את dsRNA lipoplexes, וכן dsRNA עירום, האכלה, כמתואר בסעיף 2. הערה: Lipoplexes dsRNA צריך להיות מוכן טרי לפני האכלה.</li>
	<li>להאכיל µL 4 של dsRNA lipoplexes או dsRNA עירום (250 ng) עם micropipette.</li>
	<li>לאט לאט pipet ה-droplet של הפתרון dsRNA לסגור mouthparts של מקקים ולתת את הג'וקים להבלע ה-droplet לחלוטין.</li>
	<li>ביצוע הניסויים בליעה פעמיים ביום (h 1 לאחר אורות ו- h 1 לפני האורות) עבור 8 ימים או 16 ימים ברציפות. הערה: כל המקקים רכשה מים רק באמצעות האכלה ידנית עם dsRNA ריאגנטים פתרון או שליטה (למשלמים חינם נוקלאז, תמיסת גלוקוז, ריאגנט ליפוזום) במהלך הניסויים בליעה.</li>
	<li>לספק בקבוקי מים המקקים לאחר 16 ימי בליעה של dsRNA ניסויים.</li>
</ol>6. להעריך את נוקאאוט
<ol><li>בזמן שבחרת נקודות (2, 9, 17 ימים לאחר assay בליעה dsRNA), לאסוף את החרקים dsEGFP - או dsTub-מתייחסים ומנתחים הרקמות שבחרת (למשל, פיתול).</li>
	<li>לבצע PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR). לרביעיית-PCR הגברה התנאים והמידע תחל כפי שדווח על ידי לין ואח. (2017) 12.</li>
	<li>להעריך את הבקרה וחרקים שטופלו dsRNA מדי יום כדי לבדוק את התמותה ולהסיר את הג'וקים כי הם כבר לא נעים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicing+and+slicing:+The+core+machinery+of+the+RNA+interference+pathway.">Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway.</a> FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).</li><li>Bell&#233;s, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+drosophila:+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects.">Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).</li><li>Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J., Jeon, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+Five+-+Biological+Mechanisms+Determining+the+Success+of+RNA+Interference+in+Insects.">Chapter Five - Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 312, 139-167 (2014).</li><li>San Miguel, K., Scott, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next+generation+of+insecticides:+dsRNA+is+stable+as+a+foliar-applied+insecticide.">The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide.</a> Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).</li><li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi.">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).</li><li>Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+efficiency,+systemic+properties,+and+novel+delivery+methods+for+pest+insect+control:+What+we+know+so+far.">RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far.</a> Front. Physiol. 7, (2016).</li><li>Garbutt, J. S., Bell&#233;s, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success:+Evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica.">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).</li><li>Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+a+cDNA+encoding+extracellular+dsRNase+and+its+expression+in+the+silkworm,+Bombyx+mori.">Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNAi+efficacy+among+insect+species+is+attributable+to+dsRNA+degradation+in+vivo.">Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).</li><li>Wynant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+functional+characterization+and+phylogenetic+analysis+of+double+stranded+RNA+degrading+enzymes+present+in+the+gut+of+the+desert+locust,+Schistocerca+gregaria.">Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).</li><li>Huang, J. -. H., Belles, X., Lee, H. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+hypertrehalosemic+hormone+receptor+in+relation+to+hemolymph+trehalose+and+to+oxidative+stress+in+the+cockroach+Blattella+germanica.">Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica.</a> Exp. Endocrinol. 2, 114 (2012).</li><li>Lin, Y. -. H., Lee, C. -. M., Huang, J. -. H., Lee, H. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+regulation+of+permethrin+susceptibility+by+glutathione+S-transferase+(BgGSTD1)+in+the+German+cockroach+(Blattella+germanica).">Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica).</a> J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).</li><li>Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+taiman+in+insect+metamorphosis.">A role for taiman in insect metamorphosis.</a> PLOS Genet. 10, 1004769 (2014).</li><li>Lozano, J., Monta&#241;ez, R., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-2+family+regulates+insect+metamorphosis+by+controlling+the+juvenile+hormone+signaling+pathway.">MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).</li><li>Lin, Y. -. H., Huang, J. -. H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+delivery+of+dsRNA+lipoplexes+to+German+cockroach+protects+dsRNA+from+degradation+and+induces+RNAi+response.">Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response.</a> Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).</li><li>Gharavi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+cationic+polyamines+for+chiral+microcapsules+and+siRNA+delivery.">Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).</li><li>Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingested+double-stranded+RNAs+can+act+as+species-specific+insecticides.">Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+responses+of+migratory+locusts+to+systemic+RNA+interference+via+double-stranded+RNA+injection+and+feeding.">Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding.</a> Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).</li><li>Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+response+of+BmToll9-1+and+RNAi+machinery+genes+to+exogenous+dsRNA+in+the+midgut+of+Bombyx+mori.">Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori.</a> J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).</li><li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+for+mosquito+and+mosquito-borne+disease+control.">RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control.</a> Insects. 8, 4 (2017).</li><li>Taning, C. N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+RNAi+to+control+Drosophila+suzukii:+Laboratory+testing+against+larval+and+adult+stages.">Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages.</a> J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).</li><li>Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+systems+for+in+vivo+siRNA+delivery.">Lipidic systems for in vivo siRNA delivery.</a> AAPS J. 11, 639-652 (2009).</li><li>Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+lipid+nanoparticles+for+siRNA+delivery.">Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery.</a> Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).</li><li>Xia, Y., Tian, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+surface+properties+on+liposomal+siRNA+delivery.">Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery.</a> Biomaterials. 79, 56-68 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מציג שיטה עבור RNAi יעיל באמצעות משלוח אוראלי של dsRNA lipoplexes, הכוללת הגנה מפני עיכול ribonuclease במיץ פיתול המקק הגרמני. כפי שמוצג מחקרים אחרים במינים חרקים שונים, האפקט RNAi המסכן דרך משלוח אוראלי של dsRNA בעיקר מהצהוב מאת ההשפלה של dsRNA8,9,10. ...

RNAi הוכח בתור שיטה יעילה כדי ביטוי גנים תמונות ציפורים באמצעות מנגנון של שביל שתיקה post-transcriptional מופעלות על ידי מולקולות dsRNA פרוקריוטים רבים1. בעשור האחרון של המחקר, RNAi הפך להיות כלי שימושי כדי ללמוד את הפונקציות של גנים מפיתוח להתנהגות depleting הביטוי של גנים ספציפיים באמצעות הזרקת ו/או האכלה של dsRNA ב taxa שונים של חרקים2,3. בשל ירידה לפרטים החוסן של אפקט depleting, היישום של RNAi הוא להיות נחשב כיום כאסטרטגיה פוטנציאליים על המזיק בקרת ניהול4,5. עם זאת, היעילות של RNAi משתנה מאוד בין מיני חרקים, בהתאם של גנים שונים מהווים מטרה ואת שיטות משלוח. גוף גדל והולך של הראיות עולה כי חוסר היציבות של dsRNA, אשר נפגמים בשל ribonucleases, הוא גורם קריטי היעילות המוגבלת של RNAi5,6. למשל, הרגישות RNAi הנמוכה בסקסטה Manduca יש כבר מוסברת על ידי העובדה dsRNA מעורבב עם hemolymph היה מפורק במהירות בתוך שעה7. באופן דומה, הנוכחות של אלקליין nucleases ב פיתול, אשר ביעילות לבזות dsRNA בלע, הוא בחריפות מתואם עם יעילות נמוכה RNAi הזמנות חרקים שונים8,9,10.
מסירת dsRNA אוראלי הוא מעניין במיוחד עבור היישום של RNAi אסטרטגיה בקרת מזיקים, אבל שיטה מפגר ההשפלה של dsRNA מאת nucleases ב פיתול לא עדיין פותחה, אשר היה פוטנציאל כדי להבטיח אפקטיביות RNAi באמצעות האכלה. עם זאת, בעיית חוסר של RNAi כדי משלוח אוראלי של dsRNA דווחה על-ידי להאכיל כמות גדולה של dsRNA, למשל 50 µg, טוואי המשי, או האכלה ברציפות במשך 8 ימים (8 dsRNA µg סה כ) בהמין המדומה. המקק הגרמני, במיוחד germinica, היא רגישה מאוד RNAi על ידי ההזרקה של dsRNA11,12,13,14, אך לא מגיבים dsRNA באמצעות האכלה. לאחרונה, לין. et al. (2017) הדגימו כי dsRNA במארז עם תוצאות נושאות ליפוזום RNAi מוצלחת כדי נוקאאוט בביטוי הגן α-טובולין התמותה משמעותי פיתול והקו הדק של תיקן גרמני15. כמו ההשפלה של dsRNA בפיתול הגורם המגביל של RNAi אוראלי, נושאות ליפוזום לשמש רכב על dsRNA מפני השפלה, אשר זה רלוונטי ברצון ושאר חרקים עם פעילויות נוקלאז חזק בבטן. ראוי לציין, הסיבה לבחירת הכימית תרביות תאים מסוים (ראה טבלה של חומרים) היינו כמו מנשא ליפוזום בפרוטוקול הנוכחי הוא זה נבדק על תרביות תאים קו תא חרקים עם רעילות פחות, על פי הוראות היצרן. לפי ההשוואה של תרביות תאים ליפוזום שונים במערכות Gharavi. ואח (2013) 16, היעילות של RNA מפריעות קטן transfecting (siRNA) הוא כ זהה בין זה לבין מערכות אחרות זמינים מסחרית אשר שימשו dsRNA מערכות אספקה אחר חרקים17,18 . יתר על כן, שיטת האכלה שלנו הוא זהיר מספיק כדי להבטיח שהכמות הנכונה של dsRNA בליעתו על ידי כל מקק, כי התוצאות אינן מאושרות ועמיד. לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי לבין תוצאות מדגימים כי השימוש dsRNA lipoplexes משפר את יציבות dsRNA ופותח את הדלת בעיצוב של משלוח אוראלי האסטרטגיה של RNAi, אשר הינה גישה מבטיחה להדברה של עתיד.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1124px;" width="1123">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent</td>
			<td style="width:133px;">SignaGen</td>
			<td style="width:157px;">SL100499</td>
			<td style="width:481px;">for lipoplexes preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blend Taq plus</td>
			<td style="width:133px;">TOYOBO&#160;</td>
			<td style="width:157px;">BTQ-201</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast SYBR Green Master Mix</td>
			<td style="width:133px;">ABI&#160;</td>
			<td style="width:157px;">4385612</td>
			<td>for qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">FirstChoice RLM-RACE Kit</td>
			<td style="width:133px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">AM1700</td>
			<td>for 3&#39; UTR identification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:133px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">AMB13345</td>
			<td>for dsRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TURBO DNase</td>
			<td style="width:133px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">AM2239</td>
			<td>remove DNA template from dsRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRIzol</td>
			<td style="width:133px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">15596018</td>
			<td>for dsRNA or total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RQ1 RNase-Free Dnase</td>
			<td style="width:133px;">Promega</td>
			<td style="width:157px;">M6101</td>
			<td>remove DNA template from total RNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">C2432</td>
			<td>for dsRNA or total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">I9516</td>
			<td>for dsRNA or total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>24102</td>
			<td>for dsRNA or total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Diethyl pyrocarbonate, DEPC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">D5758</td>
			<td>for RNase free water preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">glucose solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">G3285</td>
			<td>for lipoplexes preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride, NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">S7653</td>
			<td>insect saline buffer formula</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P9333</td>
			<td>insect saline buffer formula</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:352px;">Calcium chloride, CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>insect saline buffer formula</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">M2670</td>
			<td>insect saline buffer formula</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">EGTA&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">E3889</td>
			<td>enzyme inhibitor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting scissor</td>
			<td style="width:133px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>cockroach dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fine tweezers</td>
			<td style="width:133px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>cockroach dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">flexible tweezer</td>
			<td style="width:133px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>cockroach holding&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pipetman</td>
			<td style="width:133px;">RAININ</td>
			<td style="width:157px;">P10</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:133px;">Axygen</td>
			<td>MCT175C, PCR02C</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">pipette tip&#160;</td>
			<td style="width:133px;">Axygen</td>
			<td></td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">vortexter</td>
			<td style="width:133px;">Digisystem</td>
			<td style="width:157px;">vm1000</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Minispin centrifuge</td>
			<td style="width:133px;">The Gruffin Group</td>
			<td style="width:157px;">GMC 206</td>
			<td>for liquid spin down&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:133px;">ALC</td>
			<td style="width:157px;">PK121R</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH meter&#160;</td>
			<td style="width:133px;">JENCO</td>
			<td style="width:157px;">6071</td>
			<td>for pH adjust</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">micro-volume spectrophotometer</td>
			<td style="width:133px;">Quawell</td>
			<td style="width:157px;">Q3000</td>
			<td>nucleic acid quantitative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">PCR Thermal cycler</td>
			<td style="width:133px;">ABI&#160;</td>
			<td style="width:157px;">2720</td>
			<td>for template PCR or&#160; dsRNA synthesis incubation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">quantitative real-time PCR</td>
			<td style="width:133px;">ABI&#160;</td>
			<td style="width:157px;">StepOne plus</td>
			<td>gene expression quantitative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifugal Vacuum Concentrators</td>
			<td style="width:133px;">eppendorf</td>
			<td style="width:157px;">5301</td>
			<td>for dsRNA or total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multipette&#160;</td>
			<td style="width:133px;">eppendorf</td>
			<td style="width:157px;">xstream</td>
			<td>for real-time PCR sample loading&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose I</td>
			<td style="width:133px;">amresco</td>
			<td style="width:157px;">0710</td>
			<td>for nucleic acid electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">tub gene specfifc forward preimer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">tub gene specfifc reverse preimer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">dsTub template forward primer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">dsTub template reverse primer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">dsEGFP template forward preimer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">dsEGFP template reverse preimer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">tub qPCR forward primer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">tub qPCR reverse preimer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">ef1 qPCR forward primer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">ef1 qPCRreverse preimer</td>
			<td style="width:133px;">tri-I biotech</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>CCT GCA GAG GAA GAC GAA G</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical use of rna interference: oral delivery of double-stranded rna in liposome carriers for cockroaches

התערבות ב RNA (RNAi) הוחל באופן נרחב על חשיפת בפונקציות ביולוגיות של גנים רבים, יש כבר וליטוש של המזיק שליטה בכלי הפועלים על ידי הפרעה של ביטוי גנים חיוניים. למרות שיטות שונות, כגון זריקה, האכלה, ההשרייה דווחו על מסירה מוצלחת של זוגיות גדילי RNA (dsRNA), היעילות של RNAi דרך משלוח אוראלי של dsRNA זה משתנה מאוד בין קבוצות חרקים שונים. המקק הגרמני, במיוחד גרמנית, היא רגישה מאוד ההזרקה של dsRNA, כפי שמוצג על ידי מחקרים רבים שפורסמו בעבר. המחקר הנוכחי מתאר שיטה כדי להדגים כי dsRNA אנקפסולציה עם נשאים ליפוזום מספיקה מפגר ההשפלה של dsRNA מאת מיץ פיתול. ראוי לציין, ההזנה רציפה של dsRNA אנקפסולציה באמצעות ליפוזומים משמעותית מפחית את הביטוי טובולין, פיתול, והוביל למוות של מקקים. לסיכום, ניסוח וניצול מיטבי של dsRNA lipoplexes, אשר להגן dsRNA נגד nucleases, יכול להיות שימוש מעשי של RNAi הדברת חרקים בעתיד.

ערכה פשוטה של הפרוטוקול למסירה אוראלי של dsRNA מוצג באיור 1, שבו מוצגים השלבים המפתח עבור הכנת dsRNA lipoplexes.
על מנת לחקור את ההגנות המוקנות על ידי ליפוזום נושאות על השפלה dsRNA במיץ פיתול של גרמנית דרבוזמינותו של ex-vivo שבו ?...

Watch this Scientific Journal Video about Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches at JoVE.com

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

שימוש מעשי של RNA הפרעה: משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA ב ליפוזום ספקים עבור ג ' וקים

כתב יד זה מדגים דלדול של ביטוי גנים ב פיתול של המקק הגרמני באמצעות בליעה דרך הפה של זוגיות גדילי RNA במארז ליפוזומים.

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

practical-use-rna-interference-oral-delivery-double-stranded-rna

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.3K Views.  National Taiwan University. כתב יד זה מדגים דלדול של ביטוי גנים ב פיתול של המקק הגרמני באמצעות בליעה דרך הפה של זוגיות גדילי RNA במארז ליפוזומים.

Video: Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

דור מצע לEndonucleases של מערכות CRISPR / קאש

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

באמצעות אסטרטגית האכלת התערבות RNA בתיווך למסך לגנים מעורבים בויסות משקל גוף בנמטודות<em&gt; ג elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

דלדול של רנ&quot;א ריבוזומלי לMetagenomic גוט יתוש RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been made in identifying the components of the editosome complex that catalyze RNA editing. However, it is still not clear how those proteins work together. Chemical compounds obtained from a high-throughput screen against the editosome may block or affect one or more steps in the editing cycle. Therefore, the identification of new chemical compounds will generate valuable molecular probes for dissecting the editosome function and assembly. In previous studies, in vitro editing assays were carried out using radio-labeled RNA. These assays are time consuming, inefficient and unsuitable for high-throughput purposes. Here, a homogenous fluorescence-based &#8220;mix and measure&#8221; hammerhead ribozyme in vitro reporter assay to monitor RNA editing, is presented. Only as a consequence of RNA editing of the hammerhead ribozyme a fluorescence resonance energy transfer (FRET) oligoribonucleotide substrate undergoes cleavage. This in turn results in separation of the fluorophore from the quencher thereby producing a signal. In contrast, when the editosome function is inhibited, the fluorescence signal will be quenched. This is a highly sensitive and simple assay that should be generally applicable to monitor in vitro RNA editing or high throughput screening of chemicals that can inhibit the editosome function.

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

RNA Catalyst ככתב להקרנת סמים נגד RNA עריכה בtrypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully annotated genome sequence, transposon-based transgenesis, and effective RNA interference (RNAi). Among these advantages, RNAi-based gene knockdown techniques are at the core of Tribolium research. T. castaneum show a robust systemic RNAi response, making it possible to perform RNAi at any life stage by simply injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the beetle&#8217;s body cavity.
In this report, we provide an overview of our larval RNAi technique in T. castaneum. The protocol includes (i) isolation of the proper stage of T. castaneum larvae for injection, (ii) preparation for the injection setting, and (iii) dsRNA injection. Larval RNAi is a simple, but powerful technique that provides us with quick access to loss-of-function phenotypes, including multiple gene knockdown phenotypes as well as a series of hypomorphic phenotypes. Since virtually all T. castaneum tissues are susceptible to extracellular dsRNA, the larval RNAi technique allows researchers to study a wide variety of tissues in diverse contexts, including the genetic basis of organismal responses to the outside environment. In addition, the simplicity of this technique stimulates more student involvement in research, making T. castaneum an ideal genetic system for use in a classroom setting.

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

RNA interference (RNAi)-based gene knockdown techniques are at the core of Tribolium research. Here, we provide an overview of our larval RNAi technique in Tribolium castaneum. Larval RNAi is a simple, but powerful technique that provides quick access to loss-of-function phenotypes, allowing researchers to study gene functions in diverse contexts.

התערבות RNA הזחל בחיפושית האדומה הקמח,<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

Production of Double-stranded DNA Ministrings

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ministrings possess a heightened safety profile and also efficiently deliver DNA cargo to targeted cells. Conventional DNA vectors carry undesirable prokaryotic sequences, including antibiotic resistance genes, CpG motifs, and bacterial origins of replication, which may lead to the stimulation of host immunological responses. The bioavailability of conventional DNA vectors is also compromised due to their larger molecular size. Their circular nature may also impart chromosomal integration, leading to insertional mutagenesis.
Bacterial sequences are excised from DNA minivectors, leaving only the gene of interest (GOI) and necessary eukaryotic expression elements. Our LCC DNA minivectors, or DNA ministrings, are devoid of immunogenic bacterial sequences; therefore improving their bioavailability and GOI expression. In the event of vector integration into the chromosome, the LCC DNA ministring will lethally disrupt the host chromosome, thereby removing the potentially dangerous mutant from the proliferating cell population. Consequently, DNA ministrings offer the benefits of &#39;minicircle&#39; DNA while eliminating the potential for undesirable vector integration events. In comparison to conventional plasmids and their isogenic circular covalently closed (CCC) counterparts, DNA ministrings demonstrate superior bioavailability, transfection efficiency, and cytoplasmic kinetics - they thus require lower amounts of cationic surfactants for effective transfection of target cells.
We have constructed a one-step inducible in vivo system for the production of DNA ministrings in Escherichia coli that is simple to use, rapid, and scalable.

The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.

הפקה של DNA פעמיים תקועים Ministrings

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

זיהוי של חלבונים קושרי RNA על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; RNA הנפתח ב adipocyte תרבות

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

שימוש מעשי של RNA הפרעה: משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA ב ליפוזום ספקים עבור ג ' וקים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

דור מצע לEndonucleases של מערכות CRISPR / קאש

באמצעות אסטרטגית האכלת התערבות RNA בתיווך למסך לגנים מעורבים בויסות משקל גוף בנמטודות

דלדול של רנ"א ריבוזומלי לMetagenomic גוט יתוש RNA-seq

RNA Catalyst ככתב להקרנת סמים נגד RNA עריכה בtrypanosomes

התערבות RNA הזחל בחיפושית האדומה הקמח,

הפקה של DNA פעמיים תקועים Ministrings

זיהוי של חלבונים קושרי RNA על ידי

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome