המחברים רוצה להודות פוסי ג'יימס על עבודתו מעולה על כל צילום וידאו ועיבוד וידאו; מייקל מרטי עבור עבודתו מעולה דור של בקר דיגיטלי תמונות; ליליה וולתר עזרה עם החילוץ-RNA ו- Bioanalyzer פועל; מיטש פאלמר, קארלי Kanipe סקירה מועילה, משוב על הצומת לימפה תמונות; טיפול בבעלי חיים ואת צוות וטרינרי המרכז הלאומי למחלות בעלי חיים על כל העבודה הקשה שלהם, סיוע עם גידול בעלי חיים והכנה necropsies.

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף. כל מחקר ממומן בכספים מגזר של החקלאות האמריקאי, שירות המחקר החקלאי. כל ההפניות מוצרים ספציפיים הינם מסופקים לצורך הפארמצבטית ניסיוני, לא מייצגות שום חסות של מוצרים אלה על ידי הממשל הפדרלי.

הרוב המכריע של מחקרים transcriptomic והפרוטוקולים המשויכים מתמקדים עכבר, חולדה או פוסט-מורטם דגימות אנושי. עם זאת, חקירות חיות המשק וחיות מספקים מגוון רחב של הזדמנויות עבור האפיון של התגובה החיסונית מחלה, הן לפי הצורך רפואה וטרינרית ו, לגבי מחלות שפוגעות, לבריאות הציבור האדם. פרוטוקול זה סיפק מית...

ניתוח ה-RNA-רצף של transcriptome של בלוטות הלימפה מספק את ההזדמנות כדי לאפיין את התגובה החיסונית של חיות למגוון של פתוגנים. אמנם יש כבר מנוצל מתודולוגיה זו בהרחבה בעכברים, ניתוח הרחבת לאחרונה לתוך יונקים גדולים1,2. משק חי/גדולים בעלי חיים בלוטות הלימפה יכול לשמש כדי לאפיין תגובות המארח, זיהום, לא רק לשימוש שלהם חיסון או רגישות גנטית מחקרים, לצורך זיהוי מטרות עבור פיתוח התרופה, אלא גם דגם מערכות עבור מחקרים בבני אדם על מחלות שפוגעות. לדוגמה, במקרה של ברוצלוזיס (מחלה חיידקית שפוגעות כי ההשפעות חצי מיליון אנשים ברחבי העולם בכל שנה), למרות גדל באופן משמעותי בעלויות, לימודי כבשים או עיזים שהן יותר רלוונטיות הדבקת בני אדם, החיסון האנושית פיתוח מודלים חיות מעבדה. העכבר זיהום מודלים מסכם את הדברים הזיהום מערכת reticuloendothelial אבל לא את הסימנים הקליניים האופייניים3.
בניסויים בבעלי חיים גדולים לעומת מעבדה מחקרים שנעשו בבעלי חיים, התהליך של רקמות קציר בהכרח כרוך עיכוב ארוך יותר בין המתת החסד ואת האוסף רקמות, אשר מהווה אתגר פוטנציאל לשימור RNA באיכות גבוהה. RNA תקין חיוני לדור של נתונים transcriptomic רלוונטי מבחינה ביולוגית. הדור של RNA באיכות גבוהה של דגימות רקמה קריטי במיוחד ללימודי הפתוגן בעלי חיים גדולים מתבצע תוך מתקני כליאה. מחקרים כאלה הם מטבעם יותר קשה לבצע כפי שהם דורשים אישרה מתקנים, מאומנים כוח אדם אלא גם לשאת משמעותי בעלות הכספית, אשר, בהתאם לעבודה, יכול לנוע בין עשרות למאות אלפי דולרים. סוגי מחקרים אלה כרוכים גם שיתוף פעולה בין-תחומית והידע רב-תחומי להשלמת שלהם, הוספת את המורכבות שלהם. לכן, הדרכה, התפתחות, ואת הדבקות מערכת יעילה של המדגם אוסף שימור מספק יתרונות משמעותיים במחקרים מולקולריים במורד הזרם של רקמות של חיות נגועות.
האוסף של בלוטות הלימפה גדול מציג אתגרים נוספים עבור אוסף רקמה לעומת דגימה דומה מאתר בלוטות הלימפה. ההכנה הכריתה מדגם מחייבת הבנה בסיסית של האנטומיה של הצומת לימפה, לרבות המבנים הפנימיים הרלוונטיים. המבנה של הלימפה מורכבת של האוניות הלימפה מוקף הסינוסים מלא הלימפה. מבנים אלה מוקפים בתוך כמוסה קשה, סיביים. 4 lobule הלימפה "אנטומי פונקציונלי היחידה הבסיסית של הצומת לימפה", מורכב זקיקי, יחידת עמוק בקליפת המוח, ואת מיתרי מדולרי הסינוסים4 (איור 1 א'). B ו- T לימפוציטים הם ביתו זקיקי ויחידות עמוק בקליפת המוח, בהתאמה. מבנים אלה מספקים לפיגום תלת-ממד, להקל על האינטראקציה בין לימפוציטים וגם אנטיגן או אנטיגן הצגת תאים.
רווחתה, זקיקי ויחידות עמוק בקליפת המוח ניתן לזהות במשטח לחתוך כפי שהם מכילים meshwork רשתי צפופה מופיעים יותר הסינוסים, המורכב מעובדים meshwork רשתי עדין יותר ואשר נראה בהיר יותר כהה (איור 1B). לפי המוסכמות, פתולוגים להפנות האזורים של בלוטות הלימפה כמו קליפת שטחית (זקיקים), את paracortex (יחידות עמוק בקליפת המוח) לשד (מיתרי מדולרי, הסינוסים). בדיקה נכונה של כל שלושה אזורים שסברו הטובה ביותר תרגול בהנחיות שגרתית פתולוגיים הלימפה5. שימו לב כי יש וריאציה ניכר עקביות, גודל וצבע של בלוטות הלימפה, אפילו בתוך חיים בודד. כמו בעלי חיים גיל, בלוטות הלימפה שלהם נוטים להקטין את גודל להיות מוצק יותר מאלה של חיים צעירים, בדרך כלל עקב גידול רקמות החיבור שלהם וירידה רגיל הלימפה מבנה6,7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig1.jpg"> איור 1. אנטומיה של הצומת לימפה. (א) תמונה קריקטורה זו מראה את האנטומיה של הצומת לימפה, המתארים מבנים מרכזיים. (B) תמונה זו עדיין מציגה לימפה שור חותכים חתך הרוחב. המבנים/השכבות הרלוונטיות הגלויים לעין מודגשים. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57195/57195fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
בהתאם השאלה ניסיוני, הלימפה שונים יהיה עניין עבור איסוף וניתוח. בלוטות הלימפה ההיקפית הם אלה נמצא עמוק בתוך הרקמה התת עורית. הבקר, בלוטות הלימפה היקפי או שטחי משמש לעתים קרובות באימון קליניים וניסויים לכלול הפרוטיד, submandibular, retropharyngeal, prescapular, prefemoral (precrural), שטחי במפשעה (supramammary אצל נקבות, האשכים אצל זכרים) ( איור 2). טבלה 1, מאפייני מפתח בלוטות הלימפה שטחית, כמתואר ב- במערכת ' בקר '8, מתוארים. להלן, כמה תוכניות אוסף הצומת לימפה פוטנציאל למחלות זיהומיות חיידקים של הבקר מוצגים כנקודת התחלה עבור החקירה.
Melitensis abortus/Brucella brucella: תקן necropsies עבור abortus דרב-נגוע בקר ו melitensis דרב-עזים נגוע במרכז הלאומי חיה המחלה לשחזר supramammary, prescapular, רקמות parotid בלוטת לימפה , הן של שיוף שהספירה חיידקי ועל ההכנה RNA פרופיל ביטוי מארח ה-RNA. Abortus דרב ניתן לשחזר באופן קבוע בכל אחד מאותם בלוטות הלימפה בקר נגוע השפעול9. הנוכחות של חיידקים בכל אחד מסוגי הלימפה ניתן להבחין ב- melitensisבנגוע עזים עד לפחות תשעה חודשים לאחר הפגיעה באמצעות למתודולוגיות מבוססי ה-RNA ממחקרים שלנו (Boggiatto. et al., לא פורסם). סלמונלה sp.: prescapular, subiliac (prefemoral), ואת בלוטות לימפה mesenteric היו שימושיים במהלך יצירת פרופילים של פגרי הבקר סלמונלה השכיחות10,11,12 , יהיה עניין פוטנציאלי ללימודי transcriptomic. E. coli O157:H7: בלוטות לימפה mesenteric (-המעי הדק האמצעית והמיקומים המעי הדק הדיסטלי) יכול להיות האתרים של שחזור של פה ושם של חיידקים עגלים הנגוע (אך לא נגוע הבקר מבוגרים)13. לפטוספירוזיס (Leptospira sp.): התמדה כרונית של החיידקים נצפתה בקשרי הלימפה ניקוז בלוטת חלב14. Mycobacterium חיידקי סטרפטקוקוס בוביס : בבקר, החיידק כבר התאושש זיהום שלאחר ניסיוני של בלוטות הלימפה mediastinal, tracheobronchial של עגלים15. בנוסף, הצומת לימפה RNA יש כבר מנוצל כדי לבחון תגובות לארח בעלי חיים גדולים וירוסים, כגון וירוס חזירי תסמונת הרבייה, מערכת הנשימה2. איור 2 מציג את המיקום של קבוצת משנה של אלה הלימפה העיקרי בגוף הבקר.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig2.jpg"> איור 2: קריקטורה המתארים במיקומים שנבחרו הלימפה בבית השחי הצומת פרות, המטופחות . בלוטות הלימפה ממוספרת הם מבואר. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57195/57195fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
נייר זה ווידאו משויך, אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד של גדול הלימפה חיה ללימודים RNA, תוכנן להיות אינפורמטיבי עבור פיצחו המעורבים במחקרים transcriptomic של זיהומים בעלי חיים גדולים. ראשית, אנו מספקים סקירה של ההליך בידוד בלוטות הלימפה, באמצעות דגימת רקמות שור, ביזון כדוגמאות. מזווג עם ההדגמה, כפי שהוא מוצג בסרט, הוא זרימת עבודה עבור דגימה רקמה לשחזור לבידוד RNA. בשלב הבא, אנו מתארים שיקולים חשובים עיבוד של הצומת לימפה נגועות, עם דגש על בטיחות, עקביות ואיכות RNA.
הכנת RNA מתוך הרקמה עם ריאגנט isothiocyanate פנול acidified-guanidine מבוסס על השיטה המקורית של Chomczynski וסאקי16,17, בטהרה על-מבוססות-סיליקה ספין עמודות רכוש סוכני chaotropic בהתבסס על העבודה המקורית של Vogelstein ו גילספי18. אנו בוחנים גם את הפוטנציאל ההתאוששות של RNA עבור transcriptomics מן הבקר הלימפה שנשמרו על-ידי שיטות אלטרנטיביות. לבסוף, אנו חוקרים את ההשפעה של המשתנה פעם על איכות ה-RNA ב necropsies בעלי חיים גדולים, כולל ניסוי נציג המתארים את ההשפעה של עלייה זמן בין המתת החסד הדגימה על הפרופיל RNA התאושש מן ביזון, . בלוטות לימפה שור מאמר זה יהיה מועיל לא רק פיצחו אלא גם ל וטרינרי חוקרים מתחיל transcriptomic מחקרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1239px;" width="1240">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">AM7020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable scalpels</td>
			<td style="width:167px;">Daigger Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EF7281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue forceps, rat tooth</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-460-117</td>
			<td>Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 mm punch biopsy needles</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9949469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sharps container (small and transportable for necropsy)</td>
			<td style="width:167px;">Stericycle</td>
			<td style="width:119px;">8900SA</td>
			<td>1 qt. size shown here</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cutting boards or disposable trays</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-002-24A</td>
			<td>Available in a variety of sizes, depends on user preference</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Personal protective equipment</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12183018A</td>
			<td>Designed for up to 100 mg tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% Ethanol (200 proof for molecular biology)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments)</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose (General, for gel electrophoresis)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">1X TBE</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP24301</td>
			<td>Can also make from scratch in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Deionized formamide</td>
			<td style="width:167px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">S4117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">114391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Xylene cyanol&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols)</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:787px;">FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue)</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">AM1975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Plastic spreader (L-shaped spreader)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-665-231</td>
			<td>Only needed for sterility testing for samples from infected animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:787px;">Necropsy knives</td>
			<td style="width:167px;">Livestock Concepts</td>
			<td style="width:119px;">WI-0009209</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection and processing of lymph nodes from large animals for rna analysis: preparing for lymph node transcriptomic studies of large animal species

חיות גדולות (הן חיות המשק וחיות) לשמש חשוב מאגרים של גורמי מחלה נגיפית, לרבות Brucella, חיידקי סטרפטקוקוס בוביס Mycobacterium, סלמונלהו- e. coli, והם שימושיים ללימוד פתוגנזה ו/או התפשטות החיידק ב hosts טבעי. כאשר פונקציית מפתח של בלוטות הלימפה בתגובה החיסונית המארח, רקמות לימפה לשמש מקור פוטנציאלי של RNA עבור ניתוחים transcriptomic במורד הזרם, כדי להעריך את השינויים הטמפורלי של ביטוי גנים בתאים במהלך זיהום. מאמר זה מציג סקירה של התהליך של הצומת לימפה אוסף דגימה רקמה, RNA במורד הזרם עיבוד במשק, באמצעות בקר (פרות, המטופחות) כמודל, עם דוגמאות נוספות מסופקים של ביזון אמריקאי (ביזון ביזון ). הפרוטוקול כולל מידע אודות מיקום, זיהוי, הסרה של בלוטות הלימפה מאתרים מרכזיים מרובים בגוף. בנוסף, מתודולוגיה דגימה ביופסיה מוצג המאפשר עקביות הדיגום מעבר בעלי חיים מרובים. מספר שיקולים לשימור הדגימה הנזכרים, כולל הדור של RNA מתאים מתודולוגיות במורד הזרם כמו רצפי RNA ו- RT-PCR. בשל עיכובים ממושכים הטמונה גדולים בעלי חיים לעומת העכבר פעם קורס לימודי, מוצגים תוצאות נציג ביזון ורקמות הלימפה שור כדי לתאר את מהלך הזמן השפלה בסוג זה רקמות, בהקשר של סקירה של עבודה מתודולוגי קודמות ב- RNA השפלה ברקמות אחרות. בסך הכל, פרוטוקול זה יהיה מועיל שני חוקרים וטרינרי מתחיל transcriptome פרויקטים על דגימות בעלי חיים גדולים, פיצחו המעוניינים ללמוד טכניקות ויוו רקמות דגימה ועיבוד במבחנה .

השימוש של השיקולים שהוצגו במאמר זה (שלבים 1-4 לפרוטוקול) יסייעו בשחזור של RNA מדגימות חיות גדולות מתאים ניתוח במורד הזרם במחקרים ביטוי גנים המארח. איכות ה-RNA ליישומים במורד הזרם מוערך על ידי אמצעים סטנדרטיים מרובים. עבור ספקטרופוטומטר, היחס280 A /A260מספק מדד לזיהום חלבון, היחס230...

Watch this Scientific Journal Video about Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species at JoVE.

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

איסוף ועיבוד של בלוטות הלימפה של חיות גדולות לניתוח RNA: הכנת ללימודי Transcriptomic הלימפה של מיני בעלי חיים גדולים

פרוטוקול זה מספק סקירה של נוהלי בידוד של RNA עבור פרופיל transcriptomic של הצומת לימפה רקמות חיות גדולות, כולל צעדים זיהוי, כריתה של בלוטות הלימפה של חיות המשק וחיות, דגימה גישות כדי לספק עקביות על-פני מספר בעלי חיים, שיקולים בתוספת תוצאות נציג פוסט אוסף שימור ועיבוד לניתוח RNA.

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

collection-processing-lymph-nodes-from-large-animals-for-rna-analysis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

26.1K Views.  U.S. Department of Agriculture. פרוטוקול זה מספק סקירה של נוהלי בידוד של RNA עבור פרופיל transcriptomic של הצומת לימפה רקמות חיות גדולות, כולל צעדים זיהוי, כריתה של בלוטות הלימפה של חיות המשק וחיות, דגימה גישות כדי לספק עקביות על-פני מספר בעלי חיים, שיקולים בתוספת תוצאות נציג פוסט אוסף שימור ועיבוד לנית...

Video: Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

מיקרוסקופית Intravital של הצומת לימפה מפשעתי

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

לא ניתוחי Intratracheal החדרה של עכברים עם ניתוח ריאות וניקוז ריאות בלוטות הלימפה על ידי זרימת cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex vivo הדמיה של תאים T ב Slices צומת Murine לימפה עם widefield ו מיקרוסקופים confocal

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

צומת Murine שטחית לימפה ניתוח

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Intravital הדמיה של בלוטות לימפה popliteal עכבר

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

ניתוח של נזק אפיתל הופק על ידי<em&gt; Histolytica Entamoeba</em&gt; זיהום

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

This article provides detailed methodology to identify and quantify functional T lymphocyte subsets present within murine kidney, aorta and lymph nodes by intracellular staining and flow cytometry. The model of angiotensin II induced hypertension was chosen to explain, step-by-step, the procedures and fundamental principles of flow cytometry and intracellular staining.

תאיים מכתים cytometry זרימה לזהות לימפוציטים קבוצות משנה בתוך Murine אבי העורקים, כליות בלוטות לימפה מודל של יתר לחץ דם

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

איסוף ועיבוד של בלוטות הלימפה של חיות גדולות לניתוח RNA: הכנת ללימודי Transcriptomic הלימפה של מיני בעלי חיים גדולים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video