Name: combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in drosophila
Uploaded: 2018-04-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila at JoVE.com

עבודה זו נתמך בחלקה על ידי הלאומי בסיסי מחקר תוכנית של סין (2012CB825504), הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (91232720 ו- 9163210042), האקדמיה הסינית של מדעי (CA) (GJHZ201302 ו- QYZDY-דר-מז-SMC015), ב"אהבה תוכנית קרן (OPP1119434), ו- 100-כשרונות של רשויות אישורים כדי ז'ו י'.

1. הכנת החדר האכלה
הערה: תא האכלה עבור תיוג לצבוע assay האכלה מורכב משני חלקים: המיכל החיצוני (בתור כיסוי), הבתוך מיכל (כמקור מזון).
<ol><li>לשנות את המיכל החיצוני מ בקבוקון זכוכית עבור culturing דרוזופילה (קוטר פנימי של 31.8 מ מ), בגובה של 80 מ"מ (איור 1 א', 1 ג'). כיסוי בתחתית המיכל עם שכבה של 1% agarose (5 מ"ל) כדי לשמור את ההגדרה האכלה כראוי humidified ולשמש מצע רך לזבובים לדרוך (איור 1B). המיכל ובכך מספק סביבה מבוקרת אבל נטורליסטי נושא עם לחץ מינימלי או הפרעה לזבובים.<ol>
<li>להכין את המיכל החיצוני. להשעות 0.5 גר' agarose ב 50 מ של מים מזוקקים כפול, חום עם עצבנות תכופים, והרתיחו להתמוסס לחלוטין על פגים עם צלחת חום.</li>
		<li>כאשר מתקרר agarose 1% עד בערך 60 ° C, להעביר 5 מ של 1% agarose ריקה מחוץ מיכל (איור 1B), ולתת המכולה תישאר פתוחה עד התקררה לטמפרטורת החדר להניב רכיב pad agarose.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין אוכל התווית על-ידי צבע. הרכב המזון התווית על-ידי צבע משתנה בהתאם לתכלית ניסיוני. הנה דוגמה של הכנת האוכל התווית על-ידי צבע המכיל רק סוכרוז.<ol>
<li>להוסיף 0.5 גר' agarose 50 מ של מים מזוקקים כפול, חום עם עצבנות תכופים, והרתיחו להתמוסס לחלוטין על פגים עם צלחת חום.</li>
		<li>כאשר agarose 1% מעל מתקררת כ 60 מעלות, להוסיף agarose כדי להשיג 100 מ מ סוכרוז 1.71 גר' סוכרוז.</li>
		<li>להוסיף 0.25 g של צבע כחול (erioglaucine ניתרן) הפתרון agarose להצטייד במזון התווית על-ידי צבע 0.5% (w/v).</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין הבתוך המיכל. לשים את רוקן במכלים על משטח אופקי שטוח, ואז מוסיפים 750 µL של מזון התווית על-ידי צבע כחול מיכל מזון בודד, עזוב את זה לחזק לפחות 5 דקות. הערה: הבתוך מיכל הוא מאכל פלסטיק קטן עם קוטר פנימי של 13.6 מ מ, בגובה של 7.5 מ"מ (איור 1 א', 1 ג). זה הוא מלא באוכל התווית על-ידי צבע ולאחר מכן ימוקם במרכז משטח agarose של המיכל החיצוני.</li>
	<li>העברה של מילוי בתוך מיכל לתוך מיכל בחוץ מוכן ומקם אותה במרכז משטח agarose. תן את תאי האכלה שפתוחים בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות עד הקיר של המיכל החיצוני ללא עיבוי. הערה: הקיר היבש יש צורך למנוע את הזבובים להיות תקוע על גבי הקיר על ידי פנייה ישירה טיפות מים.</li>
	<li>להכין תאי האכלה עם אוכל ללא צבע (קומפוזיציה זהה אבל בלי לצבוע) על רקע חיסור.</li>
</ol>2. הכנת זבובים
הערה: נקבה בוגרת טסה 5-10 יום לאחר וגיחתו משמשים בדרך כלל עבור מבחני האכלה. מומלץ להכין את הזבובים של אחרים שונים, כולל פקדי גנטי, וכדי לבדוק במקביל. זבובים 20 (מתוך תא האכלה אחת) ליצור נקודת נתונים אחת.
<ol><li>קח בחשבון את צפיפות האוכלוסייה לגידול הזבוב הבוגר. בדרך כלל, שליטה בצפיפות האוכלוסין על ידי שינוי מספר הורים זבובים לפי הזנים וממדים בקבוקי תרבות. לדוגמה, להעביר בקבוק תרבות עם (קוטר של 31.8 מ מ), בגובה של 80 מ מ 15 זכרים ונקבות 30 של קנטון-S ותנו הנקבות להטיל ביצים במשך יום אחד ואז הסר שהמבוגר זבובים.</li>
	<li>היכונו זבובים להפעלה thermogenetic.<ol>
<li>השתמש את מערכת Gal4/UAS38 לבטא dTRPA133 נוירונים שונים על ידי מעבר ש-UAS-dTrpA1 טס עם קווים נהג GAL4 שונים (איור 2B).</li>
		<li>לשמור את הזבובים הבוגרים על מזון רגיל 22 ° C 60% לחות יחסית, מחזור בהירה-כהה 12 h/12 שעות.</li>
		<li>יומיים לפני ההזנה assay, למיין, לאסוף זבובים על CO2 לעוף משטח במיקרוסקופ סטריאו לתוך בקבוקון מזון טרי, לשמור על צפיפות של 20 זבובים לכל מבחנה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>היכונו זבובים להפעלה optogenetic.<ol>
<li>השתמש את מערכת Gal4/UAS38 כדי לבטא CsChrimson36 בנוירונים שונים על ידי מעבר זבובים UAS-CsChrimson עם קווים שונים של מנהל ההתקן GAL4.</li>
		<li>לאחרונה לאסוף זבובים eclosed (תוך 24 שעות) ולהעביר אותם לתוך בקבוקון עם תקן מזון המכיל 400 מיקרומטר כל-טרנס-רשתית.</li>
		<li>כדי למנוע הפעלה מוקדמת, לעטוף את הבקבוקונים rearing ברדיד אלומיניום ושמת אותם לתוך תיבת כהה להגן על זבובים גירוי אור לא רצויים. שמור את הזבובים 25 ° c, 60% לחות בחושך 4-6 ימים.</li>
		<li>יומיים לפני ההאכלה וזמינותו, מיון הנקבה טסה על משטח לעוף2 CO תחת מיקרוסקופ סטריאו. לאסוף זבובים 20 לתוך המבחנה ממזון אחד ולשמור אותם בחושך לפני הבדיקה האכלה.</li>
		<li>לנהל את כל הפעולות תחת אור עמום במהירות האפשרית כדי למנוע את ההשפעות שנגרמו על ידי אור מקיף. השתמש מנורת LED ממוקמים רחוק מאזור העבודה, העוצמה באזור העבודה µW/ס מ 52. הערה: שימוש ברעב קנטון-S זבובים כפקד חיובי עבור וזמינותו האכלה. לשלול את היתושים הללו של מזון ולשמור על agarose 1% במשך 24 שעות לפני הבדיקה האכלה. הרמות של צריכת מזון של הזבובים האלה לעזור להעריך את תנודות היומיומית.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הפעלת thermogenetic
<ol><li>לערוך ניסויים האכלה כל באותו זמן של היום סביב Zeitgeber זמן 4-631,32, כדי למזער את הווריאציות עקב השעון הביולוגי.</li>
	<li>להכין אינקובטור (או חדר קטן עם תנור מבוקרי טמפרטורה) כמו הסביבה חימום.</li>
	<li>לפני ניסויים התנהגותיים, equilibrate את תאי האכלה מוכן בטמפרטורה ניסיוני (30 ° C) במשך שעתיים להבטיח הטמפרטורה היחסית המדים בבית הבליעה האכלה.</li>
	<li>כדי להתחיל את תהליך ההזנה, בזהירות להעביר זבובים 20 מ שלהם המבחנה הביתה לתא האכלה preheated על-ידי הקשה עדין. להמשיך בתהליך ההאכלה ב 30 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ( איור 3 א) . הערה: המחאות כנגד תכופים שפת ההינדי, כגון פותחים וסוגרים את הדלת חממה, להשפיע לרעה על ההתנהגות האכלה, וכך צריך להיות ממוזער.</li>
	<li>הפסקת האכלה ב 60 דקות על ידי הקפאת את תאי האכלה ב- 80 ° C (או-20 ° C) במשך 30 דקות. הערה: הקפאה מסייעת לעצור בפטריה בלשכה כל בו זמנית. הקפאת זבובים ב-80 מעלות צלזיוס משמשת לשתי מטרות, המתות חסד הזבובים ועל אחסון עד המגון עד לשבוע אחד.</li>
	<li>עבור קבוצת בקרת טמפרטורה, העברת הזבובים 20 לתוך טמפרטורת החדר. האכלה קאמרית עם אוכל לצבוע בצבע כדי להתחיל את תהליך ההזנה ב 22 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.</li>
	<li>הפסקת האכלה של קבוצת בקרת טמפרטורה על ידי הקפאת התאים ב- 80 ° C (או-20 ° C) במשך 30 דקות.</li>
</ol>4. Optogenetic הפעלה
<ol><li>לערוך ניסויים האכלה כל באותו זמן של היום סביב Zeitgeber זמן 4-631,32, כדי למזער את הווריאציות עקב השעון הביולוגי.</li>
	<li>בזהירות להעביר זבובים 20 בקבוקון אחד לתא הזנה על-ידי הקשה עדין ולאחר מכן שים תא לצדדים על הכיוונון תאורה (איור 4A, 4B).<ol>
<li>Optogenetic תמרון, משתמשים במערך של נוריות כתום (607 ננומטר) כמקור של גירוי האור, תיקון לוח פלקסיגלס אופקי מעל נוריות לתמוך ההזנה צ'יימברס בזמן תאורה. שמור את ההתקנה בתוך אינקובטור 25 ° c עם 60% לחות (איור 4A, 4B).</li>
		<li>לעורר את הזבובים הבקרה הגנטית במקביל של טאוטי > CsChrimson זבובים, אך שונים האכלה צ'יימברס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>המשך תהליך ההזנה עבור 60 דקות עם תאורה האחורי על ידי אור הכתום.<ol>
<li>לקבוע את עוצמות תאורה אופטימלית עבור optogenetics השפעול36. עבור של טאוטי > CsChrimson זבובים, עוצמה של 2.2 מ"מ/mW2 גורם לשיתוק (הפסקת ומכניקה) ואובדן שליטה בתנוחה, לכן, להשתמש עוצמה ביניים של 0.1 מ"מ/mW2 כדי לגרות את של טאוטי > CsChrimson עף במהלך הבחינה האכלה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפסקת ההזנה על ידי הקפאת תאי האכלה ב- 80 ° C (או-20 ° C) במשך 30 דקות.</li>
</ol>5. חזותי הערכה של צריכת מזון
הערה: הגישה הבקיע החזותי מספק של הערכה כמותית למחצה של מזון consumptions. למרות שהוא לא הכי אובייקטיבי כשיטת אופטי, שיטה זו מאפשרת לעבור דרך מספר רב של זנים לטוס במועד, הופכים אותו למתאים לשימוש הראשון עגול של מסך גנטית כדי לצמצם במהירות את רשימת המועמדים לבדיקות נוספות.
<ol><li>לאחר תהליך ההאכלה, עזים ומתנגד, ציון הזבוב על מפקד פד לעוף2 תחת מיקרוסקופ סטריאו. לתת ניקוד בודדים כל זבוב בהתבסס על נפח עוצמת בצבע צבען אוכל בבטן שלה (איור 2 א). הערה: קריטריונים להערכת חזותי: מערכת ניקוד יש 4 רמות של צריכת המזון המתאים אמצעי אחסון שונים ועוצמות של האוכל צבעוניים על הבטן.<ol>
<li>הציון לא טס בלי אוכל לצבוע בצבע לזיהוי ציון 0; תן אותם עם צבע כחול (בקושי לזיהוי) חלש או באוכל לצבוע בצבע שיתפסו פחות משליש אמצעי האחסון של הבטן ציון של 1.</li>
		<li>הציון טסה עם אוכל לצבוע בצבע עז כובשת מחצית אחת של הבטן ציון של 2.</li>
		<li>ציון אלה עם אינטנסיבי צבוע תוכן כובש יותר ממחצית הבטן ציון של 3 (איור 2 א).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחשב את הפרופורציה של זבובים עם ציונים שונים לכל תנאי הניסוי (איור 2B).</li>
</ol>6. ערכי צבע מוחלטים כימות של צריכת מזון
<ol><li>לאחר הפסקת האכלה, שופכים זבובים 20 כל הנקה קאמרית על חתיכת נייר במשקל ולאחר מכן להעביר אותם לתוך צינור 1.5 mL בעזרת מברשת רכה. הערה: לא לקחת את כל התאים מהאחסון-80 ° C במקביל כדי למנוע זבובים נצמדים לקיר קאמרית בגלל עיבוי מים על תא קר.</li>
	<li>להוסיף 500 µL של PBST הצינור, homogenize את הזבובים באמצעות מפעל שחיקה בתדר 60hz עבור 5 s.<ol>
<li>לאשר המגון מספיק על ידי תצפית כאשר אין שברי לזיהוי של חלקי גוף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לסובב את הצינורות עם homogenates למשך 30 דקות-13,000 סל ד כדי לנקות את הלכלוך.</li>
	<li>לאחר צנטריפוגה, להעביר µL 100 של תגובת שיקוע טוב של צלחת 96-ובכן.</li>
	<li>לאחר כל דוגמאות נטענים, לשים את הצלחת לקורא צלחת כדי למדוד את ספיגת של הדגימות-630 ננומטר.</li>
	<li>כדי להסיר את ספיגת רקע, להפחית את ספיגת של supernatants מהזבובים מוזן על אוכל בלי לצבוע ספיגת של תגובת שיקוע של הזבובים מזון-fed כחול. הערה: שלב זה הוא אופציונלי, בהתאם הקומפוזיציות של האוכל. מתי אוכל לעוף (בלי לצבוע) יוצר ספיגת-630 ננומטר, יש צורך לבצע שלב זה לחסל את הרקע.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gao, Q., Horvath, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+feeding+and+energy+expenditure.">Neurobiology of feeding and energy expenditure.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).</li><li>Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+amino+acids+in+a+dopaminergic+circuitry+promotes+rejection+of+an+incomplete+diet+in+Drosophila.">Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila.</a> Cell. 156 (3), 510-521 (2014).</li><li>Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+feeding+behavior+in+adult+Drosophila+melanogaster+varies+with+feeding+regime+and+nutritional+state.">Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state.</a> J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).</li><li>Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fructose+receptor+functions+as+a+nutrient+sensor+in+the+Drosophila+brain.">A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain.</a> Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).</li><li>Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+control+of+food+intake+and+body+weight.">Central nervous system control of food intake and body weight.</a> Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).</li><li>Pool, A. H., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+regulation+in+Drosophila.">Feeding regulation in Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).</li><li>Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-Producing+Cells+in+the+Drosophila+Brain+also+Express+Satiety-Inducing+Cholecystokinin-Like+Peptide,+Drosulfakinin.">Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109 (2012).</li><li>Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+taste+and+calorie+sensing+in+Drosophila.">Integration of taste and calorie sensing in Drosophila.</a> J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).</li><li>Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hunger-driven+behaviors+by+neural+ribosomal+S6+kinase+in+Drosophila.">Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).</li><li>Itskov, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+monitoring+and+quantitative+analysis+of+feeding+behaviour+in+Drosophila.">Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila.</a> Nat Commun. 5, 4560 (2014).</li><li>Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calories+do+not+explain+extension+of+life+span+by+dietary+restriction+in+Drosophila.">Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila.</a> PLoS Biol. 3 (7), e223 (2005).</li><li>Diegelmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CApillary+FEeder+Assay+Measures+Food+Intake+in+Drosophila+melanogaster.">The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (121), (2017).</li><li>Ja, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prandiology+of+Drosophila+and+the+CAFE+assay.">Prandiology of Drosophila and the CAFE assay.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).</li><li>Shiraiwa, T., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proboscis+extension+response+(PER)+assay+in+Drosophila.">Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila.</a> J Vis Exp. (3), e193 (2007).</li><li>Qi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+feeding+assay+in+adult+Drosophila+reveals+rapid+modulation+of+food+ingestion+by+its+nutritional+value.">A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value.</a> Mol Brain. 8, 87 (2015).</li><li>Ja, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water-+and+nutrient-dependent+effects+of+dietary+restriction+on+Drosophila+lifespan.">Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).</li><li>Deshpande, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Drosophila+food+intake:+comparative+analysis+of+current+methodology.">Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology.</a> Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).</li><li>Deshpande, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+Food+pH+Increases+Palatability+and+Consumption+and+Extends+Drosophila+Lifespan.">Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan.</a> J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).</li><li>Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste-independent+detection+of+the+caloric+content+of+sugar+in+Drosophila.">Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).</li><li>Shen, P., Cai, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuropeptide+F+mediates+integration+of+chemosensory+stimulation+and+conditioning+of+the+nervous+system+by+food.">Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food.</a> J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octopamine+mediates+starvation-induced+hyperactivity+in+adult+Drosophila.">Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).</li><li>Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurogenetics+of+group+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster.</a> J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).</li><li>Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanosensory+receptor+required+for+food+texture+detection+in+Drosophila.">A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila.</a> Nat Commun. 8, 14192 (2017).</li><li>Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taotie+neurons+regulate+appetite+in+Drosophila.">Taotie neurons regulate appetite in Drosophila.</a> Nat Commun. 7, 13633 (2016).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+starvation-induced+hyperactivity+by+insulin+and+glucagon+signaling+in+adult+Drosophila.">Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Wood, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirtuin+activators+mimic+caloric+restriction+and+delay+ageing+in+metazoans.">Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans.</a> Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).</li><li>Inagaki, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Neuromodulation+In+Vivo:+TANGO-Mapping+of+Dopamine+Signaling+Reveals+Appetite+Control+of+Sugar+Sensing.">Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing.</a> Cell. 148 (3), 583-595 (2012).</li><li>Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+food+intake+in+Drosophila.">Quantification of food intake in Drosophila.</a> PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).</li><li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moonwalker+Descending+Neurons+Mediate+Visually+Evoked+Retreat+in+Drosophila.">Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila.</a> Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).</li><li>Ewing, L. S., Ewing, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Courtship+of+Drosophila+melanogaster+in+large+observation+chambers:+the+influence+of+female+reproductive+state.">Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state.</a> Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).</li><li>Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gustatory+physiology+and+appetitive+behavior+by+the+Drosophila+circadian+clock.">Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock.</a> Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).</li><li>Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+feeding+and+metabolism+by+neuronal+and+peripheral+clocks+in+Drosophila.">Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila.</a> Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).</li><li>Hamada, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila.">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).</li><li>Viswanath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+-+Opposite+thermosensor+in+fruitfly+and+mouse.">Ion channels - Opposite thermosensor in fruitfly and mouse.</a> Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+starvation-induced+hyperactivity+by+insulin+and+glucagon+signaling+in+adult+Drosophila.">Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Viswanath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+thermosensor+in+fruitfly+and+mouse.">Opposite thermosensor in fruitfly and mouse.</a> Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene-Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes.">Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+short+neuropeptide+F+regulates+food+intake+and+body+size.">Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size.</a> J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).</li><li>Marella, S., Mann, K., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+Modulation+of+Sucrose+Acceptance+Behavior+in+Drosophila.">Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila.</a> Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).</li><li>Albin, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Subset+of+Serotonergic+Neurons+Evokes+Hunger+in+Adult+Drosophila.">A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila.</a> Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).</li><li>Ro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+signaling+mediates+protein+valuation+and+aging.">Serotonin signaling mediates protein valuation and aging.</a> eLife. 5, e16843 (2016).</li></ol>

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

דו ח זה יעסוק על תהליך טכני של תיוג לצבוע מבחני האכלה של צריכת מזון בהקשר של thermogenetic ושליטה optogenetic ההפעלה לתמרן נוירונים האכלה. פרוטוקול זה פשוטה ואמינה יעזור להבהיר את הפונקציה של המועמד נוירונים בהאכלה שליטה, כדי למדוד את העדפת מזון זבובים, וכדי לזהות שחקנים הרומן המעגלים שליטה האכלה באמ?...

לכימות בכמות האוכל בלע חשוב להערכת מספר היבטים של האכלה הפקדים על-ידי המוח כתגובה לאסונות לצרכים פנימיים (כגון הרעב הברית), גורמים חיצוניים (כגון איכות מזון ו palatability)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. בשנים האחרונות, המאמצים של פיענוח של סובסטרטים עצבית של האכלה שליטה בדרוזופילה להוביל להתפתחות של מבחני מרובים כדי לכמת את כמות המזון בלע במישרין לשמש בתור מדד של האכלה מוטיבציה 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
12,assay13 נימי מזין (CAFE) פותחה כדי למדוד את כמות הצריכה של מזון נוזלי ב microcapillary זכוכית. וזמינותו CAFE מאוד רגיש, לשחזור17 ומפשטת את המדידה של צריכת מזון, במיוחד עבור לכימות האכלה לטווח ארוך18. עם זאת, וזמינותו הזה דורש הזבובים לטפס אל קצה microcapillary ולהאכיל הפוך, אשר אינו מתאים עבור כל זנים. בנוסף, מפני הזבובים להיבדק באמצעות וזמינותו CAFE חייב להיות גדלו במזון נוזלי, ההשפעה של אלה תנאים על חילוף החומרים מצב או של תת-תזונה פוטנציאל לגידול נשאר להיות נחושים.
11,assay14 תגובה סיומת חוטם (פי) סופרת את התדירות של תגובות סיומת חוטם לכיוון נגיעות עדינות של המזון טיפות. לכל assay הוכיח היא דרך מצוינת כדי להעריך האכלה המוטיבציה של זבוב, ישבנים השפעת palatability ותוכן של מזון18,19. עם זאת, זה לא כימות ישירה של צריכת כמות.
לאחרונה, פותחה שיטה חצי אוטומטי, המדריך האכלה assay (MAFE)15. ב- MAFE, זבוב קיבוע אחד מוזן באופן ידני עם microcapillary המכיל מזון. בהתחשב בכך חוטם סיומת תגובות וצריכת מזון ניתן לנטר בו זמנית, MAFE מתאים הערכת הערכים התזונתיים ואת ההשפעות של טיפול תרופתי. עם זאת, שיתק זבוב עלול להשפיע לרעה על ביצועיו התנהגותית, כולל האכלה.
בנוסף, לטוס חוטם, גלאי פעילות (FlyPAD)10 פותחה באופן אוטומטי לכמת את התנהגות האכילה. באמצעות מכונת ראייה שיטות, FlyPAD רשומות האינטראקציות פיזי בין זבוב מזון כדי לכמת את התדירות והמשך של הרחבות חוטם כמחוון של האכלה מוטיבציה. FlyPAD מספק גישה תפוקה גבוהה כדי לנטר את התנהגויות האכילה של זבוב חינם-המעבר, הרגישות ואת החוסן של מערכת זו עדיין רחוק להיות מאושרות על ידי יותר מחקרים12.
אסטרטגיות תיוג משמשים לעתים קרובות כדי להעריך אוכל בליעה בזבובים. זה נפוץ כדי תווית המזון עם קליעים נותבים כימי, לאחר האכלה, למדוד את כמות בלע מעקב כדי לחשב את כמות צריכת המזון. קליעים נותבים רדיואקטיביים16,17,20,21,22,23,24,25 לאפשר איתור דרך הקוטיקולה בלי המגון של הזבובים. בשיטה זו מספק השתנות נמוך להפליא, רגישות גבוהה18, ריאלי עבור לימוד לטווח ארוך של צריכת המזון. עם זאת, הזמינות של רדיואיזוטופים שמיש, תעריפים שונים של ספיגת, והוצאת צריכים להילקח בחשבון כאשר עובדים עם זה וזמינותו.
תיוג והמעקב צריכת המזון בצבעים שאינם רעילים מזון הוא פשוטה ובטוחה אלטרנטיבית2,3,26,27,28. זבובים הם הומוגני לאחר האכלה עם מזון המכיל צבעי מסיסים ולא נספגים, ואת כמות צבע בלע זה מאוחר יותר לכמת באמצעות ספקטרופוטומטרים3,24,28,29 . אסטרטגיית תיוג הוא קל לביצוע, ומספק יעילות גבוהה, אבל עם אזהרה. הנפח של צריכת המזון מוערך מן לצבוע בלע הוא קטן יותר מאשר אמצעי האחסון בפועל כי הפרשה מתחילה מוקדם ככל 15 דקות לאחר זבובים יתחילו להיות. ניזונים17. בנוסף, וזמינותו מעריך בליעה מזון בדרך כלל תוך תקופה של 60-מין, אשר מתאים רק לחקירה לטווח קצר האכלה התנהגות24,28. יתר על כן, מספר גורמים פנימיים וחיצוניים, כגון גנוטיפ17, מגדר17, הזדווגו המדינה17, לגידול צפיפות30,31,שעון ביולוגי32ומזון איכות3 , 8 , 16, צריכת המזון השפעה. לכן, ייתכן משך ההאכלה צריך להיות מותאם על פי תנאים מסוימים ניסיוני. מלבד בהנחיה כימות של צריכת מזון וצבעי מאכל משמשים גם כדי להעריך אוכל בחירות2,19,27, וכדי להמחיש את מניסקוס ב microcapillary CAFE assay12.
כאן, אנחנו מציגים מניפולציה פרוטוקול בשילוב של פעילות. עצבית בגישה תיוג-צבע. אסטרטגיה זו כבר הוכיח שימושי במחקר שלנו neurogenetic על האכלה שליטה זבובי פירות למבוגרים24. שיטת הניקוד ויזואלי מאפשר הערכה מהירה של צריכת מזון; לפיכך, מומלץ להקרנה דרך מספר רב של זנים במועד. המועמדים מן המסך ואז מאבחנים בפירוט באמצעות שיטה ערכי צבע מוחלטים לספק אובייקטיבית, כימות מדויק במחקר נוסף.
חוץ מזה מבחני האכלה, נתאר גם thermogenetic27,33,34,35 ו- optogenetic36 שיטות בכפייה הפעלת נוירונים היעד בדרוזופילה. כדי להפעיל את הנוירונים מאת thermogenetic המבצע היא פשוטה ונוחה עם דרוזופילה ארעי קולטן פוטנציאליים Ankyrin 1 (dTRPA1), אשר הוא הקטיון טמפרטורה - ו ממותגת מתח ערוץ זה מגביר דעתנית עצביים כאשר הסביבה הטמפרטורה עולה מעל33,23 ° C37; עם זאת, בדיקות חיות בטמפרטורות גבוהות עשוי לייצר השפעות שליליות על התנהגות. גישה יעילה אחרת כדי להפעיל את הנוירונים בדרוזופילה משתמש optogenetics עם CsChrimson36, אשר הוא אדום-העביר גרסה של channelrhodopsin זה מגביר את רגישות של נוירונים לאור. Optogenetics מציע רזולוציה טמפורלית גבוהה יותר, פחות הפרעה התנהגויות מאשר thermogenetics. שילוב של מדידה כמותית של צריכת המזון עם המניפולציה של פעילות. עצבית מייצג גישה יעילה ללמוד את המנגנונים העצביים של האכלה.
נתאר בפירוט את הכנת האכלה החדר וזבובים להיבדק. באמצעות זבובים טאוטי-Gal4 כמו דגם24, אנו מתארים את הפעלת נוירונים באמצעות thermogenetics ו- optogenetics. שני מבחני של כימות של צריכת מזון עם התווית על-ידי צבע אוכל מתוארים גם בפרוטוקול.

<table><tbody><tr><td>UAS-CsChrimson</td><td>Bloomintoon</td><td>55135</td><td></td></tr><tr><td>UAS-dTrpA1</td><td>Bloomintoon</td><td>26263</td><td></td></tr><tr><td>TDC1-GAL4&amp;nbsp;</td><td>Bloomintoon</td><td>9312</td><td></td></tr><tr><td>TDC2-GAL4</td><td>Bloomintoon</td><td>9313</td><td></td></tr><tr><td>sNPF-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by Z. Zhao</td></tr><tr><td>NPF-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by Y. Rao</td></tr><tr><td>TH-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by Y. Rao</td></tr><tr><td>5-HT-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by Y. Rao</td></tr><tr><td>AKH-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by Y. Rao</td></tr><tr><td>dip2-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by Y. Rao</td></tr><tr><td>Taotie-GAL4</td><td></td><td></td><td>Provided by J. Carlson</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biowest</td><td>G-10</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Erioglaucine disodium salt</td><td>Sigma</td><td>861146</td><td></td></tr><tr><td>all-trans-retinal&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>R2500</td><td>stored in darkness</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>9002-93-01</td><td></td></tr><tr><td>Fly food</td><td></td><td>1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;1x PBS buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td>1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.24 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7.4</td><td></td></tr><tr><td>PBST buffer</td><td></td><td>1X PBS with 1% Triton X-100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Grinding mill</td><td>Shang Hai Jing Xin</td><td>Tissuelyser-24</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Ning Bo Jiang Nan</td><td>HWS-80</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer with a heat plate</td><td>Chang Zhou Bo Yuan</td><td>CJJ 78-1</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Thorlabs</td><td>CCS200/M</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence stereo microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>&amp;nbsp;M205FA</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>S6E</td><td></td></tr><tr><td>Outside container</td><td>Jiang Su Hai Men</td><td>glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension)</td><td></td></tr><tr><td>Inside container&amp;nbsp;</td><td>Beijing Yi Ran machinery factory</td><td>plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension)</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf tubes</td><td>Hai Men Ning Mong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;96 well plate</td><td>Corning Incorporated</td><td>&amp;nbsp;Costar 3599</td><td></td></tr><tr><td>LEDs</td><td>Xin Xing Yuan Guangdian</td><td>607 nm, 3W&amp;nbsp;</td><td>https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058</td></tr></tbody></table>

combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in drosophila

צריכת מזון הוא תחת שליטה הדוקה של המוח, אשר משלב את מצב פיזיולוגי, palatability ותוכן התזונתיים של המזון, וכן בעיות פקודות כדי להפעיל או להפסיק האכלה. פענוח התהליכים שבבסיס בקבלת ההחלטה של מתון האכלה נושאת השלכות עיקריים בהבנה שלנו של הפרעות פיזיולוגיות ופסיכולוגיות הקשורים האכלה שליטה ובמועד. שיטות פשוטות, כמותיים, חזקים נדרשים למדידת בליעה מזון בעלי חיים לאחר מניפולציה ניסויית, כגון בכפייה הגברת הפעילות של הנוירונים יעד מסוימים. . הנה, הצגנו מבוסס-צבען תיוג מבחני האכלה כדי להקל על המחקר neurogenetic של האכלה שליטה ב זבובי פירות למבוגרים. אנחנו סקור מבחני האכלה זמין ולאחר מכן לתאר את השיטות שלנו שלב אחר שלב מהגדרת ניתוח, המשלבים thermogenetic, optogenetic מניפולציה של נוירונים שליטה מוטיבציה האכלה עם assay צריכת מזון התווית על-ידי צבע. נדון גם את היתרונות והמגבלות של השיטות שלנו, לעומת מבחני האכלה אחרים, כדי לסייע לקוראים לבחור וזמינותו המתאים.

מסך thermogenetic.
תיאבון מוגבר באופן חריג גורמת צריכת המזון גבוהות, ללא קשר צרכים פיזיולוגיים. אנחנו מנוצל ערכה זו לעיצוב של תפוקה גבוהה מסך התנהגותית להשיג ידיות גנטי של נוירונים הקשור רעב, שבעה מצבים (איור 1). המסך הניב של טא?...

Watch this Scientific Journal Video about Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila at JoVE.com

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

מבחני צריכת המזון כמותיים באוכל צבוע לספק חזקים, תפוקה גבוהה אומר להעריך את המוטיבציה האכלה. שילוב וזמינותו צריכת מזון עם thermogenetic ו optogenetic המסכים היא גישה רב-עוצמה כדי לחקור את המעגלים העצביים שבבסיס התיאבון למבוגרים melanogaster דרוזופילה.

שילוב של צריכת המזון כמותיים מבחני והפעלת בכפייה נוירונים ללמוד תיאבון בשנת דרוזופילה

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

combining-quantitative-food-intake-assays-forcibly-activating-neurons

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Behavior

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

8.2K Views.  University of Science and Technology of China. מבחני צריכת המזון כמותיים באוכל צבוע לספק חזקים, תפוקה גבוהה אומר להעריך את המוטיבציה האכלה. שילוב וזמינותו צריכת מזון עם thermogenetic ו optogenetic המסכים היא גישה רב-עוצמה כדי לחקור את המעגלים העצביים שבבסיס התיאבון למבוגרים melanogaster דרוזופילה.

Video: Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

הקלטה בו זמנית של אותות סידן מתא עצב לזהות התנהגות האכלה של תסיסנית melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Neuroscience

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

למידה אסוציאטיבית הרחה באפטטיבית<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

יחיד לטוס Assay עבור התנהגות שיחור מזון ב<em&gt; דרוזופילה</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental factors, and the toxicological and pharmacological effects of numerous substances. Few methods currently implemented are amenable to high throughput measurement. The Microplate Feeder Assay (MFA) was developed for quantifying the consumption of liquid food for individual flies using absorbance. In this assay, flies consume liquid food medium from select wells of a 1536-well microplate. By incorporating a dilute tracer dye into the liquid food medium and loading a known volume into each well, absorbance measurements of the well acquired before and after consumption reflect the resulting change in volume (i.e., volume consumed). To enable high throughput analysis with this method, a 3D-printed coupler was designed that allows flies to be sorted individually into 96-well microplates. This device precisely orients 96- and 1536-well microplates to give each fly access to up to 4 wells for consumption, thus enabling food preference quantification in addition to regular consumption. Furthermore, the device has barrier strips that toggle between open and closed positions to allow for controlled containment and release of a column of samples at a time. This method enables high throughput measurements of consumption of aqueous solutions by many flies simultaneously. It also has the potential to be adapted to other insects and to screen consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals.

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

The microplate feeder assay offers an economical, high throughput method for quantifying liquid food consumption in Drosophila. A 3D-printed device connects a 96-well microplate in which flies are housed to a 1536-well microplate from which flies consume a feeding solution with a tracer dye. The solution volume decline is measured spectrophotometrically.

מאכיל מיקרו-תפוקה גבוהה לבדיקה לכימות הצריכה בדרוסופילה

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

דרך פשוטה למדוד שינויים בהתנהגות שוחרת זכה שימוש<em&gt; תסיסנית</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

את assay נימי מזין מודד צריכת המזון ב<em&gt; תסיסנית</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating the neuronal regulation of these behaviors is essential for the understanding of the physiological and molecular mechanisms underlying nutritional homeostasis. The use of genetically tractable animal models such as worms, flies, and fish greatly facilitates these types of studies. In the last decade, the fruit fly Drosophila melanogaster has been used as a powerful animal model by neurobiologists investigating the neuronal control of feeding and foraging behaviors. While undoubtedly valuable, most studies examine adult flies. Here, we describe a protocol that takes advantage of the simpler larval nervous system to investigate neuronal substrates controlling feeding behaviors when larvae are exposed to diets differing in their protein and carbohydrates content. Our methods are based on a quantitative colorimetric no-choice feeding assay, performed in the context of a neuronal thermogenetic-activation screen. As a read-out, the amount of food eaten by larvae over a 1 h interval was used when exposed to one of the three dye-labeled diets that differ in their protein to carbohydrates (P:C) ratios. The efficacy of this protocol is demonstrated in the context of a neurogenetic screen in larval Drosophila, by identifying candidate neuronal populations regulating the amount of food eaten in diets of different macronutrient quality. We were also able to classify and group the genotypes tested into phenotypic classes. Besides a brief review of the currently available methods in the literature, the advantages and limitations of these methods are discussed and, also, some suggestions are provided about how this protocol might be adapted to other specific experiments.

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Described here is a protocol that enables the colorimetric quantification of the amount of food eaten within a defined interval of time by Drosophila melanogaster larvae exposed to diets of different macronutrient quality. These assays are conducted in the context of a neuronal thermogenetic screen.

כימות צריכת מקרונוטריאנטים במסך עצבי תרמוגנטי באמצעות זחלי דרוזופילה

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate their food environment. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a genetically tractable model organism that is widely used to decipher the molecular, cellular, and neural underpinnings of food preference. To analyze fly food preference, a robust feeding method is needed. Described here is a two-choice feeding assay, which is rigorous, cost-saving, and fast. The assay is Petri-dish-based and involves the addition of two different foods supplemented with blue or red dye to the two halves of the dish. Then, ~70 prestarved, 2-4-day-old flies are placed in the dish and&#160;allowed to choose between blue and red foods in the dark for about 90 min. Examination of the abdomen of each fly is followed by the calculation of the preference index. In contrast to multiwell plates, each Petri dish takes only ~20 s to fill and saves time and effort. This feeding assay can be employed to quickly determine whether flies like or dislike a particular food.

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

We present a protocol for a two-choice feeding assay for flies. This feeding assay is fast and easy to run and is suitable not only for small-scale laboratory research, but also for high-throughput behavioral screens in flies.

מבחני העדפת מזון מהירה בדרוסופילה

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate ...

In Vivo Calcium Imaging of Taste-Induced Neural Responses in Adult Drosophila

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model organism, Drosophila melanogaster. A key strength of this methodology is its ability to record taste-induced neural responses in awake animals without the need for anesthesia. This approach employs binary expression systems (e.g., Gal4-UAS) to express the calcium indicator GCaMP in specific neurons of interest. This protocol describes a procedure in which flies expressing GCaMP are mounted with the labellum securely positioned, enabling fluorescence in the brain to be recorded at millisecond resolution under a confocal microscope while a solution is applied to the labellum, stimulating all labellar taste sensilla. The examples provided focus on calcium responses in primary gustatory receptor neurons of D. melanogaster. However, this approach can be adapted to record from other neurons of interest within the brain of Drosophilids or other insect species. This imaging method enables researchers to simultaneously record collective calcium responses from groups of gustatory neurons across the labellum, complementing electrophysiological tip recordings that quantify action potentials from individual neurons. The in vivo calcium imaging technique outlined here has been instrumental in uncovering molecular and cellular mechanisms of chemosensation, identifying unique temporal response patterns in primary taste neurons, investigating mechanisms of gustatory modulation, and exploring taste processing in downstream circuits.

A calcium imaging approach enables the recording of taste-induced responses in the brains of awake flies while a solution is applied to the labellum. Primary gustatory responses in Drosophila melanogaster are used as an example, but this protocol can be adapted to study downstream neurons or other species.

ב Vivo הדמיית סידן של תגובות עצביות הנגרמות על ידי טעם בדרוזופילה בוגרת

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model ...

Taste Preference Assay: A Method for Measuring Feeding Behavior in Drosophila

Source: Bantel, A. P. and Tessier, C. R. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/54403/" target="_blank">Taste Preference Assay for Adult Drosophila</a>. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes the taste preference assay, a behavioral method used to measure attraction or avoidance towards colored solutions that taste differently by assessing the fly&#39;s abdominal coloration after ingestion of the preferred substance. The featured protocol demonstrates the procedure used to measure flies&#39; preference towards solutions of varying sucrose concentrations.

בדיקת העדפות טעם: שיטה למדידת התנהגות האכלה בדרוזופילה

Source: Bantel, A. P. and Tessier, C. R. Taste Preference Assay for Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes the taste preference ...

שילוב של צריכת המזון כמותיים מבחני והפעלת בכפייה נוירונים ללמוד תיאבון בשנת דרוזופילה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הקלטה בו זמנית של אותות סידן מתא עצב לזהות התנהגות האכלה של תסיסנית melanogaster

למידה אסוציאטיבית הרחה באפטטיבית

יחיד לטוס Assay עבור התנהגות שיחור מזון ב

מאכיל מיקרו-תפוקה גבוהה לבדיקה לכימות הצריכה בדרוסופילה

דרך פשוטה למדוד שינויים בהתנהגות שוחרת זכה שימוש

את assay נימי מזין מודד צריכת המזון ב

כימות צריכת מקרונוטריאנטים במסך עצבי תרמוגנטי באמצעות זחלי דרוזופילה

מבחני העדפת מזון מהירה בדרוסופילה

ב Vivo הדמיית סידן של תגובות עצביות הנגרמות על ידי טעם בדרוזופילה בוגרת

בדיקת העדפות טעם: שיטה למדידת התנהגות האכלה בדרוזופילה