המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לזהות סמנים מולקולריים שימושיים עבור קרצינומות sinonasal ו neuroblastomas חוש הריח בצורה פשוטה ויעילה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום נוירובלסטומה חוש הריח וקרצינומה sinonasal, כגון זיהוי של סמנים מולקולריים להפלות תת סוג הגידול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים להשיג את התוצאה בתוך פחות משש שעות, או בתוך יום עבור הדו"ח של בית החולים.
הדגמת ההליך של מיצוי RNA ו PCR בזמן אמת יהיה ד"ר ג'ורג'יה Millefanti, דוקטורנט מהמעבדה שלי. ולהדגים את ההליך של אימונוהיסטוכימיה יהיה ג'ובאני מיכאלוני, גם דוקטורנט מהמעבדה שלי. כדי להתחיל את ההליך, לאסוף ולחלק את כל דגימות FFPE האנושיות לקבוצות משנה שונות, על פי סיווג ארגון ארגון האו"ם של גידולים בראש ובצוואר.
מחממים את הדגימות בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, rehydrate שלושה חלקים עבים מיקרומטר FFPE על ידי שטיפת אותם בקצרה קסילן במשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות ב-100%95%85% וב-75% אלכוהול באופן סדרתי במשך חמש דקות כל שטיפה.
שוטפים את המגלשות במשך חמש דקות במים מזוקקים. לאחר מכן, לחסום את הפעילות אנדוגניים על ידי הצבת השקופיות 3% מי חמצן מיימת במשך 12 דקות. לאחר מכן, לבצע אנטיגן אחזור על ידי טיפול שקופיות עם חיץ ציטראט 10 מילימולר, microwaving במשך 10 דקות.
לאחר 10 דקות, לשטוף את החלקים במאגר TBS. לאחר מכן, הוסיפו 0.2% מטריטון X, והדוגים אותם בן לילה בארבע מעלות צלזיוס, עם נוגדן OTX2 אנטי-אנושי עז, מדולל ביחס של 1 עד 100. למחרת, מוסיפים נוגדן משני נגד עיזים ארנב biotinylated, מדולל ב 1 עד 200, ו דגירה את החלקים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, לטפל בדגימות עם קומפלקס פרוקסידזה ABC. לאחר מכן, לפתח את החיסרון באמצעות diaminobenzene טטרהידרוכלוריד, ונגד כתם הגרעינים עם hematoxylin האריס. לאחר מכן, לייבש את החלקים בסולם אלכוהול חצי סהר, ולהבהיר אותם בחומר ניקוי ממוצא טורפין.
לאחר מכן, תן את המקטעים בשקופית עם מדיום הרכבה. לאחר מיצוי RNA ותעתיק הפוך, בצע ניתוח PCR כמותי בזמן אמת עם טכנולוגיה מבוססת בדיקה ו- cycler תרמי. הכן את תערובת תגובת PCR באמצעות 12.5 מיקרוליטרים של תערובת ראשית מבוססת בדיקה, 1.25 מיקרוליטרים של כל גשושיות OTX1, OTX2 ו- ACTB, 50 ננוגרם של CDNA ומים ללא גרעין עד 25 מיקרוליטרים של נפח כולל.
בצע את כל התגובות ב- triplicate באמצעות גן ACTB כשליטה אנדוגנית כדי לנרמל את רמות ביטוי הגנים. לאחר מכן, צנטריפוגה הצלחת ב 1109 פעמים כוח הכבידה במשך שלוש דקות. לאחר מכן אחסן את הצלחת מוגנת מפני אור בארבע מעלות צלזיוס, עד הניסוי.
כדי לבצע PCR בזמן אמת, מקם את הדגימות במחשב. לאחר מכן, הגדר את פרופיל האופניים התרמיים עם מחזור התחלה חם ראשוני של 50 מעלות צלזיוס לשתי דקות, ו-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו 40 מחזורים ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ומחזור אחרון ב-60 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. לניתוח רמת ביטוי גנים, לנרמל את רמות ביטוי הגן באמצעות שיטת סף מחזור השוואתי באמצעות גן ACTB כשליטה אנדוגנית.
הערך את רמות ביטוי הגנים באמצעות שיטת סף המחזור ההשוואתי והתוות את התוצאות. לאחר מכן, לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות מבחן t של התלמיד, בהתחשב בתוצאות מובהקות סטטיסטית עם p
ביטוי גרעיני עבור OTX1 נמצא בכל דגימות אדנוקרצינומה שאינן סוג מעיים, בעוד אימונואקטיביות מועטה או נעדרת הודגשה אדנוקרצינומות סוג המעי. אימונואקטיביות אינטנסיבית הייתה נוכחת בכל נוירובלסטומות חוש הריח. בין כל קרצינומות נוירו-אנדוקריניות מובחנות היטב, ביטוי OTX מגוון בעוצמה ובאחוז התאים החיוביים.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע כל שלב וצעד של מיצוי RNA בתנאים סטריליים באמצעות גם ציוד סטרילי. במקביל להליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח רנטגן, בדיקה אנדוסקופית של חלל האף, סריקת CT, דימות תהודה מגנטית וביופסיה, על מנת לאשר את התוצאות שהתקבלו מהטכניקה שלנו. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האונקולוגיה לחקור מחלה זו במודלים של תאים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לזהות סמנים מולקולריים להפלות תת סוגים של גידול באמצעות immunohistochemistry ו PCR בזמן אמת. אל תשכח כי עבודה עם רייגנטים אלה, מכשור, ודגימות יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון DPI תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.
