Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, nützliche molekulare Marker für sinonasale Karzinome und olfaktorische Neuroblastome auf einfache und effiziente Weise zu identifizieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet des olfaktorischen Neuroblastoms und sinonasalen Karzinoms zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung molekularer Marker, um Tumorsubtyp zu diskriminieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass wir Ergebnisse in weniger als sechs Stunden erhalten können, oder innerhalb eines Tages für den Krankenhausbericht.
Die Demonstration des Verfahrens der RNA-Extraktion und Echtzeit-PCR wird Dr.Giorgia Millefanti, eine Doktorandin aus meinem Labor. Und der Nachweis des Verfahrens der Immunhistochemie wird Giovanni Micheloni sein, ebenfalls ein Doktorand aus meinem Labor. Um das Verfahren zu beginnen, sammeln und teilen Sie alle menschlichen FFPE-Proben in verschiedene Untergruppen, nach der WHO-Klassifikation von Kopf- und Halstumoren.
Die Proben rutschen 30 Minuten lang in einem Ofen bei 60 Grad Celsius. Als nächstes rehydrieren Sie die drei Mikrometer dicken FFPE-Abschnitte, indem Sie sie 10 Minuten lang kurz in Xylol waschen. Dann waschen Sie die Dias in 100%95%85%und 75%Alkohol seriell für jeweils fünf Minuten waschen.
Spülen Sie die Dias für fünf Minuten in destilliertem Wasser. Anschließend blockieren Sie die endogene Aktivität, indem Sie die Dias 12 Minuten lang in 3% wässriges Wasserstoffperoxid einlassen. Danach führen Sie Antigen-Retrieval durch Behandlung der Dias mit 10 Millimolar Citratpuffer, und Mikrowaving für 10 Minuten.
Waschen Sie nach 10 Minuten die Abschnitte im TBS-Puffer. Dann fügen Sie 0,2% von Triton X hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius, mit Goat Anti-Human OTX2 Antikörper, verdünnt im Verhältnis 1 bis 100. Am nächsten Tag biotinylierte Kaninchen Anti-Ziege Sekundärantikörper hinzufügen, bei 1 bis 200 verdünnt, und inkubieren die Abschnitte für eine Stunde bei Raumtemperatur.
Behandeln Sie dann die Proben mit dem ABC-Peroxidase-Komplex. Danach entwickeln Sie die Immunreaktion mit Diaminobenzoltetrahydrochlorid und kontraflecken die Kerne mit Harris Hämatoxylin. Dann dehydrieren Sie die Abschnitte in einer Halbmond-Alkohol-Skala, und klären Sie sie in einer Clearingsubstanz turpin-Ursprung.
Als Nächstes montieren Sie die Abschnitte auf einem Dia mit Montagemedium. Führen Sie nach der RNA-Extraktion und Reverse-Transkription quantitative Echtzeit-PCR-Analysen mit sonsonbasierter Technologie und einem thermischen Cycler durch. Bereiten Sie den PCR-Reaktionsmix mit 12,5 Mikrolitern sondenbasierter Master-Mischung, 1,25 Mikroliter jeder OTX1-, OTX2- und ACTB-Sonde, 50 Nanogramm CDNA und nukleasefreiem Wasser bis zu 25 Mikroliter Gesamtvolumen vor.
Führen Sie alle Reaktionen in Dreifacharbeit mit dem ACTB-Gen als endogene Kontrolle zur Normalisierung der Genexpressionsniveaus durch. Als nächstes zentrieren Sie die Platte bei 1109-facher Schwerkraft für drei Minuten. Dann lagern Sie die Platte vor Licht bei vier Grad Celsius geschützt, bis zum Experiment.
Um Echtzeit-PCR durchzuführen, legen Sie die Proben in der Maschine. Legen Sie dann das thermische Cycler-Profil mit einem anfänglichen heißen Startzyklus bei 50 Grad Celsius für zwei Minuten und 95 Grad Celsius für 10 Minuten fest, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 Grad Celsius für 15 Sekunden und einem Letzten Zyklus bei 60 Grad Celsius für eine Minute. Normalisieren Sie für die Genexpressionsanalyse die Genexpressionsniveaus durch die methode des vergleichsgleichen Zyklusschwellenwerts, indem Sie das ACTB-Gen als endogene Kontrolle verwenden.
Bewerten Sie die Genexpressionsniveaus mit der Methode des vergleichsvergleichenden Zyklusschwellenwerts, und zeichnen Sie die Ergebnisse auf. Führen Sie dann eine statistische Analyse mit dem t-Test des Schülers durch, wobei statistisch signifikante Ergebnisse mit p
Die kernnukleare Expression für OTX1 wurde in allen adenokarzinomalen Adenokarzinomproben gefunden, während bei Darmtyp-Adenokarzinomen eine geringe oder fehlende Immunreaktivität hervorgehoben wurde. Intensive Immunreaktivität war bei allen olfaktorischen Neuroblastomen vorhanden. Unter allen schlecht differenzierten neuroendokrinen Karzinome variierte die OTX-Expression in Intensität und Prozentsatz positiver Zellen.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, jeden einzelnen Schritt der RNA-Extraktion unter sterilen Bedingungen mit ebenfalls sterilen Geräten durchzuführen. Parallel zu diesem Verfahren können andere Methoden wie Röntgenanalyse, endoskopische Untersuchung der Nasenhöhle, CT-Scan, Magnetresonanztomographie und Biopsie durchgeführt werden, um die Ergebnisse unserer Technik zu bestätigen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Onkologie, um diese Krankheit in Zellmodellen zu erforschen.
Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie molekulare Marker identifizieren können, um Tumorsubtypen mithilfe der Immunhistochemie und der Echtzeit-PCR zu unterscheiden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit diesen Reagenzien, Instrumenten und Proben extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie DPI sollten immer bei der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
