עבודה זו נעשתה התאפשרה הודות לתמיכה על ידי: אוניברסיטת פאביה FRG 2016; האוניברסיטה של פארמה FIL 2014, 2016; Kinesis לאספקת plasticware את הצורך לבצע את המחקר הזה. אנו מודים ד"ר שיין וינדזור (הפקולטה להנדסה, אוניברסיטת בריסטול, אנגליה) למתן את התוכנה Cell_PIV.

בכל ההליכים הכרוכים חיות אושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש ו ועדות אתיות ב אוניברסיטת פאביה. בעלי חיים היו נשמרים בתנאים של 22 מעלות צלזיוס, לחות האוויר 60% מחזור/כהה 12:12 h.
1. השחלה בידוד
<ol><li>מזריקים intraperitoneally 2 4-ל-11 בת שבוע CD1 הנשי עכברים עם 10 U של זקיק מגרה הורמון עם מזרק אינסולין עקר 1 מ"ל.</li>
	<li>. אני לא. h 46-48</li>
	<li>שוקל את העכבר, עזים ומתנגד עם זריקה תוך שרירית של 50 מ"ג/ק"ג של Zoletil (cloridrate Tiletamina, Zolazepan). המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם.</li>
	<li>לתפוס את העור המכסה לקיר הבטן בעזרת זוג מלקחיים לנתיחה. לחתוך את העור ופתח לגוף החומה עם זוג מספריים ומשוך את החתך עם מלקחיים.</li>
	<li>בעזרת זוג מספריים, להעביר האומץ הצידה, לאתר את הקרניים הרחם לשפה השחלות ב ממעמדם.</li>
	<li>בעדינות להחזיק את השחלה בעזרת מלקחיים שען, להשתמש במספריים לחתוך רצועה שלה אל הרחם. חזור עם השחלה אחרים.</li>
	<li>העברת השחלות שנאספו לתוך התא 35 מ מ תרבות פטרי המכילות 1 מ"ל של M2 בידוד בינוני להתחמם מראש ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 באוויר.</li>
	<li>להסיר את השומן את oviduct באמצעות מספריים בסדר תחת stereomicroscope.</li>
</ol>2. בידוד של מתחמי Oocyte תלולית
<ol><li>לנקב פני השטח השחלות באמצעות פינצטה סטרילי, מחט סטרילית אינסולין 1G עד מתחמי oocyte antral cumulus (COCs) משתחררים פסיבי.</li>
	<li>לאסוף את COCs עם יותר משלוש שכבות של תאים cumulus באמצעות שבשליטת הפה משך ידו פסטר micropipette (200 מיקרומטר בקוטר) ולהעביר אותם לתוך טיפת 300 µL בינוני M2 טריים.</li>
	<li>להסיר את התאים cumulus המקיפים את oocytes באמצעות micropipette פסטר משך ידו (80 מיקרומטר בקוטר) על-ידי בעדינות pipetting שם במשך כמה שניות.</li>
	<li>שוב ושוב להעביר oocytes טיפה 20 µL של M2 בינוני עוד אחד, עד cumulus תאים בוטלו לחלוטין.</li>
</ol>3. סיווג המבוסס על הארגון Oocyte כרומטין
<ol><li>להכין פתרון מכתימים Hoechst 33342 ריכוז הסופי של µg/mL 0.05 ב- M2 בינונית החל מפתרון אמא של 5 מ"ג/מ"ל מדולל ב- 1 x PBS.</li>
	<li>במקום 3.5 µL מיקרו טיפות Hoechst מכתים פתרון בחלק התחתון של מכסה פטרי 35 מ מ.</li>
	<li>להעביר לכל oocyte יחיד לתוך Hoechst צביעת טיפה, למקם את המנה לצלחת חימום מראש ומחוממת (37 מעלות צלזיוס), לכסות את זה עם מכסה כהה כדי להימנע תערוכות אור.</li>
	<li>לאחר 10 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, לבחון את oocytes עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות בהגדלה X 10 תחת אור UV (330-385 ננומטר), עבור לא יותר מ- 1-2 s.</li>
	<li>כשידור oocytes גרעינון מוקף (SN) (איור 1 א'), אם הם מציגים טבעת של כרומטין Hoechst-חיוביות המקיפים את גרעינון.</li>
	<li>לסווג את oocytes כמו גרעינון לא מוקף (NSN), אם שלהם גרעינון שאינו מוקף Hoechst-חיוביות כרומטין ומעוררים מראה כתמים heterochromatic בתוך הגרעין (איור 1B).</li>
</ol>4. סיווג Oocyte מבוססי-רשת עצבית
<ol><li>להכין ארבעה µL 2, טיפות מדיום α-מ בתוספת 5% לא פעיל חום העובר שור סרום, 2 מ מגלוטמין, טאורין 5 מ מ, 100 U/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 75, נתרן µg/µL 23.5 פירובט לתוך כוס 35 מ מ בתחתית צלחת פטרי ולכסות אותם עם ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס), שמן מינרלי equilibrated מראש כדי למנוע אידוי בינוני. הערה: אם משתמשים במערכת התא-הקרנה בשידור חי, לשמור על הטיפות במרחק מסוים באמצעות רשת מצוירות של 7 מ"מ x 7 מ"מ כקו מנחה.</li>
	<li>העברת 3 - 4 oocytes על כל טיפה.</li>
	<li>מקום בתחתית הכוס פטרי לתוך מערכת ההקרנה-תא חי, המצוידים בתוכנת הקלטה בצילום מואץ (ראה טבלה של חומרים), מה שמאפשר התבוננות oocyte ההבשלה בסביבה עם טמפרטורה יציבה (37 ° C) ו CO2 הריכוז (5%).</li>
	<li>פתח את תוכנת הצריבה זמן לשגות. על המסך מופיעה חלון עם שוט בשידור חי את oocyte, בצד שמאל, כל הלחצנים הגדרה בצד ימין.</li>
	<li>בחר מרכז oocyte כדי להציבו במרכז המסך. כוונן פוקוס במידת הצורך.</li>
	<li>בחר בלחצן ה-Ph והגדר את המנורה DIA 192; זמן החשיפה 1/125 s; רווח כדי 1.99; את הרזולוציה כדי 1600 x 1200.</li>
	<li>בחר FL2 ולהגדיר את המנורה DIA 5; זמן החשיפה 3 s; רווח כדי 2.37; את הרזולוציה כדי 1600 x 1200.</li>
	<li>בחר בלחצן הצבע החדשה כדי להקליט את מיקום oocyte בתוך הטיפה תרבות. חזור על שגרה זהה עבור כל oocyte בתוך הטיפה תרבות.</li>
	<li>בחר זמן ולהגדיר את רכישת מחזור 8 דקות , הזמן הכולל 15 h.</li>
	<li>בחר להתחיל בצילום מואץ להתחיל מחזור הקלטה.</li>
	<li>פתח את תוכנת MATLAB ולכתוב >>cell_piv; ולאחר מכן בחר את הכלי PIV.</li>
	<li>לבחור את התיקייה המכילה את הסרט המוקלט, בחר את כל הקבצים קבצי jpeg כדי לטעון את רצף התמונה כולה. עבור כל oocyte, בחר את האזור בעל עניין (ROI) על ידי לחיצה על בחר אזור הכלי.</li>
	<li>בחר תהליך PIV בתפריט קובץ. בחר בלחצן ' הכלי מציג . הערה: התוכנית יחשב את הווקטורים מהירות בתוך רועי ומייצרת באופן אוטומטי קובץ נתונים, לשמור כקובץ .mat.</li>
	<li>בחר את הקובץ .mat. בחר בלחצן ' ' רועי בחר כלי וצייר מעגל סביב קווי המתאר של oocyte. לחץ על שמור בתפריט קובץ. הערה: הווקטורים באזור זה מוצגים כעת, לעדכן את הנתונים מגניטודה רשע בחלון גרף עבור רועי החדש הזה.</li>
	<li>פתח הנתונים שנאספו הגודל הממוצע של המסגרות כל זמן לשגות הקליט לתוך גיליון אלקטרוני, עם, על השורות, הרצף מסגרת ועל, העמודות, oocyte יחיד לכל מנותח.</li>
	<li>לארגן את הנתונים של oocytes NSN וגם SN תת-קבוצות 10.</li>
	<li>השתמש תת-קבוצות 9 כדי לאמן את רשת עצבית מלאכותית הזנה-קדימה iteratively (FANN) ולקבוצת המשנה 1 בדיקה עיוורת.<ol>
<li>אני חוזר עוד 9 פעמים, שינוי המדגם בדיקה עיוורת (10-fold קרוס-אימות).</li>
	</ol>
</li>
	<li>MATLAB, להריץ את הסקריפט מחוייט הראשי ופתוח, על פי בקשה, להוסיף את השם של הקובץ עם הנתונים הדרכה (train.txt), מספר oocytes NSN וגם SN המשמש את מרווח זמן לשגות והדרכה כדי להיות מנותח (בדרך כלל, מתוך מסגרת מס ' 1-2 להפליל # 112-113).</li>
	<li>לחץ על הזן כדי לבצע את האימונים.</li>
	<li>להוסיף את השם של הקובץ עם הנתונים הבדיקה (test.txt).</li>
	<li>פתח את וקטור test_outputs_cyt בסביבת MATLAB. הערה: חלון מופיעה על המסך מציג, בשורה הראשונה, ההסתברות להשיג אמת תוצאות חיוביות (TP או נכון NSN) חיוביות שגויות (FP או כוזב NSN) עבור oocytes NSN וגם SN, בהתאמה; במקום זאת, בשורה השניה, ההסתברות לקבל שווא שליליות (FN או SN שווא). ותשלילים אמיתי (TN או SN נכון) עבור oocytes NSN וגם SN, בהתאמה.</li>
	<li>להשתמש בנוסחה: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), כדי לחשב את רמת הדיוק של FANN, מבוטא באחוזים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+methods+for+selection+of+the+ideal+oocyte.">Molecular methods for selection of the ideal oocyte.</a> Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).</li><li>Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+value+of+oocyte+morphology+in+human+IVF:+a+systematic+review+of+the+literature.">Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature.</a> Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).</li><li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+configurations+in+the+germinal+vesicle+of+mammalian+oocytes.">Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes.</a> Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).</li><li>Vigone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+based+identification+of+mouse+cumulus+cell+markers+that+predict+the+developmental+competence+of+their+enclosed+antral+oocytes.">Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes.</a> BMC Genomics. 14, 380 (2013).</li><li>Bui, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+movement+profiles+of+mouse+surrounding+nucleolus+and+not-surrounding+nucleolus+antral+oocytes+during+meiotic+resumption.">Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption.</a> Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).</li><li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organization+during+mouse+oocyte+growth.">Chromatin organization during mouse oocyte growth.</a> Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).</li><li>Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organisation+and+nuclear+architecture+in+growing+mouse+oocytes.">Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).</li><li>Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+it+take+to+make+a+developmentally+competent+mammalian+egg?.">What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?.</a> Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).</li><li>Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+oocyte+nucleus+and+cytoplasm+to+the+determination+of+meiotic+and+developmental+competence+in+mice.">Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice.</a> Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).</li><li>Ajduk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythmic+actomyosin-driven+contractions+induced+by+sperm+entry+predict+mammalian+embryo+viability.">Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability.</a> Nat. Commun. 2, 417 (2011).</li><li>Swann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C-&#950;-induced+Ca2++oscillations+cause+coincident+cytoplasmic+movements+in+human+oocytes+that+failed+to+fertilize+after+intracytoplasmic+sperm+injection.">Phospholipase C-&#950;-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection.</a> Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).</li><li>Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed+forward+artificial+neural+network:+tool+for+early+detection+of+ovarian+cancer.">Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer.</a> Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).</li><li>Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+Training+Efficiency+and+Computational+Costs+of+a+Feed+Forward+Neural+Network:+A+Review.">On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review.</a> Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

ישנם מספר שלבים קריטיים אחד אמור לטפל תוך כדי ביצוע פרוטוקול זה עם העכבר oocytes, כמו גם עם אלה של מינים אחרים. ברגע מבודד זקיקים שלהם, oocytes מיד יועברו לתוך הטיפות הקלטה, כמו פרידה תלולית לוויה תאים המפעילים תחילת המעבר GV-כדי-MII. שינוי אפשרי בפרוטוקול הנוכחי יכול להיות התוספת של 3-איזובוטיל-1-methylxa...

פוריות נשית היא מחלה המשפיעה על מספר גדל והולך של נשים. בסביבות על פי ארגון הבריאות העולמי, 20% של זוגות הם עקרים, עם 40% עקב בעיות פוריות נשית. בנוסף, שליש אחד של נשים שעברו טיפולים בסרטן (300,000 לשנה ו- 30,000 שנה בארצות הברית או איטליה, בהתאמה) לפתח שחלות מוקדמת.
אסטרטגיה כדי למנוע בעיות פוריות אצל חולי סרטן הוא בידוד הקפאה קריוגנית של זקיקי השחלה לפני הטיפול אונקולוגית, ואחריו במבחנה ההבשלה (IVM) של oocytes GV לבמה MII (GV-כדי-MII המעבר). הזמינות של סמנים לא פולשנית של מיומנות התפתחותית oocyte תשפר ההפריה, תהליכים התפתחותיים, הכוללת הריון הצלחה1,2.
בהתבסס על תצורת כרומטין שלהם נצפתה לאחר צביעת עם fluorochrome supravital Hoechst 33342, יונקים oocytes וחוה מסווגים מוקף גרעינון (SN) או לא מוקף גרעינון (NSN)3. מלבד ארגון כרומטין שונים שלהם, אלו שני סוגים של oocytes להציג הרבה הבדלים מורפולוגיים ופונקציונליים3,4,5,6,7,8 ,9, כולל את היכולות meiotic והפיתוחים שלהם. כאשר מבודד מן השחלה, התבגר במבחנה, הן סוג של oocytes להגיע לשלב MII, ולפתח הזרעה זרע, לשלב 2 תאים, אך רק אלו עם ארגון כרומטין SN עלולים לפתח המונח9. אמנם טוב כשיטה סיווג לבחירת המוסמכת נ' oocytes לא מוכשר, אולם החיסרון העיקרי הוא ההשפעה של ה מוטגני fluorochrome עצמה ו, ומעל לכל, את האור האולטרה סגול המשמש לצורך זיהוי שלו שאולי על התאים.
מכל הסיבות האלה, חיפשנו סמנים אחרים לא פולשנית המשויך קונפורמציה כרומטין SN או NSN יכול להחליף את השימוש Hoechst תוך שמירה על דיוק גבוהה סיווג אותו. התבוננות בצילום מואץ תנועה Cytoplasmic מהירויות (CMVs) מתגלה כמו תכונה ייחודית של מצב התא. לדוגמה, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו שהקשר בין CMVs להקליט בזמן ההפריה והיכולת של האדם מופרות של עכבר preimplantation מלאה, פיתוח מלא לטווח10,11.
בהתבסס על מחקרים אלה קודמות, נתאר כאן פלטפורמה עבור ההכרה של עכבר נכה כשיר או לא מוכשר oocytes לבגרות5,6,7,8. הפלטפורמה מבוססת על שלושה שלבים עיקריים: 1) Oocytes מבודד antral זקיקים מסווגים הראשון המבוסס על כרומטין בתצורה שלהם או של גרעינון מוקף (SN) או של גרעינון מוקף לא (NSN); 2) תמונות בצילום מואץ של CMVs המתרחשים במהלך המעבר GV-כדי-MII של כל יחיד oocyte נלקח וניתח עם חלקיקים תמונה velocimetry (PIV); ו- 3) נתונים שהושגו עם PIV מנותחים עם הזנה-קדימה מלאכותי עצבית רשת (FANN) עבור סיווג עיוור12,13. אנחנו נותנים פרטים על השלבים הקריטיים ביותר של ההליך מיועד העכבר שיהיה מוכן זמין להיות נבדק, המשמש עבור יונקים אחרים (למשל, שור, קופים, בני אדם).

<table><tbody><tr><td>Folligon</td><td>Intervet</td><td>A201A02</td><td>Hormonal treatment</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>For oocyte heterochromatin staining</td></tr><tr><td>Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>430165</td><td>For COCs isolation</td></tr><tr><td>EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red</td><td>Merck-Millipore</td><td>MR-015-D</td><td>For COCs isolation</td></tr><tr><td>MEM Alpha medium (1X) + Glutamax&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td>For oocyte in vitro maturation</td></tr><tr><td>Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom&amp;nbsp;</td><td>WillCo&amp;nbsp;</td><td>GWSt-3522</td><td>For imaging experiments</td></tr><tr><td>BioStation IM-LM&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MFA91001</td><td>Live cell screening system&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pasteur pipette</td><td>Delchimica Scientific Glassware</td><td>6709230</td><td>For follicles manipulation</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>To prevent contamination and medium evaporation</td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td>To prevent medium contamination&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ML16141079</td><td>For making up &amp;alpha;MEM medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td>For making up &amp;alpha;MEM medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td>For making up &amp;alpha;MEM medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3310</td><td>For making up &amp;alpha;MEM media</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;P4562</td><td>For making up &amp;alpha;MEM media</td></tr><tr><td>Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate)</td><td>Virbac Srl</td><td>QN01AX9</td><td>For mice anesthesia</td></tr><tr><td>Cell_PIV sofware&amp;nbsp;</td><td>Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;nbsp;-</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;nbsp;-</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Natick, MA&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;nbsp;-</td><td>For multi-paradigm numerical computing</td></tr></tbody></table>

a neural network-based identification of developmentally competent or incompetent mouse fully-grown oocytes

מרפאות פוריות ירוויחו היכולת לבחור כשיר מבחינת לעומת oocytes כשירים באמצעות הליכים פולשנית, ובכך לשפר את התוצאה הכוללת של ההריון. לאחרונה פיתחנו שיטת סיווג המבוסס על תצפיות חיים מיקרוסקופיים של העכבר oocytes במהלך שלהם במבחנה ההבשלה של שלפוחית germinal (GV) ועד השלב השני מפה של, ואחריו הניתוח של התנועות cytoplasmic המתרחשים במהלך תקופה זו זמן לשגות. כאן, אנו מציגים נתונים היסטוריים הפרוטוקולים של הליך זה. Oocytes מבודד זקיקים antral וחוה, תרבותי עבור h 15 בתוך מיקרוסקופ מצויד לניתוח זמן לשגות-CO 37 ° C ו-5%2. תמונות נלקחים במרווחים של 8 דקות. התמונות ניתוח בשיטת Velocimetry תמונת החלקיקים (PIV) מחשבת, עבור כל oocyte, הפרופיל של מהירויות התנועה Cytoplasmic (CMVs) המתרחשים לאורך כל תקופת תרבות. בסופו של דבר, CMVs של כל יחיד oocyte מוזנים דרך סיווג מתמטית כלי (רשת עצבית מלאכותית הזנה-קדימה, FANN), אשר מנבאת את ההסתברות של תא רבייה להיות נכה או לא מוכשר עם דיוק של 91.03%. פרוטוקול זה, להגדיר עבור העכבר, עכשיו נבדק על oocytes של מינים אחרים, כולל בני אדם.

איור 2 מציג נציג התפתחותי מוסמך ולא יוצלח oocyte, בהתאמה בהתחלה (GV) ובסופו של דבר (MII) של ההליך IVM. IVM של העכבר לבגרות oocytes מתרחשת במהלך 15 h תרבות. התצפית זמן לשגות מתעדת את ההתקדמות של מיוזה ומזהה האירועים meiotic הגדולים, כולל GVBD את ההבלטה של הגוף הקוטב הראשון.
<p class...

Watch this Scientific Journal Video about A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes at JoVE.com

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

כאן, אנו מציגים עבור הערכה בלתי פולשני של מיומנות התפתחותית oocyte שבוצעה במהלך שלהם במבחנה ההבשלה של שלפוחית germinal לשלב השני מפה של פרוטוקול. שיטה זו משלבת הדמיה בצילום מואץ עם חלקיקים תמונה velocimetry (PIV) וניתוחים רשת עצבית.

מזהה מבוססי-רשת עצבית של Oocytes וחוה עכבר נכה כשיר או לא מוכשר

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

a-neural-network-based-identification-developmentally-competent-or

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K Views.  University of Pavia. כאן, אנו מציגים עבור הערכה בלתי פולשני של מיומנות התפתחותית oocyte שבוצעה במהלך שלהם במבחנה ההבשלה של שלפוחית germinal לשלב השני מפה של פרוטוקול. שיטה זו משלבת הדמיה בצילום מואץ עם חלקיקים תמונה velocimetry (PIV) וניתוחים רשת עצבית.

Video: A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

בידוד ואפיון של עכבר Antral ביציות בהתבסס על ארגון הכרומטין nucleolar

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genetics

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

תרביות רקמה השחלות כדי לחזות תופעות העכבר השחלה

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.

ספירה מדויקת של זקיקים בשחלות עכברים למבוגרים

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

אימונופלואורסצנציה של השחלה כולה, ניקוי ומיקרוסקופיה מרובת פוטון לניתוח תלת-ממדי כמותי של עתודת השחלות המתפתחות בעכבר

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

זיהוי נזק לדנ"א בביציות של עכברים שנעצרו בשלב

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

מחבר זרקור: הבנת תגובת נזק לדנ"א בביציות יונקים ובעוברים טרום השרשה 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

איתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בביציות עכבר

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

מזהה מבוססי-רשת עצבית של Oocytes וחוה עכבר נכה כשיר או לא מוכשר

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד ואפיון של עכבר Antral ביציות בהתבסס על ארגון הכרומטין nucleolar

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

תרביות רקמה השחלות כדי לחזות תופעות העכבר השחלה

ספירה מדויקת של זקיקים בשחלות עכברים למבוגרים

אימונופלואורסצנציה של השחלה כולה, ניקוי ומיקרוסקופיה מרובת פוטון לניתוח תלת-ממדי כמותי של עתודת השחלות המתפתחות בעכבר

הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר

איתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בביציות עכבר

איתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בביציות עכבר

איתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בביציות עכבר

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה