המחברים רוצה להודות התרומות של סמנים ביולוגיים, חיסונית-מבחני צוות פיתוח מוצר לפיתוח וזמינותו. בנוסף, ברצוננו להודות Vigene טק בע מ על מאמציהם שיתופי בעיצוב חבילות תוכנה לניתוח נתונים.

<ol>
	<li>Stanley, A. C., Lacy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+for+cytokine+secretion.">Pathways for cytokine secretion.</a> Physiology (Bethesda). 25, 218-229 (2010).</li><li>Nicola, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+pleiotropy+and+redundancy:+a+view+from+the+receptor.">Cytokine pleiotropy and redundancy: a view from the receptor.</a> Stem Cells. 12, (1994).</li><li>Miyajima, A., Hara, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+subunits+of+cytokine+receptors+and+the+functional+redundancy+of+cytokines.">Common subunits of cytokine receptors and the functional redundancy of cytokines.</a> Trends Biochem Sci. 17, 378-382 (1992).</li><li>Costantini, S., Castello, G., Colonna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Cytokinome:+a+new+challenge+for+systems+biology.">Human Cytokinome: a new challenge for systems biology.</a> Bioinformation. 5, 166-167 (2010).</li><li>Capone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+Cytokinome+Profile+Evaluation:+A+Tool+to+Define+New+Diagnostic+and+Prognostic+Markers+of+Cancer+Using+Multiplexed+Bead-Based+Immunoassays.">Serum Cytokinome Profile Evaluation: A Tool to Define New Diagnostic and Prognostic Markers of Cancer Using Multiplexed Bead-Based Immunoassays.</a> Mediators Inflamm. , 3064643 (2016).</li><li>Schett, G., Elewaut, D., McInnes, I. B., Dayer, J. M., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cytokine+networks+fuel+inflammation:+Toward+a+cytokine-based+disease+taxonomy.">How cytokine networks fuel inflammation: Toward a cytokine-based disease taxonomy.</a> Nat Med. 19, 822-824 (2013).</li><li>Tse, E., Kwong, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+lymphoma:+Microenvironment-related+biomarkers.">T-cell lymphoma: Microenvironment-related biomarkers.</a> Semin Cancer Biol. 34, 46-51 (2015).</li><li>Reale, M., Greig, N. H., Kamal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+chemo-cytokine+profiles+in+Alzheimer's+and+Parkinson's+diseases.">Peripheral chemo-cytokine profiles in Alzheimer's and Parkinson's diseases.</a> Mini Rev Med Chem. 9, 1229-1241 (2009).</li><li>Vistnes, M., Christensen, G., Omland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+cytokine+biomarkers+in+heart+failure.">Multiple cytokine biomarkers in heart failure.</a> Expert Rev Mol Diagn. 10, 147-157 (2010).</li><li>Gobel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+coagulation+factor+XII+drives+adaptive+immunity+during+neuroinflammation+via+CD87-mediated+modulation+of+dendritic+cells.">Blood coagulation factor XII drives adaptive immunity during neuroinflammation via CD87-mediated modulation of dendritic cells.</a> Nat Commun. 7, 11626 (2016).</li><li>Palm, A. K., Friedrich, H. C., Kleinau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+marginal+zone+B+cells+in+mice:+a+novel+subset+with+dormant+self-reactivity.">Nodal marginal zone B cells in mice: a novel subset with dormant self-reactivity.</a> Sci Rep. 6, 27687 (2016).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Bcl11b+is+specifically+expressed+in+group+2+innate+lymphoid+cells+and+is+essential+for+their+development.">The transcription factor Bcl11b is specifically expressed in group 2 innate lymphoid cells and is essential for their development.</a> J Exp Med. 212, 865-874 (2015).</li><li>Pelly, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4-producing+ILC2s+are+required+for+the+differentiation+of+TH2+cells+following+Heligmosomoides+polygyrus+infection.">IL-4-producing ILC2s are required for the differentiation of TH2 cells following Heligmosomoides polygyrus infection.</a> Mucosal Immunol. 9, 1407-1417 (2016).</li><li>. LEGENDplex Multiplex Assays Available from: <a target="_blank" href="https://www.biolegend.com/legendplex">https://www.biolegend.com/legendplex</a> (2017)</li><li>Autieri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-+and+anti-inflammatory+networks+in+atherosclerosis.">Pro- and anti-inflammatory networks in atherosclerosis.</a> ISRN Vascular Medicine. 2012, (2012).</li><li>West, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+cytokine+networks+in+colorectal+cancer.">Emerging cytokine networks in colorectal cancer.</a> Nat Rev Immunol. 15, 615-629 (2015).</li><li>Becher, B., Spath, S., Goverman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+networks+in+neuroinflammation.">Cytokine networks in neuroinflammation.</a> Nat Rev Immunol. 17, 49-59 (2017).</li></ol>

המחברים הם מועסקים על ידי BioLegend, אשר מייצרת את ריאגנטים המתואר בכתב היד. Vigene טק בע מ פיתחה את התוכנה ניתוח נתונים של LEGENDplex המשמש לניתוח נתונים המופקים וזמינותו המתואר בכתב היד.

התבנית assay שמתואר פרוטוקול זה יכול לספק כימות חזקים של המתווך מסיסים פרופילים בדגימות ביולוגיות שסופקו הנסיין יש מעבדה טכניקה ונדבקת הפרוטוקול המומלץ.
ישנם מספר שלבים מרכזיים שיש לבצע על מנת להבטיח תוצאות אמינות. קודם כל, הסטנדרטים רקומביננטי תתאפשר צריך להשרות במאגר assay במשרה מלאה מומלץ, ואחרי בדילול רק צינורות פוליפרופילן צינורות פוליסטירן יכול לקדם את דבקותה של החלבונים לקיר של הצינורות, אשר יכול להוביל אותות נמוכה בעת יצירת העקומה סטנדרטי. שנית, ראוי רועדת בזמן הדגירה צעדים הוא קריטי. בלי עצבנות נכונה, מאפייני איגוד של חרוזים assay יכול להיות קשות הפריע. בנוסף לכך, הכביסה הנכונה בין השלבים הדגירה נדרש גם. הנסיין לוודא כי עודף ריאגנטים יוסרו מן הבארות לפני התחלת השלב בפרוטוקול. חייב להיות מוטבת מכשירים הגדרות עבור cytometer זרימה המשמש לחקור את החרוזים assay גם כן. בפרט, PMT הגדרות התוקף שתישמר כדי להבטיח הפרדה נאותה חרוז וטווחים דינמי רחב על העיקולים סטנדרטי. סוף סוף, רגע לפני שעוברים ניתוח על cytometer, חרוזים חייב להיות vortexed כדי להבטיח הבולם תקין וכדי למנוע היווצרות של אגרגטים אשר יכול להטות את תוצאות.
פרוטוקול זה פוטנציאלי יכול להיות שונה כדי לנתח רקמת homogenates, כמו גם את סוגי דגימה שנדונו בכתב היד, בתנאי החוקר הוא מוכן למטב את פרוטוקול פירוק שלהם לפני ביצוע מבחני צלחת גדולה, מלאה. הטכניקה בפועל כמובן משתנה בהתאם לסוג הרקמה; אולם, באופן כללי הפרוטוקול צריך להשתמש מאגר ה-pH נייטרלי המכיל פיזיולוגיים ריכוזי מלחים יוניים, ללא חומרים כימיים denaturing, רצוי ללא חומרי ניקוי. אם מה שהוא עושה חייב לשמש, יש לשמור ריכוזים דטרגנט ללא יונית לכל הפחות (למשל לא יותר מ 1%). המאגר צריך להכיל גם מעכבי פרוטאז מספיקות כדי למנוע השפלה הפרוטאוליטי של חלבונים היעד. ללא קשר פרוטוקול פירוק שמשמש, כדאי centrifuged את ההכנות האחרונות להסיר את החלקיקים לפני ניתוח.
בנוגע למגבלות assay, ריכוזי analyte מטרות סוגי דגימה ביולוגית יכול להשתנות במידה רבה. על מנת לכמת כראוי analyte ריכוזים, הם חייב ליפול בתוך הערכים העליונים והתחתונים עבור העקומה סטנדרטי. אקסטרפולציה של ערכים של העקומה אינה בהכרח אמין ואני לא ממליצה. החוקרים ולכן חייב למטב דילולים שלהם דגימות מסוימת בניסויים פיילוט לפני הפעלת וזמינותו של פלייט-מלא. בנוסף, הכנת דגימות ביולוגיות. זהירות כדי להיות לבדיקה הוא בעל חשיבות עליונה להצלחה של פורמט זה וזמינותו. דוגמאות הן lipemic, hemolyzed או מכילים חלבון פסולת להשפיע את האינטראקציות נוגדן אנטיגן המגדירים לעקרון הליבה של זה מתכלה, רינדור לתוצאות uninterpretable.
זה וזמינותו היא משמעותית ביחס שיטות קיימות כימות מכמה סיבות. מתי יפעל כראוי, התבנית assay יכול quantitate analytes עד 13 מתוך מדגם שימוש באמצעי אחסון עד כה קטנים יותר יידרשו כדי לנתח את הדגימה באמצעות מבחני אליסה מסורתי. תבנית זו assay גם אינו דורש מכשור ייעודי על מנת לבצעו. זהו יתרון לעומת אחרים immunoassays מבוססי חרוז זמינים מסחרית כמו וזמינותו ניתן להפעיל באמצעות מספר כלשהו של זרימה נפוץ cytometers.
חקירה מדעית התפקיד שיחק על ידי גורמים מופרשים ציטוקינים רשתות בריאות, מחלות מתרחב. התבנית assay תיאר כתב יד זה יכול להיות כלי רב ערך עבור חוקרים המבקשים להכיר את התופעות רבת ומורכבים. תוכניות מחקר ביו פעיל מתחילים לחקור את התפקיד של ציטוקין רשתות לא רק אזורים כגון מוכללת דלקת6, אלא גם בתוך ההקשר של מצבי מחלה ספציפית כגון טרשת עורקים, סרטן, neuroinflammation 1516,,17. אין ספק, החקירה ימשיכו לגדול באזורים אלה מתרחב החיפוש אחר הריפוי לטפל אלה מצבים כרוניים. הצורך כימות מדויק ואמין של המתווכים מסיסים הקשורים עם מחלות אלו יישארו עדיפות מחקר ביקורתי.

בתפקיד שלהם כמו מולקולות איתות מסיסים, ציטוקינים מתווכים התהליכים multifactorial ומתואמת במיוחד המפקחים על תגובות חיסוניות המארח. הם באים לידי ביטוי בכל שלבי תהליך דלקתי, מייזום לרזולוציה, ולווסת את רשת באינטראקציה מורכבת הכוללת סינתזה משלהם וזו של קולטנים הסלולר שלהם1. רשת תקשורת זו היא שכבתית עם המורכבות שהוא מעבר הגומלין סינרגטי או אויבת שעשויים להתקיים בין רכיבים בודדים. אכן, ציטוקינים רבים ידועים לחלוק פונקציות מיותרות או לפחות חופפים באופן חלקי2,3.
גישות ביולוגיה מערכות משולבות בו זמנית לכמת analytes ציטוקין מרובים כיום מספקים הבנה מקיפה יותר ויותר של cytokinomes ייחודי זה שננהל את תגובות מערכת החיסון שבבסיס המחלה מרובים מדינות4,5. מדינות אלה מחלות נע בין דלקת כללית סרטן, תנאים נוירו-ניוונית של מחלות לב וכלי דם6,7,8,9.
רשתות כאלה ציטוקין יכולה להיחקר ביעילות באמצעות LEGENDplex מבוססי חרוז immunoassays. מבחני אלה מבוססים על אותו עיקרון כמו כריך Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (אליסה), והשתמש פלורסצנטיות מקודד microspheres עם נוגדנים הלכידה המחוברים covalently פני השטח שלהם. נוגדנים אלה הם ותשמרו על פני שטחים הרבה יותר קטן מאשר אלה הנדרשים על-ידי תבניות אליסה מסורתית. דבר זה מאפשר כזה מבחני להתבצע עם הרבה פחות נפח דגימה, בעוד באותו הזמן הפחתת שאינם ספציפיים מחייב מתן מרובב ניתוח של מספר analytes.
וזמינותו שמתואר פרוטוקול זה מנצל את הטכנולוגיה הזו כדי quantitate עד 13 מטרות בו זמנית. נתונים assay זו יכולה להיות מושגת באמצעות מגוון רחב של זרימה זמין נפוץ cytometers, בניגוד מבחני זמינים אחרים לא דורשת השימוש במכשור ספציפי assay ייעודי. עם קטלוג המתרחב של לוחות analyte מאומתים, מבחני אלה היו בשימוש מספר מחקר ביו-רפואי שוטף פרויקטים10,11,12,13.
כדי להדגים את נוחות ואת השירות של הפורמט assay, בניסוי זה שאנו משתמשים בעכבר כדי המסייע ציטוקין פאנל כדי quantitate 13 להפריד בין ציטוקינים ריכוזים של תרביות רקמה supernatants המתקבל splenocytes עכבר תרבותי תחת מרובות תנאים מופחתים. בנוסף תרביות רקמה supernatants, וזמינותו זו גם ניתן לבצע באמצעות הדוגמאות סרום או פלסמה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366816</td>
			<td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>740005</td>
			<td>Multiplex Immunoassay (13-plex)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD3&#949; antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100314</td>
			<td>Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD28 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102112</td>
			<td>Clone 37.51, low endotoxin, azide free format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>WP6111560</td>
			<td>For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Manifold</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MSVMHTS00</td>
			<td>For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-130</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene MicroFACS Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-842-90</td>
			<td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-388-100</td>
			<td>Four pipette sizes (0.2-2&#181;L, 2-20&#181;L, 20-200&#181;L, 100-1000&#181;L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Channel Pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FA10011G</td>
			<td>capable of dispensing 5 &#956;L to 200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88880023</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75002410</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9885747</td>
			<td>12 x 75 mm round bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-8274</td>
			<td>Escherichia coli O26:B6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson B200 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z305359</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z666505</td>
			<td>1.5 mL polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polypropylene Plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-662</td>
			<td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex cytokine profiling of stimulated mouse splenocytes using a cytometric bead-based immunoassay platform

Immunoassays מבוססי חרוז להעסיק אותו עיקרון כמו כריך immunoassays. לכידת חרוזים, אשר יכול להיות מובחן על-ידי גודל ועוצמת קרינה פלואורסצנטית allophycocyanin פנימי (APC), הן מצומדת כדי נוגדנים ספציפיים analyte מסוים. בשלב הבא, פאנל הנבחר של לכידת מוגדר חרוז ערכות מודגרת עם דגימה ביולוגית המכילה analytes יעד ספציפי הנוגדנים לכידת. זיהוי נוגדנים biotinylated קוקטייל נוסף, מה שמוביל להיווצרות לכידת חרוז-analyte-זיהוי נוגדנים כריכים.
לבסוף, streptavidin-phycoerythrin (SA-PE) נוסף, אשר נקשר biotinylated זיהוי נוגדנים, מתן אות ניאון עוצמות בפרופורציה כמות analyte מאוגד. PE ניאון האות של אזורים ספציפיים analyte חרוזים זה לכמת באמצעות cytometry זרימה, ריכוזי analytes מסוים נקבעים באמצעות תוכנת ניתוח נתונים ועקומת סטנדרטי המופקים וזמינותו.
בניסוי זה, אנו משתמשים בעכבר T helper ציטוקין פאנל בו זמנית לכמת את הריכוז של מטרות ציטוקין נפרד 13 supernatants תרביות רקמה שנאסף העכבר splenocytes בתרבית בתנאים מופחתים שונים.

פרוטוקול זה מדגים איך פלטפורמה מבוססת-חרוז מתכלה יכול לשמש בו זמנית quantitate ציטוקין פרופילים של דגימות ביולוגיות באמצעות cytometer של זרימה. הדגימות הביולוגיים בשימוש בדוגמה זו היו תא supernatants התרבות של splenocytes העכבר זה היה בעבר מודגרות בתנאים הפעלת שונים, למרות התבנית assay אומתה גם לשימוש עם הדוגמאות סרום או פלסמה.
הנתונים המופקים וזמינותו משמשים לבניית עקומות סטנדרטי עבור כל analytes מרובבת בלוח. התוכנה ניתוח נתונים מסווג את כל analyte מסוים בהתבסס על גודל חרוז ייחודי APC בעוצמה, מכמת אותם באמצעות כתב PE. טווחים דינאמיים, כמו גם את רגישות וזמינותו מודגמות כאשר המותוות בקנה מידה יומן-יומן איור2 א. התוכנה משתמשת בנתונים assay וסיפק באלגוריתם התאמה 5-פרמטר עקומה כדי לחשב במדויק לא רק את ריכוזי analytes המשתמש דגימות ביולוגיות, אלא גם את הגבולות של זיהוי הן גבוהות ונמוכות בסוף כל רגיל עקומות (טבלה 1 ). התבנית שמתואר פרוטוקול זה מספק גם דיוק assay חזקה מאוד. איור 2B ו 2 ג נתונים מוצגים המתארים את ההשתנות אינטרה-וזמינותו של כל analyte. שני ריכוזים חלבון תקן נפרד (גבוה ונמוך) נותחו ב assay אחד עם משכפל 16 עבור כל דגימה. איור 2C ו- 2D לייצג ההשתנות הבין-וזמינותו של היעד analytes בין שלושת מבחני עצמאית. כמו עם הניסויים דיוק אינטרה-assay, גבוה ונמוך ריכוזים סטנדרטי נותחו עם 3 משכפל בכל אחד מן הניסויים עצמאית. השתנות מינימלי ירידה בריכוז מחושב של חלבונים היעד ברור לחלוטין
כדי להדגים את התועלת של מבחני cytometric מבוססי חרוז בחקירתו של פרופילי ביטוי ציטוקינים, העכבר splenocytes היו מודגרות בתנאים הפעלת שונים. בנוסף פקד unstimulated, התאים היו מתפשט גם עם התקליטים, נוגדנים anti-CD3/אנטי-CD28, או phorbol פעילים-12 13-אצטט ionomycin. תא תרבות supernatants נאספו 48 שעות מאוחר יותר, לבדיקה באמצעות לוח ציטוקין העוזר של העכבר כדי. כמת תוצאות ניסוי זה מוצגים באיור 3, והוא תחום בבירור ההשפעה של גירוי תנאים על ריכוזי ציטוקין.
הממצאים המתוארים לעיל אופייניות, כל עוד הנסיין יש מעבדה טכניקה כדלקמן פרוטוקול assay שסופקו. מקורות של שגיאה בתבנית זו assay יכול להיווצר סטיות בתקופות דגירה, ריאגנט כרכים, הכביסה, או הגדרות PMT ב cytometer זרימה להשתמש בה כדי לנתח את הדגימות. איור 4A פיזור מגרש מ assay מוצלחת מראה 2 אוכלוסיות נפרדות חרוז מוגדרים בבירור. זה יכול בניגוד ל 4B איור, שבו הדבקות כביסה ופרוטוקול המסכן הובילו אגרגטים חרוז אשר לטשטש שתי האוכלוסיות. בנוסף, כפי שמעידים ההריסות ברביע השמאלי התחתון, cytometer הכולל אירועים יוצאו עבור ניתוח במקום התבנית המועדפת מגודרת אירועים בלבד. Cytometer ראוי להגדיר חיוני להפקת נתונים אמינים ב assay הזה. ב- PMT המתאים באיור 4C לאפשר הגדרות הרזולוציה של כל אחד analytes 6 בערוץ סיווג APC. הגדרות PMT תגרום לנתונים הדומה לזה המוצג בתוך 4D איור שבו התעלה APC יש חרוז אוכלוסיות בעלות עוצמות סיווג חופפים. זה יהפוך וזמינותו מאז זה יהיה בלתי אפשרי לחשב ריכוזים analyte ללא אוכלוסיות ברורה של חרוזים וזמינותו.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig2.jpg"> 
איור 2: תקן עקומת טווחים ודיוק Assay. (א) עיקול רגיל נציג שנוצר על ידי שימוש בלוח ציטוקין המסייע בעכבר כדי. יש להפעיל עיקול רגיל עם כל וזמינותו. (בג) אינטרה-assay דיוק. שתי דגימות עם ריכוזים שונים של חלבונים היעד (גבוה ונמוך) נותחו ב assay אחד עם משכפל 16 עבור כל דגימה. הנתונים מיוצגים אומר + סטיית תקן. (D-E) דיוק assay אינטר. שתי דגימות עם ריכוזים שונים של חלבונים היעד (גבוה ונמוך) נותחו ב שלושה מבחני עצמאית עם משכפל 3 עבור כל דגימה. הנתונים מיוצגים אומר + סטיית תקן. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig3.jpg"> 
איור 3: כימות של נציג תוצאות. עכבר splenocytes (1 x 106 תאים) היו תרבותי ב- C ° 37 + 5% CO2 בתנאים שונים: unstimulated, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/mL מצופים צלחת) + αCD28 (1 µg/mL מסיסים), ובחום (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). תרבות supernatants היו שנאספו לאחר 48 שעות ואז לכמת באמצעות לוח ציטוקין העוזר של העכבר כדי. פרופילי ביטוי ציטוקינים דיפרנציאלית בתגובה לגירוי התנאים הם נראים בבירור. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig4.jpg"> 
איור 4: נובעת מוצלחת לעומת מבחני כושל. (א) מבחני מוצלח יהיה אוכלוסיות חרוז נפרדות עבור האוכלוסיות ננו-ספירה. (B) מבחני כושל תהיה הפרדה אוכלוסייה ענייה, חרוז, אגרגטים מדי האירועים שנאספו. (ג) מבחני מוצלח יש מוגדרים בבירור עוצמות בערוץ קרינה פלואורסצנטית מיון אשר קל שער ולכמת. (ד) מבחני לא מוצלח גרוע הפרידו בעוצמות סיווג אשר חופפים מספר אוכלוסיות חרוז, מקשה על כימות. הרבה שגיאות אלה ניתן למנוע דרך הדבקות זהיר פרוטוקול וזמינותו. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">עיקול רגיל</td>
			<td colspan="2">רגישות (pg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyte</td>
			<td>הנוסחה בכושר</td>
			<td>קורות חיים</td>
			<td>R2</td>
			<td>Min.</td>
			<td>. מקס.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-Γ</td>
			<td>5-P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01)</td>
			<td>1.77%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.1</td>
			<td>18105.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-5</td>
			<td>5-P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36)</td>
			<td>1.32%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>14514.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-Α</td>
			<td>5-P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37)</td>
			<td>1.48%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>1.9</td>
			<td>20109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>5-P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34)</td>
			<td>1.34%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>25109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6</td>
			<td>5-P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37)</td>
			</tr></tbody></table>td>1.70%
			<td>0.99</td>
			<td>2.0</td>
			<td>7022.0</td>
		
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>5-P.log(4.27, 12.23, 0.62, 5.72, 0.36)</td>
			<td>1.36%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>13273.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10</td>
			<td>5-P.log(4.67, 11.65, 1.20, 6.28, 0.61)</td>
			<td>1.81%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.2</td>
			<td>5190.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-9</td>
			<td>5-P.log(4.32, 13.86, 0.86, 5.90, 0.45)</td>
			<td>1.82%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>12602.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17A</td>
			<td>5-P.log(4.06, 14.03, 0.47, 6.52, 0.32)</td>
			<td>0.99%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>12285.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17F</td>
			<td>5-P.log(4.52, 12.15, 0.61, 5.52, 0.34)</td>
			<td>0.92%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>14841.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-21</td>
			<td>5-P.log(4.90, 8.03, 1.77, 4.74, 1.11)</td>
			<td>0.79%</td>
			<td>1</td>
			<td>9.0</td>
			<td>12943.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-22</td>
			<td>5-P.log(4.57, 12.56, 0.63, 6.06, 0.39)</td>
			<td>1.16%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>6408.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-13</td>
			<td>5-P.log(4.40, 11.44, 0.22, 3.19, 1.45)</td>
			<td>1.11%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
			<td>16728.0</td>
		</tr>
	

טבלה 1: תקן פריסטלטיות ורגישות Assay. התוכנה ניתוח נתונים שימשה ליצירת עקומות סטנדרטי עבור analytes כל הכלול מולטיפלקס וזמינותו. ניתוח ממוחשב זה חל על עיקול 5-פרמטר חזקים הולם האלגוריתם בתקני סדרת דילול מ וזמינותו, ומשמש גם להגדיר רגישות assay באמצעות לגבולות התיאורטיים של זיהוי.

Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform at JoVE.com

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

פרוטוקול זה מתאר כימות של מטרות ציטוקין מרובות בו-זמנית בתרביות רקמה supernatants שנאסף splenocytes העכבר מגורה באמצעות פלטפורמה המבוססת על חומרים חרוז מולטיפלקס cytometer זרימה.

מגה-פלקס ציטוקין פרופיל של העכבר מגורה Splenocytes באמצעות פלטפורמה מבוססת-חרוז Cytometric מתכלה

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

multiplex-cytokine-profiling-stimulated-mouse-splenocytes-using

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

44.7K Views.  BioLegend. פרוטוקול זה מתאר כימות של מטרות ציטוקין מרובות בו-זמנית בתרביות רקמה supernatants שנאסף splenocytes העכבר מגורה באמצעות פלטפורמה המבוססת על חומרים חרוז מולטיפלקס cytometer זרימה.

Video: Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

העשרת תא אוטומטית של ציטומגלווירוס ספציפי תאי T ליישומים קליניים באמצעות מערכת ציטוקין ללכוד

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene transcripts from infected tissues. Pathogen RNA constitutes a tiny portion of the total RNA isolated from infected tissue samples. Both microarray and RNAseq technologies have difficulties in generating reliable reads for weakly expressed pathogen genes. Mutant pathogen strains with reduced in vivo proliferation pose an even bigger challenge. Here we describe an in vivo gene expression profiling protocol that is very fast, extremely sensitive and highly reproducible. We developed this protocol during our investigation of the fungal pathogen Candida albicans in a murine model of hematogenously disseminated candidiasis. Using this protocol, we have documented time courses of dynamically regulated C. albicans gene expression during kidney infection, and discovered unexpected features of gene expression responses to antifungal drug treatment in vivo.

We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

פרופיל ביטוי גנים של חיידקים הדבקה באמצעות פלטפורמה דיגיטלית ברקוד

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and infections using cost effective, high-throughput approaches would be indispensable. This manuscript describes the development and analysis of a bead-based multiplex immunoassay capable of measuring the presence of antibodies in human saliva to multiple pathogens simultaneously. Saliva is particularly attractive in this application because it is noninvasive, cheaper and easier to collect than serum. Antigens from environmental pathogens were coupled to carboxylated microspheres (beads) and used to measure antibodies in very small volumes of human saliva samples using a bead-based, solution-phase assay. Beads were coupled with antigens from Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 and G II.4) and hepatitis A virus. To ensure that the antigens were sufficiently coupled to the beads, coupling was confirmed using species-specific, animal-derived primary capture antibodies, followed by incubation with biotinylated anti-species secondary detection antibodies and streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). As a control to measure non-specific binding, one bead set was treated identically to the others except it was not coupled to any antigen. The antigen-coupled and control beads were then incubated with prospectively-collected human saliva samples, measured on a high throughput analyzer based on the principles of flow cytometry, and the presence of antibodies to each antigen was measured in Median Fluorescence Intensity units (MFI). This multiplex immunoassay has a number of advantages, including more data with less sample; reduced costs and labor; and the ability to customize the assay to many targets of interest. Results indicate that the salivary multiplex immunoassay may be capable of identifying previous exposures and infections, which can be especially useful in surveillance studies involving large human populations.

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

פיתוח Immunoassay רוק נוגדן Multiplex כדי לאמוד את חשיפת אדם לפתוגנים הסביבה

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and protection to the underlying cells. Analysis of tears is an emerging area for the identification of biomarkers for the prediction, diagnosis, and prognosis of various ocular diseases. Tears are easily accessible and their collection is non-invasive. Therefore, advancing technologies are gaining prominence for identification of multiple analytes in tears to study changes in protein or metabolite composition and its association with pathological conditions. Tear cytokines are ideal biomarkers for studying the health of the ocular surface and also help in understanding the mechanisms of different ocular surface disorders like dry eye disease and vernal conjunctivitis. Bead based multiplex assays have the capability of detecting multiple analytes in a small amount of sample with a higher sensitivity. Here we describe a standardized protocol of tear sample collection, extraction and analysis of cytokine profiling using a bead based multiplex assay.

Analysis of tear film cytokines helps in studying various ocular diseases. Bead based multiplex assays are simple and sensitive and enable the testing of multiple targets in samples with small volumes. Here we describe a protocol for tear film cytokine profiling a using bead based multiplex assay.

חרוז מבוסס Assay מולטיפלקס לניתוח של פרופילים ציטוקין דמעה

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

אוטומטיות התנהגותית ניתוח של גדול C. elegans אוכלוסיות שימוש רחב שדה-of-view מעקב פלטפורמה

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this challenge, dereplication, which is the process of identifying known compounds, is performed on samples of interest. Methods for dereplication such as analytical separation followed by mass spectrometry are time-consuming and resource-intensive. To improve the dereplication process, we have developed the antibiotic resistance platform (ARP). The ARP is a library of approximately 100 antibiotic resistance genes that have been individually cloned into Escherichia coli. This strain collection has many applications, including a cost-effective and facile method for antibiotic dereplication. The process involves the fermentation of antibiotic-producing microbes on the surface of rectangular Petri dishes containing solid medium, thereby allowing for the secretion and diffusion of secondary metabolites through the medium. After a 6 day fermentation period, the microbial biomass is removed, and a thin agar-overlay is added to the Petri dish to create a smooth surface and enable the growth of the E. coli indicator strains. Our collection of ARP strains is then pinned onto the surface of the antibiotic-containing Petri dish. The plate is next incubated overnight to allow for E. coli growth on the surface of the overlay. Only strains containing resistance to a specific antibiotic (or class) grow on this surface enabling rapid identification of the produced compound. This method has been successfully used for the identification of producers of known antibiotics and as a means to identify those producing novel compounds.

We describe a platform that utilizes a library of isogenic antibiotic resistant Escherichia coli for the dereplication of antibiotics. The identity of an antibiotic produced by bacteria or fungi can be deduced by the growth of E. coli expressing its respective resistance gene. This platform is economically effective and time-efficient.

אנטיביוטי Dereplication באמצעות פלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. Innate immune cells, specifically mononuclear phagocytes, express overlapping cell surface markers, which makes identifying these populations a challenge. Multi-parameter flow cytometry allows for the simultaneous, quantitative analysis of multiple cell surface markers in order to differentiate monocytes, macrophages, microglia, and dendritic cells in mouse eyes. This protocol describes the enucleation of whole mouse eyes, ocular dissection, digestion into a single cell suspension, and staining of the single cell suspension for myeloid cell markers. Additionally, we explain the proper methods for determining voltages using single color controls and for delineating positive gates using fluorescence minus one controls. The major limitation of multi-parameter flow cytometry is the absence of tissue architecture. This limitation can be overcome by multi-parameter flow cytometry of individual ocular compartments or complimentary immunofluorescence staining. However, immunofluorescence is limited by its lack of quantitative analysis and reduced number of fluorophores on most microscopes. We describe the use of multi-parametric flow cytometry to provide highly quantitative analysis of mononuclear phagocytes in laser-induced choroidal neovascularization. Additionally, multi-parameter flow cytometry can be used for the identification of macrophage subsets, fate mapping, and cell sorting for transcriptomic or proteomic studies.

This protocol provides a method to digest whole eyes into a single cell suspension for the purpose of multi-parameter flow cytometric analysis in order to identify specific ocular mononuclear phagocytic populations, including monocytes, microglia, macrophages, and dendritic cells.

עיכול של עיני עכבר שלמות לניתוח ציטומטרי של זרימה מרובת פרמטרים של פיגוציטים מונונוקאריים

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...