Supported by NIH award R01 DK093525 (GFG). We greatly appreciate the scientific review and grammatical editing of the manuscript by Dr. Amber Shaffer (University of Pittsburgh) and thank Michael Burcham for assistance in preparation of figures.

הערה: פרוטוקול זה נבדק ואושר על ידי אוניברסיטת פיטסבורג מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה. 1. הכנת פתרון קרבס השתנה ובדיקת הסמים Aliquots <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 6 L של פתרון קרבס שונה המכיל (מ&quot;מ): 117.9 NaCl, 4.7 KCl, 25 3 NaHCO, 1.3 Nah 2 PO 4, 1.2 MgSO 4, 2.5 CaCl 2, 11.1 D-גלוקוז, וטיראט 2 נתרן, אצטט נתרן 20 , 0.004 nifedipine (לחסום התכווצויות שרירים ספונטניות), ו0.003 indomethacin (לחסום סינתזה של פרוסטגלנדינים אנדוגני). השתמש בפתרוני קרבס קרים כקרח וחמים לנתיחה רקמה והקלטה חד-סיבים, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תמיסות כימיות כלשהו (למשל, IS, קפסאיצין, ATP) בaliquots בריכוזים רצויים. </li></ol> 2. Dissection של רקמות Colorectum העצבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי ולהרדים עכברי זכרים (6 - 20, 8 שבועות - 30 גרם) בתא CO 2 בקצב זרימה שמחליף 10-30% מתא הנפח לדקה עד עכברים להפסיק לנשום לחלוטין כפי שעולה מהיעדר התנועה בחזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר המתת חסד, exsanguinate על ידי חיתוך פתוח קאמרי בית החזה, ניקוב העלייה הימנית, וטבילת פגר העכבר בנפח מספיק (~ 500 מיליליטר) של קרבס קר כקרח (4 ° C) פתרון מבעבע עם carbogen (95% O 2 , 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את כל הקרביים אבל איברי מעי גס ואגן. Transect העכבר במחצית פני מגזר השדרה T12 מעט מעל הסרעפת ולהעביר את מחצית הזנב לחדר נתיחה המכיל קר כקרח, מבעבע פתרון קרבס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת סטראו, להסיר את שלפוחית ​​השתן ואברי רבייה על ידי transecting בצמתים שלהם לשופכה, ולהסיר יורד / אב העורקים בבטן עד שמתפצל לעורקי הכסל משותפים. לשחרר את PN או LSN מsurroundinרקמות g ידי נתיחה בוטה ובצע את העצבים מחוץ לפסגת הכסל עד נקודת כניסת גחונה לL6 והעמודה S1 חוליות (לPN) או T13 ועמוד השדרה L1 (לLSN). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את תִצמוֹדֶת הערווה ותקינה ומפרקי מרחשתי עזבו, ולהסיר את עצם הכסל. חופשי בזהירות או PN או LSN מהשרירים ורקמות חיבור המצורפים מקרובים לcolorectum עד היכן העצב נכנס לעמוד השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכרות בזהירות את עצם הכסל לחשוף colorectum דיסטלי. לנתח את colorectum הדיסטלי עם PN המצורף או LSN ברצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את colorectum עם העצב המחובר לתא האמבטיה של חדר הרקמה. הסר רקמת חיבור מופרזת על ידי נתיחה נוספת, ולפתוח את colorectum longitudinally לאורך הגבול נגד mesenteric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם צד הרירי פונה כלפי מעלה, להצמיד את קצה mesenteric של colorectum הסמוך לתא ההקלטה לתוך בסיס סיליקון של chamber ולצרף את אורך antimesenteric של colorectum למגרפה של קרסים מחוברים למפעיל כוח (באיור 1 וצילם באיור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאריך את PN או LSN לתוך תא ההקלטה, אשר מחובר לתא האמבטיה על ידי חור עכבר ושער. בעדינות להניח את תא מטען העצב על מראה זכוכית קטן בתא ההקלטה, אשר מספק משטח הידרופילי לעצב לדבוק. Superfuse תא האמבטיה עם חמה (30-32 מעלות צלזיוס), מחומצן פתרון קרבס ולמלא את תא ההקלטה עם שמן מינרלים. </li></ol> הקלטת 3. Single-סיבים ולוקליזציה של שדה פתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקלף בזהירות בחזרה epineurium (נדן עצב) מPN או LSN תחת סטראו בהגדלה גבוהה (50 - 60x). באמצעות מלקחיים עדינים, להקניט את תא מטען העצב לתוך 5-8 צרורות עצבים של ~ עובי 100 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את התייחסות הפלטינה-אירידיוםהאלקטרודה במגע עם פתרון קרבס בתא הרקמה. רצף למקם את צרורות עצבים בודדות על האלקטרודה ההקלטה שנעשתה מאותו החומר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במברשת צבע רכה לעורר נקודתי גישה מafferents המעי הגס על ידי בעדינות ליטף למעלה ולמטה על פני השטח המעי הגס. אתר את צרור העצבים (ים) שמעצבב את המעי הגס דרך AP זיהוי (פוטנציאל פעולה) הקלטות. הערה: PN וLSN גם מעצבבים את שלפוחית ​​השתן ואברי אגן אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג 30 טיפים מחט G לפצל עוד יותר את צרור עצבים לחוטי צרור נאה של ~ 10 מיקרומטר עובי ולמקם את נימה אישית על גבי האלקטרודה ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האלקטרודה קונצנטריים הטה העגולה בניצב למשטח הרירי לרגש חשמלי סופים מביא בעוצמת גירוי suprathreshold (10 גודל mA, 0.5 משך msec @ 0.3 הרץ), אשר מייצרת רדיוס ~ 2 מ&quot;מ של התפשטות נוכחית. הזז את האלקטרודה באופן שיטתי (~ 1.5 מ&quot;מ צעדים) לאורכו ורוחבו של colorectum השטוח למקם סופים פתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר סוף מביא מתרגש, להתאים את המיקום האלקטרודה כדי לאתר את האתר של ההפעלה (שדה פתוח, RF) שדורש עוצמת מינימום גירוי (סף גירוי). בטל סופים עם סף גירוי&gt; 3 mA 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מהירות ההולכה (CV) מ1) המרחק בין האלקטרודה מגרה בשדה פתוח (RF) ואתר ההקלטה ו -2) עיכוב ההולכה (למשל, איור 2) בין חפץ הגירוי ותחילתו של פוטנציאל הפעולה . קורות חיים (m / sec) = מרחק (מ&quot;מ) / עיכוב הולכה (אלפיות שני). </li></ol> 4. סיווג פונקציונלי של afferents המעי הגס Mechanosensitive <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איתור RF על ידי גירוי חשמלי, חלים שלושה הגירויים מכאניים הבאים כדי RF: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל את גירוי החיטוט על ידי לחיצה על קצה calibramonofilament כמו-פריי טד פון ניילון (0.4 ו 1 כוח g) בניצב לכיוון RF על colorectum השטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל את הגירוי מלטף בעדינות על ידי מלטף את רירית המעי הגס עם גדיל קנס חוט ניילון (10 כוח מ&quot;ג) כדי ליצור לחץ גזירת משטח קטן בRF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל את המתיחה היקפית באמצעות מפעיל כוח מבוקר מחשב, אשר מספק כוח מתיחת ramped (0-170 MN ב 5 MN / sec) בכיוון היקפי לאורך הקצה אנטי-mesenteric של colorectum באמצעות המגרפה של קרסים מתוארים בשלב 2.8 . </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסווג afferents כserosal (להגיב רק כדי להקהות חיטוט), רירית (להגיב לרירית מלטפת ולהקהות חיטוט), שרירי (מגיב למתיחה היקפית ולהקהות חיטוט) שרירי / רירית (מגיב למתיחה היקפית, ליטוף הרירי ולהקהות חיטוט), או MIA (לא מגיב לכל אחת משלושת הגירויים מכאניים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לafferents mesenteric (רק בעצבוב LSN) שקשה להפעיל באופן סלקטיבי על ידי גירוי חשמלי, איתור קצוות פתוחים שלהם על ידי ליטוף מכאני / חיטוט של לפדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לafferents למתוח רגיש (-רירית שרירי שרירים ו), לקבוע את סף התגובה, אשר מוגדר ככוח המעורר את AP הראשון במתיחת ramped. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לafferents serosal, להקליט את התגובות שלהם לעולים רמות של punctate חיטוט של השדה פתוח מונע על ידי מפעיל הכוח מבוקר מחשב. </li></ol> 5. כימי יישום / אפנון של Endings פתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את התגובה בסיסית לגירוי מכאני (כלומר, תגובה למתיחת ramped, punctate חיטוט, או ליטוף הרירי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל הקצה התחתון של פיסת צינור (פליז או נירוסטה, 10 מ&quot;מ גבוה ו -4 x 4 מ&quot;מ מרובע או 2 4-5 מ&quot;מ קוטר) עם וזלין ולמקם אותו על פני השדה פתוח בcolorectum. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרפתרון קרבס בתוך צינורות, ולחשוף את הסוף פתוח במשך 3 - 5 דקות ל -170 μl של התמיסה המכילה את הכימיקל (ים) להיבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על התגובה של הביא במהלך יישום כימי (כמה afferents היא chemosensitive). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון הכימי וצינורות כדי לסיים את הפעולה של החומר הכימי. תוך 4 - 6 דקות, לבדוק את התגובה מביא לאותו גירוי מכאני כמו בתגובת תחילת המחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מחדש את הגירוי המכני שוב לאחר תקופה מספיקה של שטיפה-out (&gt; 15 דקות). </li></ol> 6. קוצים ההקלטה והאפליה AP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספרת האותות החשמליים שנרשמו מהאקסונים ב 20 קילוהרץ ולשמור את הנתונים למחשב. לפקח על האות על-ידי קו צג אודיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הקוצים AP off-line ולהפלות יחידות בודדות המבוססות על ניתוח מרכיבים עיקרי של צורות גל עלייה חדה פרט 25. הערה: שיא אחת צריך להכיל לא יותר השתי יחידות פעילים בקלות discriminable. </li></ol>

<ol>
	<li>Naliboff, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+two+distinct+perceptual+alterations+in+irritable+bowel+syndrome.">Evidence for two distinct perceptual alterations in irritable bowel syndrome.</a> Gut. 41, 505-512 (1997).</li><li>Verne, G. N., Robinson, M. E., Vase, L., Price, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+visceral+and+cutaneous+hyperalgesia+by+local+rectal+anesthesia+in+irritable+bowel+syndrome+(IBS)+patients.">Reversal of visceral and cutaneous hyperalgesia by local rectal anesthesia in irritable bowel syndrome (IBS) patients.</a> Pain. 105, 223-230 (2003).</li><li>Verne, G. N., Sen, A., Price, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarectal+lidocaine+is+an+effective+treatment+for+abdominal+pain+associated+with+diarrhea-predominant+irritable+bowel+syndrome.">Intrarectal lidocaine is an effective treatment for abdominal pain associated with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome.</a> Journal of Pain. 6, 493-496 (2005).</li><li>Chey, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linaclotide+for+irritable+bowel+syndrome+with+constipation:+a+26-week,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+trial+to+evaluate+efficacy+and+safety.">Linaclotide for irritable bowel syndrome with constipation: a 26-week, randomized, double-blind, placebo-controlled trial to evaluate efficacy and safety.</a> Am J Gastroenterol. 107, 1702-1712 (2012).</li><li>Rao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+12-week,+randomized,+controlled+trial+with+a+4-week+randomized+withdrawal+period+to+evaluate+the+efficacy+and+safety+of+linaclotide+in+irritable+bowel+syndrome+with+constipation.">A 12-week, randomized, controlled trial with a 4-week randomized withdrawal period to evaluate the efficacy and safety of linaclotide in irritable bowel syndrome with constipation.</a> Am J Gastroenterol. 107, 1714-1724 (2012).</li><li>Busby, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+properties,+metabolism,+and+disposition+of+linaclotide,+a+novel+therapeutic+peptide+approved+for+the+treatment+of+irritable+bowel+syndrome+with+constipation+and+chronic+idiopathic+constipation.">Pharmacologic properties, metabolism, and disposition of linaclotide, a novel therapeutic peptide approved for the treatment of irritable bowel syndrome with constipation and chronic idiopathic constipation.</a> J Pharmacol Exp Ther. 344, 196-206 (2013).</li><li>Mei, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+chemosensitivity.">Intestinal chemosensitivity.</a> Physiol Rev. 65, 211-237 (1985).</li><li>Mei, N., Lucchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+data+and+ideas+on+digestive+sensitivity.">Current data and ideas on digestive sensitivity.</a> J Auton Nerv Syst. 41, 15-18 (1992).</li><li>Su, X., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+pelvic+nerve+afferent+fibers+innervating+the+colon+of+the+rat+are+polymodal+in+character.">Mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat are polymodal in character.</a> J Neurophysiol. 80, 2632-2644 (1998).</li><li>McMahon, S. B., Morrison, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+neurones+with+long+projections+activated+from+the+abdominal+viscera+of+the+cat.">Spinal neurones with long projections activated from the abdominal viscera of the cat.</a> J Physiol. 322, 1-20 (1982).</li><li>Cervero, F., Sann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+evoked+responses+of+afferent+fibres+innervating+the+guinea-pig's+ureter:+an+in+vitro+study.">Mechanically evoked responses of afferent fibres innervating the guinea-pig's ureter: an in vitro study.</a> J Physiol. 412, 245-266 (1989).</li><li>Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+properties+of+pelvic+nerve+afferent+fibers+innervating+the+urinary+bladder+of+the+rat.">Mechanosensitive properties of pelvic nerve afferent fibers innervating the urinary bladder of the rat.</a> J Neurophysiol. 72, 2420-2430 (1994).</li><li>Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mechanosensitive+pelvic+nerve+afferent+fibers+innervating+the+colon+of+the+rat.">Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat.</a> J Neurophysiol. 71, 2046-2060 (1994).</li><li>Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+unmyelinated+afferent+fibres+by+mechanical+stimuli+and+inflammation+of+the+urinary+bladder+in+the+cat.">Activation of unmyelinated afferent fibres by mechanical stimuli and inflammation of the urinary bladder in the cat.</a> J Physiol. 425, 545-562 (1990).</li><li>Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+type+of+unmyelinated+chemosensitive+nociceptor+in+the+acutely+inflamed+urinary+bladder.">A novel type of unmyelinated chemosensitive nociceptor in the acutely inflamed urinary bladder.</a> Agents Actions. 25, 219-221 (1988).</li><li>Brierley, S. M., Jones, R. C., Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splanchnic+and+pelvic+mechanosensory+afferents+signal+different+qualities+of+colonic+stimuli+in+mice.">Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice.</a> Gastroenterology. 127, 166-178 (2004).</li><li>Meyer, R. A., Davis, K. D., Cohen, R. H., Treede, R. D., Campbell, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+insensitive+afferents+(MIAs)+in+cutaneous+nerves+of+monkey.">Mechanically insensitive afferents (MIAs) in cutaneous nerves of monkey.</a> Brain Res. 561, 252-261 (1991).</li><li>Handwerker, H. O., Kilo, S., Reeh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unresponsive+afferent+nerve+fibres+in+the+sural+nerve+of+the+rat.">Unresponsive afferent nerve fibres in the sural nerve of the rat.</a> J Physiol. 435, 229-242 (1991).</li><li>Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+silent+afferents+in+the+pelvic+and+splanchnic+innervations+of+the+mouse+colorectum.">Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G170-G180 (2011).</li><li>Feng, B., La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irritable+bowel+syndrome:+methods,+mechanisms,+and+pathophysiology.+Neural+and+neuro-immune+mechanisms+of+visceral+hypersensitivity+in+irritable+bowel+syndrome.">Irritable bowel syndrome: methods, mechanisms, and pathophysiology. Neural and neuro-immune mechanisms of visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G1085-G1098 (2012).</li><li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+sensitization+of+mechanosensitive+and+-insensitive+afferents+in+mice+with+persistent+colorectal+hypersensitivity.">Long-term sensitization of mechanosensitive and -insensitive afferents in mice with persistent colorectal hypersensitivity.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G676-G683 (2012).</li><li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+colorectal+afferent+function+associated+with+TNBS-induced+visceral+hypersensitivity+in+mice.">Altered colorectal afferent function associated with TNBS-induced visceral hypersensitivity in mice.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G817-G824 (2012).</li><li>Feng, B., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+stretch-sensitive+pelvic+nerve+afferents+innervating+mouse+distal+colon+and+rectum.">Differential roles of stretch-sensitive pelvic nerve afferents innervating mouse distal colon and rectum.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298, G402-G409 (2010).</li><li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+guanylate+cyclase-C+attenuates+stretch+responses+and+sensitization+of+mouse+colorectal+afferents.">Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents.</a> J Neurosci. 33, 9831-9839 (2013).</li><li>Jolliffe, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principal component analysis. , (2002).</li><li>La, J. H., Feng, B., Schwartz, E. S., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+hypertonicity+and+acidity+modulate+colorectal+afferents+and+induce+persistent+visceral+hypersensitivity.">Luminal hypertonicity and acidity modulate colorectal afferents and induce persistent visceral hypersensitivity.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G802-G809 (2012).</li><li>Christianson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plasticity+and+modulation+of+visceral+afferents.">plasticity and modulation of visceral afferents.</a> Brain Research Reviews. 60, 171-186 (2009).</li><li>Kiyatkin, M. E., Feng, B., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+genetic+and+pharmacological+inhibition+of+TRPV1+and+P2X3+attenuates+colorectal+hypersensitivity+and+afferent+sensitization.">Combined genetic and pharmacological inhibition of TRPV1 and P2X3 attenuates colorectal hypersensitivity and afferent sensitization.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G638-G648 (2013).</li><li>Brumovsky, P. R., Feng, B., Xu, L., McCarthy, C. J., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystitis+increases+colorectal+afferent+sensitivity+in+the+mouse.">Cystitis increases colorectal afferent sensitivity in the mouse.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297, G1250-G1258 (2009).</li><li>Shinoda, M., Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+and+central+P2X+receptor+contributions+to+colon+mechanosensitivity+and+hypersensitivity+in+the+mouse.">Peripheral and central P2X receptor contributions to colon mechanosensitivity and hypersensitivity in the mouse.</a> Gastroenterology. 137, 2096-2104 (2009).</li><li>Tanaka, T., Shinoda, M., Feng, B., Albers, K. M., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+visceral+hypersensitivity+by+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+family+receptor+&#945;-3+in+colorectal+afferents.">Modulation of visceral hypersensitivity by glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor &#945;-3 in colorectal afferents.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G418-G424 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בהכנת colorectum העצבים מבחנה המתוארת כאן הוכיחה להיות גישה רבת עוצמה כדי לחקור פונקציות קידוד עצביות של מעי גס afferents בודדת, אשר יפה משלימה גישות אחרות שאינם פונקציונליות (למשל מחקרים, סלולריים, מולקולריים, והיסטולוגית) על עצב סנסורי קרביים ( ראה סקירה 27</s...

כאב ורגישות יתר הם התלונות העיקריות של חולים הסובלות מהפרעות תפקודיות במערכת העיכול, כוללים תסמונת מעי רגיז (IBS), אשר קיימים בהעדר הסיבה הנראית לעין pathobiological או נזק לרקמות. לדוגמא, חולי IBS להפגין רגישות יתר, כולל תגובות מוגברות להתנפחות בלון רקטלית ורגישות מוגברת במהלך פעולת מעיים רגילה, כמו גם רגישות יתר של הפניה גופנית (כלומר, רגישות למישוש באזור הבטן) 1. בגלל מיקוד afferents מעי גס הוכיח להיות יעיל בהקלת כאב ורגישות יתר בחולי IBS (למשל, החדרה תוך-רקטלי בהרדמה מקומית 2,3; בליעה דרך הפה של linaclotide guanylate cyclase-C אגוניסט 4-6) הבנה, שיפור של עצבוב מביא של colorectum חשוב. afferents הקרביים, כולל afferents מעי גס, הם מסוגלים להגיב לשיטות כימיות / nutrient- ותרמית (למשל, 7-9). עם זאת, afferents הקרביים להגיב לגירויים מכאניים (כלומר, afferents mechanosensitive) הייתה נחקר ביותר ביסודיות כי גירויים מכאניים (למשל, התנפחות luminal, מתיחה) הם אלה שבדרך כלל להצמיח תחושות מודעים, כוללים אי נוחות וכאב 10-16. בנוסף, את הקרביים גם innervated ידי afferents מכאנית רגישה (נעדרים), בדרך כלל מכונים nociceptors שקט או שינה 17. בתנאים פיסיולוגיים נורמלים, נעדרים אינם מגיבים לגירוי מכאני או שיש לי גבוהה מאוד תגובת ספי 18, אבל יכולים להיות פעיל ולרכוש mechanosensitivity בתנאי pathophysiological ולתרום לרגישות יתר. שימוש בהכנה במבחנה והפרוטוקול המתוארת כאן, שפיתחנו ומועסקים אסטרטגית גירוי חשמלית לים<html> rch לסופים פתוחים, המאפשרים זיהוי משוחד של שני קצות mechanosensitive וMIA בcolorectum 19. עצבוב המעי הגס נובע מsplanchnic המותני (LSN) ומסלולי עצבים אגן (PN), וכולל afferents מעי גס שיכול להיות מסווגת לחמש כיתות mechanosensitive (serosal, ריריים, שרירים, שרירי-רירית, mesenteric) ואחד בכיתה MIA 20. שימוש בתכשיר זה במבחנה, מצאנו כי mechanosensitivity רכש נעדרי מעי גס (רגישות) בעקבות חשיפה קצרה של השדות פתוחים שלהם למרק דלקתי (IS), אשר רגיש 71% מנעדרים במסלול PN ו -23% מנעדרים במסלול LSN 19. אנחנו גם תיעדנו רגישות לטווח ארוך (עד 28 יום) של נעדרים בהקשר של רגישות יתר לטווח ארוך התנהגות קרביים (כלומר, בעכברים שקבלו טיפולי intracolonic עם zymosan 21 או חומצת 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic (TNBS) 22) . jove_content &quot;&gt; בין afferents mechanosensitive, afferents שרירים ושרירים-הרירית הם השיעורים היחידים שtonically לקודד מתיחה היקפית של colorectum (כלומר, הם מתיחה רגישה) וsubserve הקידוד של התנפחות מעי גס רעיל 23,24. שימוש במחשב שבשליטה כוח מפעיל, אנחנו מוחלים סטנדרטיים ואחידים, ולמתוח ramped לשחזור בכיוון ההיקפי של רקמת המעי הגס השטוחה ומסווגים נוסף afferents למתוח רגיש כנמוך סף וגבוה סף 23. בנוסף, במהלך הרגישות של הזמן למתוח afferents -sensitive לאחר zymosan intracolonic 21 או 22 TNBS טיפול מתאים לתחילה, ההתמדה, ו / או ההתאוששות של רגישות יתר קרביים התנהגות, המצביעה על תפקידו של מעי גס afferents למתוח רגיש בכאב ורגישות יתר קרביים.

<table><tbody><tr><td>Leica MZ16 stereo microscope</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica IC D camera</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>World Precision instruments, Inc.</td><td>SYS-DAM80</td><td>Low-noise differential amplifier</td></tr><tr><td>Two-compartment tissue chamber</td><td>Custom made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power1401</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td>Power1401</td><td>Data acquisition, analog signal input/out</td></tr><tr><td>Spike2 v5.02</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td></td><td>Software package that works with the Power1401</td></tr><tr><td>Audio monitor</td><td>Natus</td><td>Am 8</td><td></td></tr><tr><td>Square pulse stimulator</td><td>Natus</td><td>S48</td><td>To deliver electrical stimuli</td></tr><tr><td>Photoelectric isolation unit</td><td>Natus</td><td>PSIU6</td><td>Stimulus isolation to reduce noise</td></tr><tr><td>Concentric bipolar microelectrode</td><td>FHC Inc.</td><td>CBFFG75</td><td>To deliver electrical stimuli</td></tr><tr><td>Dual-mode lever system</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>Series 300C</td><td>To deliver mechanical stimuli</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Forceps with fine tips</td></tr></tbody></table>

in vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings

וידאו זה מדגים בפירוט פרוטוקול במבחנה חד-סיבי אלקטרו הקלטה באמצעות הכנת colorectum עצבים עכבר. הגישה מאפשרת זיהוי משוחד ואפיון פונקציונלי של afferents מעי גס בודדת. הקלטות תאית של פוטנציאלים מופצים פעולה (APS) שמקורם אחד או כמה מביא (כלומר, חד-סיבים) שדות פתוחים (RFS) בcolorectum עשויים מסיבי עצב fascicles הקניט. Colorectum מוסר גם עם האגן (PN) או עצב splanchnic המותני (LSN) מצורף ופתח longitudinally. הרקמה ממוקמת בחדר הקלטה, הצמיד את שטוח וperfused עם פתרון קרבס מחומצן. גירוי חשמלי מוקד משמש כדי לאתר את קצוות מביא המעי הגס, אשר נבדקו על ידי שלושה נוספות גירויים מכאניים שונים (להקהות חיטוט, ליטוף הרירי ומתיחה היקפית) לסווג תפקודי afferents לחמש mechanosensiשיעורים מופרזים. סופים מגיבים לאף אחד מגירויים מכאניים אלה מסווגים כafferents מכאנית שאינו רגישה ל( נעדרים). שני mechanosensitive והנעדרים ניתן להעריך ולרגישות (כלומר תגובה משופרת סף,, מופחת, ו / או רכישה של mechanosensitivity) על ידי חשיפה מקומית של RFS לכימיקלים (למשל, מרק דלקתי (IS), קפסאיצין, אדנוזין טריפוספט (ATP)). אנו מתארים את הציוד והכנת הקלטת colorectum עצבים, קציר של colorectum עם PN המצורף או LSN, זיהוי של RFS בcolorectum, ההקלטה חד-סיבים מfascicles העצב, ויישום מקומי של כימיקלים לRF. בנוסף, אתגרים של ההכנה והיישום של גירוי מכאני סטנדרטי גם דנו.

ההתקנה מתוארת באיור 1. הוא כולל תא רקמת מחוייט כי בתי colorectum בתא מרחץ מצופה סיליקון והעצב המצורף בתא מלא שמן מינרלים רציפים. התא דו-התא היה במכונה מגוש מוצק של פלסטיק אקרילי על ידי מכונת CNC; החלק התחתון של שני התאים היה מצופה לאחר מכן עם סיליקון המוצק כדי לאפשר ס...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings at JoVE.com

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

באפיון פונקציונלי מבחנה של עכבר המעי הגס מביא Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

in-vitro-functional-characterization-mouse-colorectal-afferent

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

9.5K Views.  University of Pittsburgh. This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation. 

Video: In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

Flexible Colonoscopy in Mice to Evaluate the Severity of Colitis and Colorectal Tumors Using a Validated Endoscopic Scoring System

The use of modern endoscopy for research purposes has greatly facilitated our understanding of gastrointestinal pathologies. In particular, experimental endoscopy has been highly useful for studies that require repeated assessments in a single laboratory animal, such as those evaluating mechanisms of chronic inflammatory bowel disease and the progression of colorectal cancer. However, the methods used across studies are highly variable. At least three endoscopic scoring systems have been published for murine colitis and published protocols for the assessment of colorectal tumors fail to address the presence of concomitant colonic inflammation. This study develops and validates a reproducible endoscopic scoring system that integrates evaluation of both inflammation and tumors simultaneously. This novel scoring system has three major components: 1) assessment of the extent and severity of colorectal inflammation (based on perianal findings, transparency of the wall, mucosal bleeding, and focal lesions), 2) quantitative recording of tumor lesions (grid map and bar graph), and 3) numerical sorting of clinical cases by their pathological and research relevance based on decimal units with assigned categories of observed lesions and endoscopic complications (decimal identifiers). The video and manuscript presented herein were prepared, following IACUC-approved protocols, to allow investigators to score their own experimental mice using a well-validated and highly reproducible endoscopic methodology, with the system option to differentiate distal from proximal endoscopic colitis (D-PECS).

Over the past few years, new generation endoscopes have emerged as important diagnostic research aids for evaluating murine colitis and colorectal tumors. We present herein a detailed protocol for endoscopic assessment of inflammation and colorectal tumors in mice, as well as a novel scoring system that uses decimal identifiers to document the endoscopic severity of colitis and colorectal tumors.

קולונוסקופיה גמישה בעכברים כדי להעריך את חומרת קוליטיס ומעי הגס גידולים באמצעות מערכת Validated אנדוסקופי ניקוד

The use of modern endoscopy for research purposes has greatly facilitated our understanding of gastrointestinal pathologies. In particular, experimental ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

<em&gt; חוץ גופייה</em&gt; הכנה של נוירונים enteric המבודדים וגליה ממקלעת Myenteric של העכבר הבוגר

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Neuroscience

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

הקלטה משולב של תוויות מסוף פלט ועצב מבחינה מכנית מאולצת מביא ב Endings עכבר זקיק השיער אזמלי

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the different organ systems from the periphery towards the central nervous system. As such, the increased activity or &#39;sensitization&#39; of mesenteric afferent nerves has been allocated an important role in the pathophysiology of visceral hypersensitivity and abdominal pain syndromes.
Mesenteric afferent nerve activity can be measured in vitro in an isolated intestinal segment that is mounted in a purpose-built organ bath and from which the splanchnic nerve is isolated, allowing researchers to directly assess nerve activity adjacent to the gastrointestinal segment. Activity can be recorded at baseline in standardized conditions, during distension of the segment or following the addition of pharmacological compounds delivered intraluminally or serosally. This technique allows the researcher to easily study the effect of drugs targeting the peripheral nervous system in control specimens; besides, it provides crucial information on how neuronal activity is altered during disease. It should be noted however that measuring afferent neuronal firing activity only constitutes one relay station in the complex neuronal signaling cascade, and researchers should bear in mind not to overlook neuronal activity at other levels (e.g., dorsal root ganglia, spinal cord or central nervous system) in order to fully elucidate the complex neuronal physiology in health and disease.
Commonly used applications include the study of neuronal activity in response to the administration of lipopolysaccharide, and the study of afferent nerve activity in animal models of irritable bowel syndrome. In a more translational approach, the isolated mouse intestinal segment can be exposed to colonic supernatants from IBS patients. Furthermore, a modification of this technique has been recently shown to be applicable in human colonic specimens.

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

Mesenteric afferent nerves convey information from the gastrointestinal tract towards the brain regarding normal homeostasis as well as pathophysiology. Gastrointestinal afferent nerve activity can be assessed by mounting isolated intestinal segments with attached afferent nerves into an organ bath, isolating the nerve, and assessing basal as well as stimulated activity.

במבחנת ההקלטה של פעילות עצבית Mesenteric מביא עכבר Jejunal ופלחים גסים

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

במבחנה אפיון של המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות של סיבי מביא שטיפת המעי הגס בחולדות

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

Advanced Imaging of Dorsal Root Ganglion Neurons for Sensory Modality Research

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the protocol for in vivo calcium imaging of the exposed DRG in response to various visceral and somatic stimuli. Pirt-GCaMP6s mice or C57BL6 mice intrathecally injected with AAV viruses packaged with GCaMP6s were utilized to capture Ca2+ transients. The amplitude of these transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. Afferent fibers originate from internal organs, with primary neuronal cell bodies in spinal or vagal ganglia. Studies on visceral nociception and acupuncture analgesia can potentially be conducted on primary sensory neurons using advanced imaging technologies like in vivo calcium imaging, allowing for the recording of neuronal activity ensembles in the intact animal during stimulation or intervention. The responses of DRG neuron ensembles to somatic and visceral stimuli applied to their corresponding receptive fields were recorded. This technique illustrates how neuronal populations react to various types of somatic and visceral stimuli. It is possible to comprehensively compare neuronal ensemble responses to different stimuli, which is a particularly valuable approach in research on visceral pain and segmental mechanisms of somatic stimulation, such as acupuncture.

The present protocol outlines in vivo calcium imaging for measuring the responses of ensembles of lumbar-6 DRG neurons to somatic and visceral stimuli. Thorough comparisons can be made among neurons responding to different stimuli. This protocol is valuable for investigating mechanisms of visceral pain and somatic stimulation, such as acupuncture.

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the ...

Functional Assessment of Intestinal Tight Junction Barrier and Ion Permeability in Native Tissue by Ussing Chamber Technique

The Ussing chamber technique was first invented by the Danish scientist Hans Ussing in 1951 to study the transcellular transport of sodium across frog skin. Since then, this technique has been applied to many different tissues to study the physiological parameters of transport across membranes. The Ussing chamber method is preferable to other methods because native tissue can be used, making it more applicable to what is happening in vivo. However, because native tissue is used, throughput is low, time is limited, and tissue preparation requires skill and training. These chambers have been used to study specific transporter proteins in various tissues, understand disease pathophysiology such as in Cystic Fibrosis, study drug transport and uptake, and especially contributed to the understanding of nutrient transport in the intestine. Given the whole epithelial transport process of a tissue, not only transepithelial pathways, but also paracellular pathways are important. Tight junctions are a key determinant of tissue specific paracellular permeability across the intestine. In this article, the Ussing chamber technique will be used to assess paracellular permselectivity of ions by measuring transepithelial conductance and dilution potentials.

Intestinal epithelium confers not only nutrient absorption but protection against noxious substances. The apical-most epithelial intercellular junction, i.e., the tight junction, regulates paracellular solute and ion permeability. Here, a protocol for the preparation of mucosal sheets and assessment of the ion selectivity of tight junctions using Ussing chamber technique is described.

הערכה פונקציונלית של מחסום צומת הדוק מעיים וחדירות יון ברקמה המקומית על ידי טכניקת הקאמרית של ברית המועצות

The Ussing chamber technique was first invented by the Danish scientist Hans Ussing in 1951 to study the transcellular transport of sodium across frog ...

Biology

Mouse Ileal Loop Model: A Surgical Model to Study Intestinal Permeability in the Mouse

Source: Boerner, K., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/62093">Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the generation of an ileal loop model to study intestinal permeability in a mouse model. This method provides a live model to understand the epithelial barrier function and consequent immune response.

מודל Mouse Ileal Loop: מודל כירורגי לחקר חדירות המעי בעכבר

Source: Boerner, K., et al. Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Rodent Models

Adult

Electrophysiological Recording from Colonic Afferent Nerves in an Ex Vivo Rat Colon

Source: Meng, Y. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56090">In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates a method to record the activity of colonic afferent nerves in an ex-vivo rat colon, cannulated at both ends and infused with saline to increase intraluminal pressure. As pressure increases, the nerve signal rises, indicating its stimulation.

הקלטה אלקטרופיזיולוגית מעצבי המעי הגס במעי הגס Ex Vivo Rat

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in an Ex Vivo Mouse Jejunum Segment

In this procedure, using a micromanipulator, lower the tip of the suction electrode into the organ bath. Then, gently aspirate some Krebs solution from the organ bath so that the tip of the electrode is submerged in the Krebs solution. Ensure that the Krebs solution covers the wire electrode inside the suction electrode.
Next, position the tip of the suction electrode immediately next to the transected afferent nerve strand, and draw the transected nerve strand into the capillary over its entire length. Maneuver the tip of the electrode towards the adipose tissue, and aspirate it into the glass capillary with the plunger, thereby mechanically sealing the nerve in the capillary from the contents of the organ bath.
To verify the recording of afferent nerve activity, perform a ramp distension-induced increase in afferent firing by closing the output port to lead to a gradual rise in pressure in the intestinal segment. Only perform the desired experimental protocol when three consecutive ramp distensions yield a reproducible multi-unit discharge.

באפיון פונקציונלי מבחנה של עכבר המעי הגס מביא Endings

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video