Name: whole-cell currents induced by puff application of gaba in brain slices
Uploaded: 2017-10-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices at JoVE.com

המחברים רוצה להודות הארגונים הבאים: הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31171018, 31171355), מדע, טכנולוגיה החלוקה של גואנג-דונג (2013KJCX0054), בסיס מדעי הטבע של בפרובינצית גואנג-דונג ( 2014A030313418, 2014A030313440), ואת גואנגג'ואו מדע, טכנולוגיה הלשכה (201607010320).

דיור חיה ובהמה כל הניסויים נערכו בהתאם לנהלים אושרו על ידי ועדת האתיקה לחקר בעלי חיים באוניברסיטה רגילה סין דרום, על פי הנחיות חיה אכפת שהוקם על ידי המכון הלאומי של בריאות-
 1. ההכנה של פתרונות <ol><li>להכין 500 מל סטנדרטי מלאכותי השדרתי (כלנית חדד) המכיל את הרכיבים שמתואר שלנו עבודה שפורסמה 7 כמפורט בטבלה 1.
	<ol><li>זכוכית נקי שימוש בקבוקונים עם מים יונים להכין פתרון חנה המבר טריים. יבש לפני השימוש כדי להוסיף NaH NaCl, אשלגן כלורי, ונקי שפכטלים עם מים יונים 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-גלוקוז, ולהוסיף את CaCl 2 לאחר נתקל מבעבע הפתרון עם 95% O 2 / 5% CO 2 התערובת ~ 20 דקות (כמו טבלה מפורטת ב 1) 500 מ של מים יונים. מערבבים עד להתמוססות מלאה.</li>
		<li>ודא חנה המבר אינו לגמרי נקה ללא משקעים כלשהם. ואז להתאים את ה-pH ל 7.2-7.4. בועה עם תערובת גז המורכבת של 95% O 2 ו- 5% CO 2 ~ 20 דק...</li>
	</ol></li> <li>להכין 250 מ של פתרון חיתוך פרוסה המכיל כימיקלים 7 המתוארות בטבלה 2.
	<ol><li>להוסיף אשלגן כלורי, MgCl 2, 2 PO NaH 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-גלוקוז, להוסיף CaCl 2 אחרונה כמצוין ב 1.1.1, 250 מ של מים יונים, להתמוסס כפי שמתואר ב 1.1.1 ו 1.1.2.</li>
		<li>לאחר שמבעבע עם 95% O 2 / 5% CO 2, המקום הפתרון במקפיא למשך 15-20 דקות כך הפתרון חיתוך הופך קר כקרח, קפוא חלקית. 
		הערה: אנו משתמשים פתרון חיתוך זה בעת ביצוע פרוסות מהחודש 1-2-עכברים הישן; הנוסחה עשויים להיות שונים עבור עכברים שגילן עולה על 2 חודשים-</li>
		<li>LPS להכין פתרון על ידי המסת בתוך תמיסת מלח ללא אנדוטוקסין מול סטרילי (0.9% NaCl). LPS הוא מנוהל intraperitoneally (0.5 מ ג/ק ג) ולהתחיל הקלטה שעתיים מאוחר יותר.</li>
	</ol></li></ol> 2. הכנה של פרוסת קליפת המוח הקדם חזיתית <ol><li>הפתרון חיתוך מוציאים מהמקפיא, homogenize כדי להשיג את הרפש. למקם את הפתרון על קרח, בועה כל הזמן עם 95% O 2 / 5% CO 2.</li>
	<li>באמצעות מספריים גדולים, חדה, במהירות לערוף עכבר כפי שמתואר 9, מיד לשים את הראש לתוך גביע מלא קפואים (0-4 ° C) חיתוך פתרון.</li>
	<li>העליון של הגולגולת לאורך הקו האמצעי בכיוון סימטרית-כדי-אפיים עם מספריים בסדר גזורה להסיר את החלקים הגולגולת לרוחב. מסירים את המוח עם מרית בסדר, ירידה אל תוך קר כקרח חיתוך פתרון. 
	הערה: השלבים 2.2-2.3 חייב להיעשות במהירות (אידיאלי &#60; 1 דקות).</li>
	<li>במקום את המוח על המכסה של צלחת פטרי 9 ס מ מלא קרח. יש לשטוף את המוח עם פתרון חיתוך קר כקרח. לחתוך את המוח ואת הריח הנורה עם סכין גילוח.</li>
	מחזיק <li>החל הדבק דבק מגע אל הדגימה vibratome. בזהירות המקום הרחוב המוח על המסירה של דבק, rostral לקצה, ואני מיד לטבול בתמיסה קרה כקרח חיתוך.</li>
	<li>להתאים בעל להב vibratome כדי זווית של 15° ביחס במישור האופקי ולהכין 350-מיקרומטר פרוסות המוח הילתית (תדר הרטט להב = 85 הרץ, מהירות = 0.1 מ מ/s).</li>
	<li>משתמש של פיפטה, העברת הפרוסות לחדר התאוששות מלאה כלנית חדד, דגירה עבור 1 h (RT) עם בעבוע מתמדת של 95% O 2 / 5% CO 2.</li>
</ol> 3. הקלטה תיקון שלם-תא micropipettes <ol><li>להפוך זכוכית בורוסיליקט עבור משתמשים כמו הקלטה אלקטרודות או פחזנית micropipettes על פי הנחיות ספציפיות במדריך מבצע פולר. הקלטה אלקטרודות, עצה התנגדויות הן בטווח 4-6 מ' &#8486;, בעוד עלים micropipettes יש עצה קטרים בטווח של 2-5 מיקרומטר.</li>
	<li>להוסיף חוסם ערוץ Na + (TTX, 1 מיקרומטר), רחוב Na + מהיר ערוץ ובכך פוטנציאל פעולה, כדי כלנית חדד, לשמור על קצב זרימה מתמדת של פתרון זה של 2-3 mL/min בתא ההקלטה, על ידי משאבת סחרור לתוך החדר שאיפה מזה. בועה של כלנית חדד עם 95% O 2 / 5% CO 2 כל הזמן כדי להבטיח את הכדאיות של הפרוסות.</li>
	<li>העברת פרוסה המוח אל החדר הקלטה באמצעות פיפטה פסטר ששונה עצה בסדר אשר נחתך כדי להתאים את גודל הפרוסה. לכסות את הפרוסה עם עוגן פרוסה פלטינה עם חוטי ניילון מקבילים במרווחים &#8805; 2 מ מ לגזרים, להחזיק את הפרוסה על הרציף.</li>
	<li>למלא את micropipette הקלטה עם הפתרון הפנימי 7 (טבלה 3), ולמלא את micropipettes עלים עם GABA-10 מיקרומטר, 50 מיקרומטר, ו 100 מיקרומטר (מומס כלנית חדד), או חנה המבר כפקד הרכב.</li>
	<li>כדי למנוע סתימה עם פסולת, החל לחץ חיובי קל באמצעות מזרק 1 מ"ל לפני הטבעית האלקטרודה הקלטה ב חנה המבר. שימוש של micromanipulator תחת מיקרוסקופ (עדשה המטרה x 4), מקם את ההקלטה אלקטרודה ואת פאף micropipette כך הטיפים מופיעים במרכז של תמונת הוידיאו על המסך ( איור 1 א').</li>
	<li>להתאים את המוקד מיקרוסקופ (40 x עדשה המטרה) תוך כדי הנמכת בהדרגה את micropipette עלים ומניחים אותו מעל נוירון הקלטה בזווית של 45°. שמור על המרחק בין קצה micropipette עלים נוירון שנרשם בין 20-40 µm ( איור 1 B). לאט ובזהירות לגשת הנוירון עם האלקטרודה הקלטה ולאחר מכן שחרר את הלחץ. החלת יניקה חלש ולא קצרה דרך הצנרת מחובר למחזיק אלקטרודה ליצירת גושפנקה גיגה אוהם.</li>
	<li>שמור על המתח ב 0 mV. לאחר היווצרות החותם גיגה אוהם, לפצות על מהר ולאט קיבוליות באופן ידני או אוטומטי. לאחר מכן החל יניקה קצר וחזק דרך הצנרת הנ ל כדי להגיע למצב השלם-תא.</li>
	מצב <li>eIPSC רשומה במתח-קלאמפ. חלות לחץ דלק נמוך (חנקן, 4-6 psi) micropipette עלים באמצעות Picospritzer הנשלט על-ידי גנרטור שלב מתח מאסטר 8 כדי לספק יחיד או מזווג גאבא פחזניות ( איור 2).</li>
	<li>לשנות את המשך עלים כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר eIPSC ( איור 3) ולמדוד את eIPSC במודל דיכאון LPS-induced ( איור 4).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres.">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li><li>Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+used+for+studying+synaptic+transmission+in+slices+of+mammalian+brain.">Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain.</a> Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).</li><li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+hyperactivity+recruits+microglial+processes+via+neuronal+NMDA+receptors+and+microglial+P2Y12+receptors+after+status+epilepticus.">Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus.</a> J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).</li><li>Dickinson, G. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+determining+the+recruitment+of+inositol+trisphosphate+receptor+channels+during+calcium+puffs.">Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs.</a> Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Columnar+distribution+of+activity+dependent+gabaergic+depolarization+in+sensorimotor+cortical+neurons.">Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons.</a> Mol Brain. 5, 33 (2012).</li><li>Glykys, J., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+main+source+of+ambient+GABA+responsible+for+tonic+inhibition+in+the+mouse+hippocampus.">The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus.</a> J Physiol. 582, 1163-1178 (2007).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+modulates+KCC2+expression+and+function+in+hippocampal+GABAergic+inhibition.">APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+interleukin-1+and+endotoxin+in+the+forced+swim+and+tail+suspension+tests+in+mice.">Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice.</a> Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).</li><li>Engel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+Patch-clamp+Recordings+from+the+Somatodendritic+Domain+of+Nigral+Dopamine+Neurons.">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Wondolowski, J., Frerking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit-dependent+postsynaptic+expression+of+kainate+receptors+on+hippocampal+interneurons+in+area+CA1.">Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1.</a> J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).</li><li>Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+regulates+Cav1.2+L-type+calcium+channel+levels+and+function+to+influence+GABAergic+short-term+plasticity.">Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity.</a> J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).</li><li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+Cortical+GABAergic+Dysfunction+Contributes+to+Aberrant+UP-State+Duration+in+APP+Knockout+Mice.">Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice.</a> Cereb Cortex. , (2016).</li><li>Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine+Acts+through+Nicotinic+Receptors+to+Enhance+the+Firing+Rate+of+a+Subset+of+Hypocretin+Neurons+in+the+Mouse+Hypothalamus+through+Distinct+Presynaptic+and+Postsynaptic+Mechanisms.">Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms.</a> eNeuro. 2 (1), (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

עלים היישום נעשה שימוש נרחב כדי להעריך את קולטן postsynaptic פונקציה3,4,7, אך דורש שליטה מדויקת ניסוי. נתאר כאן הליך לערב שלם-תא תיקון מחבר חובק למעקה, אשר מדגים ש-GABA-פאף המושרה IPSCs (קרי eIPSCs) פרוסות המוח הקדם חזיתית בקליפת המוח. התנגדותם של האלקטרוד?...

הטכניקה תיקון-קלאמפ, כלי ראשי עבור חוקרים אותות חשמליים בנוירונים, פותחה בשנות ה-701,2. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מספקת ידע על טיפולים כמה ספציפית (למשל, תרופתי) רשאית לשנות פונקציות עצביים או ערוצים בזמן אמת3. תרופתי הערכה של תפקוד במהלך הקלטת בפרוסה במוח תאים כל דורש היישום של תרופות, כגון אגוניסטים או היריבים של רצפטורים ספציפיים, כדי הנוירונים מוקלטת. שיטה זו מאפשרת זיהוי שינויים עצביים להתרחש בעקבות בקשה של תרופה ספציפית, ובכך מוביל הבנה טובה יותר של מאפיינים פיזיולוגיים ופתולוגיים של נוירונים4. למרות ניהול תרופתי יכול להתבצע באמצעות גם זלוף5 או עלים6, האחרון הוא טכניקה מעולה. בפרט: (i) פחזנית יישומים במהירות מגביר סמים ריכוז סביב מוקלטת הנוירון לרמה כזאת הפחתת רגישות של קולטני ממברנה נמנעת; (ii) את עוצמת הקול של סמים נשענתי הוא נמוך ביותר, כך שקיימת השפעה מועטה על הפתרון אמבט, ולפיכך מפחית תופעות בלתי רצויות של הכימיקלים מנוהלת על פרוסות המוח; (iii) פרוטוקול עלים ניתן להגדיר ונשמר, ביצוע הניסוי ברמת דיוק גבוהה ביותר לשחזור; (iv) עלים יישום מייצג שימוש חסכוני אגוניסטים/antagonists, במיוחד כאלה ריאגנטים איפה יקר או קשה להשיג.
כאן, אנו נתמקד להקליט זרמים שלמים-תא המושרה על-ידי נשיפת גאבא פרוסות המוח בחריפות מוכן, הכנה זה יש את היתרון של מעגלים המוח יחסית שמור היטב. התנהלותינו פאף-induced זרמי מעכבות7 שמתואר במאמר זה. באמצעות צסיום (Cs+)-מבוסס פתרונות פנימי, והחזקת הנוירונים ב 0 mV, תציג לנו גאבא. פאף עורר זרמי postsynaptic מעכבות (eIPSCs) עם הפרטים הטכניים המתאימים. באמצעות מודל של העכבר של דיכאון הנגרם על ידי הזרקת ליפופוליסכריד (LPS)8, אנו מראים את eIPSC משרעת עורר על ידי שאיפה גאבא פוחת באופן משמעותי בפרוסות של הזרקת LPS עכברים לעומת הרכב שולט. הכוונה שלנו היא כי מאמר זה צריך להראות איך הטכניקה עלים ישימה באופן נרחב על מחקרים שמטרתם הערכת ההשפעה של כימיקלים, תרכובות או סמים על הפעילות העצבית במוח פרוסות.

<table><tbody><tr><td>Glass Borosilicate micropipettes</td><td>Shutter Instruments</td><td>BF150-86-10</td><td>1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter</td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Shutter Instruments</td><td>MODEL P-97&amp;nbsp;</td><td>Flaming/Brow Micropipette Puller</td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Shutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Computer controlled Amplifier&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Digital Acquisition system&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Camera</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>2115001</td><td>Inspection equipment</td></tr><tr><td>Microscopy&amp;nbsp;</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>Eclipse FN1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Master 8</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master-8 Pulse stimulator</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Slicer</td><td>Leica</td><td>VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Gillette</td><td>74-S</td><td>FLYING EAGLE</td></tr><tr><td>Video monitor</td><td>Panasonic</td><td>WV-BM 1410</td><td></td></tr><tr><td>502 Glue</td><td>Deli</td><td>7146</td><td>Cyanoacrylate Glue</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Shanghai JIA PENG Corporation</td><td>BT100-1F</td><td></td></tr><tr><td>Video Camera</td><td>Olympus America Medical</td><td>OLY-150</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipets</td><td>Biologix</td><td>30-0138A1</td><td></td></tr></tbody></table>

whole-cell currents induced by puff application of gaba in brain slices

ניהול תרופתי הוא נפוץ בעת עריכת תיקון שלם-תא-הקלטה לפרוסות המוח קלאמפ. אחת השיטות הטובות ביותר של יישום סמים במהלך ההקלטה אלקטרופיזיולוגיות היא הטכניקה פאף, אשר יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של ריאגנטים תרופתי על הפעילות העצבית במוח פרוסות. היתרון הגדול ביותר של יישום פאף הוא כי ריכוז התרופה סביב האתר הקלטה מגביר במהירות, ובכך למנוע הפחתת רגישות של קולטני ממברנה. שימוש מוצלח של יישום עלים כרוך תשומת-לב רבה הרכיבים הבאים: ריכוז התרופה, הפרמטרים של micropipette עלים, המרחק בין הקצה של micropipette עלים, נוירון מוקלט, וכן את משך הזמן ואת הלחץ נהיגה אצלם (פאונד לאינץ ' מרובע, psi). מאמר זה מתאר הליך שלב אחר שלב עבור הקלטה זרמים שלמים-תא המושרה על-ידי נשיפת גאמא אמינו בוטירית (GABA) אל נוירון פרוסת קליפת המוח הקדם חזיתית. ראוי לציין, ניתן להחיל את ההליך עם שינויים מזעריים באזורים אחרים במוח כגון ההיפוקמפוס סטריאטום את, תכשירים שונים, כגון תרביות תאים.

הטכניקה עלים מאפשר לחוקרים לחקור את השפעת הסמים על קולטנים מסוימים על פני השטח של נוירון מסוים. במאמר זה, אנו מתמקדים זרמי מתווך על ידי קולטני GABA. איור 1 מציג את micropipettes הקלטה של עלים. כדי למנוע השפעה על נוירונים מוקלטות של הלחץ הפיזי שנוצר על ידי והגראס, חנה...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices at JoVE.com

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

זרמים שלמים-תא המושרה על ידי יישום עלים של GABA במוח פרוסות

אנו מתארים את הטכניקה פאף, שלפיו ריאגנטים תרופתי יכול להינתן במהלך ההקלטה תאים כל תיקון-קלאמפ, להאיר היבטים שונים של תכונות חיוניות להצלחתו.

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

whole-cell-currents-induced-puff-application-gaba-brain

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.3K Views.  South China Normal University. אנו מתארים את הטכניקה פאף, שלפיו ריאגנטים תרופתי יכול להינתן במהלך ההקלטה תאים כל תיקון-קלאמפ, להאיר היבטים שונים של תכונות חיוניות להצלחתו.

Video: Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, respectively 4,5,6,7 The GABAA channel is a pentameric GABA-gated chloride channel. The channel subunits are grouped into 8 families (&alpha;1-6, &beta;1-3, &gamma;1-3, &delta;, &#949;, &theta;, &pi; and &rho;). Two alphas, two betas and one 3rd subunit form the functional channel 8. By combining studies of sub-type specific GABA-activated single-channel molecules with studies including all populations of GABAA channels in the neuron it becomes possible to understand the basic mechanism of neuronal inhibition and how it is modulated by pharmacological agents.
We use the patch-clamp technique 9,10 to study the functional properties of the GABAA channels in alive neurons in hippocampal brain slices and record the single-channel and whole-cell currents. We further examine how the channels are affected by different GABA concentrations, other drugs and intra and extracellular factors. For detailed theoretical and practical description of the patch-clamp method please see The Single-Channel Recordings edited by B Sakman and E Neher 10.

We use the patch-clamp technique to measure GABA-activated single-channel currents (GABAA channels, GABAA receptors) and the synaptic and tonic currents they generate in neurons. Activation of the channels decreases neuronal excitability in health and disease 1,2,3,4.

GABA המופעל זרמים ערוץ בודד וטוניק פרוסות המוח עכברוש

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

פורסים אותו חם: אקוטי למבוגרים מוח חיתוך בטמפרטורה פיזיולוגית

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the identification of novel molecules active in preclinical assays from an in vitro recombinant receptor to their pharmacological effects at native receptors in rodent brain slices. For compounds binding at the benzodiazepine site of the receptor, the first step is to set up a primary screen that consists of developing radioligand binding assays on cell membranes expressing the major GABAA subtypes. Then, taking advantage of the heterologous expression of rodent and human GABAA receptors in Xenopus oocytes or HEK 293 cells, it is possible to explore, in electrophysiological assays, the physiological properties of the different receptor subtypes and the pharmacological properties of the identified compounds. The Xenopus oocyte system will be presented here, starting with the isolation of the oocytes and their microinjection with different mRNAs, up to the pharmacological characterization using two-electrode voltage clamps. Finally, recordings conducted in rodent brain slices will be described that are used as a secondary physiological test to assess the activity of molecules at their native receptors in a well-defined neuronal circuit. Extracellular recordings using population responses of multiple neurons are demonstrated together with the drug application.

Here, we present protocols to discover compounds active at GABAA receptors, from the binding to the physiology and pharmacology.

שיטות הגילוי של תרכובות הרומן להתכוונן קולטן גאמא אמינו בוטירית הקלד עצבית

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue

Controlling seizures remains a challenging issue for the medical community. To make progress, researchers need a way to extensively study seizure dynamics and investigate its underlying mechanisms. Acute seizure models are convenient, offer the ability to perform electrophysiological recordings, and can generate a large volume of electrographic seizure-like (ictal) events. The promising findings from acute seizure models can then be advanced to chronic epilepsy models and clinical trials. Thus, studying seizures in acute models that faithfully replicate the electrographic and dynamical signatures of a clinical seizure will be essential for making clinically relevant findings. Studying ictal events in acute seizure models prepared from human tissue is also important for making findings that are clinically relevant. The key focus in this paper is on the cortical 4-AP model due to its versatility in generating ictal events in both in vivo and in vitro studies, as well as in both mouse and human tissue. The methods in this paper will also describe an alternative method of seizure induction using the Zero-Mg2+ model and provide a detailed overview of the advantages and limitations of the epileptiform-like activity generated in the different acute seizure models. Moreover, by taking advantage of commercially available optogenetic mouse strains, a brief (30 ms) light pulse can be used to trigger an ictal event identical to those occurring spontaneously. Similarly, 30 - 100 ms puffs of neurotransmitters (Gamma-Amino Butyric Acid or glutamate) can be applied to the human tissue to trigger ictal events that are identical to those occurring spontaneously. The ability to trigger ictal events on-demand in acute seizure models offers the newfound ability to observe the exact sequence of events that underlie seizure initiation dynamics and efficiently evaluate potential anti-seizure therapies.

Acute seizure models are important for studying the mechanisms underlying epileptiform events. Furthermore, the ability to generate epileptiform events on-demand provides a highly efficient method to study the exact sequence of events underlying their initiation. Here, we describe the acute 4-aminopyridine cortical seizure models established in mouse and human tissue.

חניכה הדור, על פי דרישה חריפה פעילות התקפי. מכרסם, רקמה אנושית

Controlling seizures remains a challenging issue for the medical community. To make progress, researchers need a way to extensively study seizure dynamics ...

Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect distinct cellular and network components of these circuits remains unclear. Ex vivo brain slices provide a means by which investigators may probe discrete components of complex networks and disentangle potential mechanisms underlying the effects of volatile anesthetics on evoked responses. To isolate potential cell type- and pathway-specific drug effects in brain slices, investigators must be able to independently activate afferent fiber pathways, identify non-overlapping populations of cells, and apply volatile anesthetics to the tissue in aqueous solution. In this protocol, methods to measure optogenetically-evoked responses to two independent afferent pathways to neocortex in ex vivo brain slices are described. Extracellular responses are recorded to assay network activity and targeted whole-cell patch clamp recordings are conducted in somatostatin- and parvalbumin-positive interneurons. Delivery of physiologically relevant concentrations of isoflurane via artificial cerebral spinal fluid to modulate cellular and network responses is described.

Ex vivo brain slices can be used to study the effects of volatile anesthetics on evoked responses to afferent inputs. Optogenetics are employed to independently activate thalamocortical and corticocortical afferents to non-primary neocortex, and synaptic and network responses are modulated with isoflurane.

הפעלה אופטוגנטית של מסלולים אפרנטיים בפרוסות מוח וויסות תגובות על ידי הרדמה נדיפה

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

פרוסות היפוקמפוס אופקיות של מוח העכבר

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Recording Whole-Cell Currents with GABA Puffing in a Mouse Brain Slice

Source: Feng, Y. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56387">Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the recording of whole-cell currents induced by gamma-aminobutyric acid, or GABA, in a mouse prefrontal cortical brain slice. Controlled delivery of GABA opens chloride channels in a postsynaptic neuron, generating inhibitory postsynaptic currents, or IPSCs. These IPSCs increase with higher GABA concentrations, reflecting GABA&#39;s inhibitory activity on synaptic transmission.

הקלטת זרמים של תאים שלמים עם התנשפות GABA בפרוסת מוח של עכבר

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Preparation of Solutions

	...