המחברים מודים מרית Warrer על סיוע טכני מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הדנית למחקר עצמאי | מדעי הטבע [1323-00343B], קרן המחקר הלאומי הדני [DNRF120].

<ol>
	<li>Varshney, U., Lee, C. -. P., RajBhandary, U. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+aminoacylation+levels+of+tRNAs+in+vivo.+Application+to+studying+recognition+of+Escherichia+coli+initiator+tRNA+mutants+by+glutaminyl-tRNA+synthetase.">Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).</li><li>Sorensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel(+)+and+Rel(-)+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Kr&#252;ger, M. K., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoacylation+of+hypomodified+tRNAGlu+in+vivo.">Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo.</a> J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).</li><li>Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Mu&#241;oz-G&#243;mez, A. J., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNA+is+highly+unstable+during+early+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).</li><li>Enriquez, J. A., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+aminoacylation-induced+conformational+changes+in+human+mitochondrial+tRNAs.">Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).</li><li>Parker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+and+alternatives+in+reading+the+universal+genetic+code.">Errors and alternatives in reading the universal genetic code.</a> Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).</li><li>Traxler, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global,+ppGpp-mediated+stringent+response+to+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).</li><li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNAs+Mediate+the+Rapid+Adaptation+of+Escherichia+coli+to+Oxidative+Stress.">Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress.</a> PLoS Genet. 11 (6), e1005302 (2015).</li><li>Kane, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rare+codon+clusters+on+high-level+expression+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli.">Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).</li><li>Baca, A. M., Hol, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+codon+bias:+a+method+for+high-level+overexpression+of+Plasmodium+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli.">Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li><li>Li, S., Pelka, H., Schulman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anticodon+and+discriminator+base+are+important+for+aminoacylation+of+Escherichia+coli+tRNA+(Asn).">The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn).</a> J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).</li><li>Rizzino, A. A., Freundlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+in+vivo+aminoacylation+by+periodate+oxidation:+tRNA+alterations+and+iodate+inhibition.">Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition.</a> Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).</li><li>Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Zhou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+reference+genes+for+quantifying+transcriptional+responses+of+Escherichia+coli+to+protein+overexpression+by+quantitative+PCR.">Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 18 (2011).</li><li>Jacobson, A., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+events+occurring+during+recovery+from+prolonged+glucose+starvation+in+Escherichia+coli.">Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).</li><li>McCarthy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+magnesium+starvation+on+the+ribosome+content+of+Escherichia+coli.">The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).</li><li>Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+ribosome+degradation+during+starvation+in+Escherichia+coli.">Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli.</a> Rna. 15 (5), 977-983 (2009).</li><li>Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+degradation+in+growing+bacteria.">Ribosome degradation in growing bacteria.</a> EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).</li><li>Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependency+on+medium+and+temperature+of+cell+size+and+chemical+composition+during+balanced+grown+of+Salmonella+typhimurium.">Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium.</a> J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+ppGpp+decrease+the+RNA+chain+growth+rate.+Implications+for+protein+synthesis+and+translational+fidelity+during+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Curtailing+of+the+Stringent+Response+by+Toxin-Antitoxin+Module-Encoded+mRNases.">Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases.</a> J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד בו זמנית את רמת הטעינה ספציפי e. coli tRNAs ולהשוות רמות היחסי של tRNAs בדגימות שונות. נקודות קריטיות של הפרוטוקול הם 1) להתמודד עם הדגימות בצורה כזאת, כי רמת טעינה סלולארית tRNA נשמרות, 2) לנרמל את סינתזת כמויות כך שניתן יהיה להשוות בצורה אמינה רמות היחסי tRNA בדגימות שו?...

הבאות, אנו מציגים שיטה לכימות tRNAs ספציפיים, מדידת הטעינה שלהם רמות על ידי סופג בצפון '. השיטה מבוססת על טכניקה שפותחה על ידי. Varshney et al. 1. מאת קציר תאים לתוך חומצת חומץ טריכלור (TCA) ולשמור את הדגימות ב-0 מעלות צלזיוס במהלך הטיהור RNA, אסתר הקשר בין של tRNA, חומצת אמינו ביותר הוא שנשמרת2,3,4. Aminoacylated tRNAs ניתן להבדיל בין המקבילים nonacylated על ידי אלקטרופורזה בג'ל סופג בצפון, בשל ניידות ירידה של aminoacylated סינתזת הג'ל, הנגרמת על ידי חומצת אמינו מאוגד covalently5. בנוסף, אנו מציגים עבור נרמול tRNA כמויות על ידי תוספת של ספייק תאים overexpressingselC tRNA נדירות 4פרוטוקול.
tRNAs הם חלק המולקולות הנפוץ ביותר של התא חיידקי לבין תפקיד חיוני ביותר של מכונות תרגום. tRNAs לאגד חומצות אמינו ומעבירים אותם אל הריבוזומים התרגום. הכריכה של חומצות אמינו כדי tRNAs (aminoacylation או טעינה) בהנחייתם של aminoacyl tRNA synthetases. שפע יחסי של tRNAs טעון שונים חשוב להבטחת נאמנותם של סינתזת חלבונים, כי underrepresentation של cognate טעונה ש-trna עבור codon RNA שליח נתון (mRNA) מגבירה את הסבירות tRNA בקרבת מקום ל- cognate בטעות לספק שלו חומצת אמינו פוליפפטיד גוברת על הריבוזום6. החשיבות של tRNA טעונה באה לידי ביטוי נרחב התגובה של תא החיידק ירידה חמורה ברמות טעינה של tRNA; התגובה מחמירים. במהלך התגובה מחמירים הסינתזה של tRNAs, ribosomal RNAs mRNAs רוב הוא הוריד לטובת שעתוק של mRNAs ספציפיים הקשורים ההישרדות ביוסינטזה ומתח חומצת אמינו, קצב גדילת התאים היא יורדת באופן דרמטי7 . יתר על כן, עבודה על-ידי, ואחרים הראו כי e. coli פעיל מבזה הרוב המכריע של tRNA שלה בתגובה מדגיש כי להגביל תרגום4,8, רומז כי ייתכן ההתאמה של רמות tRNA חשוב להתמודדות עם לחצים כזה. לפיכך, אמין מדידות של רמות tRNA abundances וטעינה יהיה כלי חשוב להבנת מלא תגובות הלחץ חיידקי.
E. coli הוא נפוץ לבטא חלבון רקומביננטי, עקב הבדלים השימוש codon בין המינים, שיוצרת הביטוי הוא בעיה בפני9. זה אוכל מצויין הביטוי של tRNAs נוספים הדרושים כדי לתרגם את ה-mRNA רקומביננטי10. מדידות של tRNA טעינה רמות זנים כאלה יכול להנחות המאמצים לפתרון בעיות ולעזור למטב את ביטוי חלבון.
שיטה זו גם מאפשרת הגילוי של "mischarging"; מולקולת tRNA aminoacylated חומצה אמינו בלתי-cognate. Aminoacylation על ידי חומצות אמינו שונות עלולה לגרום של tRNA להעברת במהירויות שונות במקצת דרך לזיהוי ג'לים1,11. במקרים מסוימים, השיטה יכולה לשמש גם כדי להבחין בין דפוסי השינוי שונה על tRNAs אחרת זהה3.
עוד הקים הליך הביוכימי עבור החקירה של tRNA טעינה רמות הוא periodate חמצון. השיטה מסתמכת על התצפית כי aminoacylated tRNA מוגן מפני periodate חמצון ואינו tRNA לא טעונים. אחרי periodate חמצון טיפול לחידוש tRNA משמש להערכת רמת הטעינה הרנ א שנקטפו. עם זאת, לחידוש מספר tRNAs הוכח להיות מושפעות הטיפול ובכך לספק כמה דיוקים12. השיטה המוצגת כאן אמצעים טעינה ישירות מ- RNA מטוהרים, ובכך לא כולל שום הטיות של תגובות כימיות או אנזימטיות. מגבלה אחת של שיטה זו היא ובדיו tRNA אחד בלבד מזוהה בכל פעם, כך למרות הצפוני אותו כתם יכול להיות חשוף reprobed עבור tRNAs מרובות, זה במידת מה ההגדרה המפורטת לאסוף נתונים על tRNAs רבים.
דרך אמינה של נורמליזציה דוגמאות לשני חיוני בלימודי שבו המטרה היא להשוות בין רמות היחסי של מולקולה מדגמים שונים. כאן נסקור תהליך הנורמליזציה של רנ א שבו aliquot קטן של תאים e. coli overexpressing את סינתזת נדירselC נוסף של ספייק-in כל הדגימות ניסיוני לפני טיהור RNA. שיטה זו שימושית לא רק בעת בחינת tRNAs אך על כימות היחסי של כל המינים של RNA כאשר הגדרת הניסוי הוא כזה כי אין RNA אנדוגני ניתן לבטוח יהיה להציג ריכוז הסלולר זהה כל הדגימות. לדוגמה, הרמה של "משק", כמו ה-RNA ribosomal RNA משמשת לעתים קרובות כמו הפניה אנדוגני להשוות כמויות יחסיות של RNA אחר בין שונים דוגמאות13. אבל זה לא ממש עוזר אם ריכוז RNA הפניה הסלולר משתנה בין דגימות, יכול להיות המקרה ribosomal RNA אם הדגימה מתרחשת במהלך16,17 15,התגובה מתח או במהלך כניסתו נייחים שלב17. התוספת של ספייק תאים כדי הדגימות ניסיוני לפני טיהור RNA מספק דרך מלא ומדויק של נרמול עצמאית של ההתקנה הדגימה. דרך נוספת של סטנדרטיזציה היא התוספת של אחד או יותר בספייק RNAs כדי הדגימות ניסיוני לאחר טיהור RNA. עם זאת, שיטה זו לא בחשבון ההבדלים ב RNA שחזור בין הדגימות.
באמצעות תאים e. coli overexpress את ההפניה RNA כמו ספייק תאים (ראה איור 1) בניסוי ב e. coli הוא החיסרון שנוצר זה בנוסף של כמות קטנה של אקסוגני e. coli סה כ RNA ל דוגמאות. אנחנו תקן עבור תוספת זו על-ידי ניתוח מדגם המכיל רק ספייק תאים במקביל הדגימות ניסיוני (ראה הצפוני כתם במסלול איור 2, עם התווית "selC"). פרוטוקול הציג זה פותח עבור e. coli K-12 אך צפוי להיות ישימים עבור רוב המינים חיידקי.

<table><tbody><tr><td>Urea</td><td>Merck</td><td>57-13-6</td><td>Purity &gt;99%</td></tr><tr><td>Polyacrylamide</td><td>Serva</td><td>79-06-7</td><td></td></tr><tr><td>Bis (N,N&#039;-Methylene-bis-acrylamide)</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0201</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid (TCA)</td><td>Sigma</td><td>76-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Merck</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Citrate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herring Sperm DNA</td><td>Sigma</td><td>100403-24-5</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polivinylpyrrolidone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P32 &amp;gamma;ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA oligos (probes)</td><td>TAG Copenhagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybond N&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; membrane</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroblotter</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000 Scanner</td><td>GE Healthcare</td><td>28955809</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydridization oven</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geiger-M&amp;uuml;ller tube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphor imager screen</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybridization tube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Culture Flasks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantification of the abundance and charging levels of transfer rnas in escherichia coli

רנ א העברה (tRNA) היא חלק חיוני של מכונות translational ב מכל יצור. tRNAs לאגד, להעביר חומצות אמינו הריבוזום התרגום. רמות היחסי של tRNAs שונים, ואת היחס בין aminoacylated tRNA ל tRNA סה כ, המכונה רמת הטעינה, הם גורמים חשובים בקביעת את הדיוק ואת המהירות של תרגום. לכן, השפע ואת רמות טעינה של tRNAs הם משתנים חשובים כדי למדוד כשלמדתי סינתזה של חלבון, לדוגמה בתנאים מתח שונים. כאן, אנו מתארים שיטה קציר tRNA ומדידת ישירות את השפע היחסי והן לרמה טעינה המוחלטת של מינים tRNA ספציפי של Escherichia coli. סינתזת האיסוף-כך הקשר יציב בין סינתזת של חומצת אמינו שלה נשמר. ה-RNA ואז נענשים בג'ל, צפון סופג, שתוצאתה הפרדה tRNAs טעון, לא טעונים. ניתן להשוות את הרמות של tRNAs ספציפיים בדגימות שונות בשל התוספת של ספייק תאים עבור נרמול. לפני טיהור RNA, נוסיף 5% של תאים e. coli תאגידי ענק בינלאומיים tRNAselC נדירים כדי כל דגימה. כמות המינים tRNA עניין במדגם ואז מנורמל לסכום של tRNAselC במדגם זהה. תוספת של ספייק תאים לפני טיהור RNA יש היתרון על תוספת של מטוהרים ספייק-in RNAs זה הוא גם מהווה ההבדלים יעילות פירוק התא בין הדגימות.

באמצעות ההליך המתואר כאן, השפע וטעינה רמות של tRNAs שלושה נמדדו ב e. coli K-12 לפני ובמהלך חומצת אמינו הרעבה.
Auxotroph ארגינין זן NF9154 (חמישי leu שלו טוב thi mtl supE44) הוא גודל לפחות עשרה דורות במדיום מינימלי MOPS בתוספת גליצרול 0.4% 50 תראו...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli at JoVE.com

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

כאן אנו מציגים שיטה למדידת ישירות RNA העברה טעינה רמות מטוהרים Escherichia coli RNA, כמו גם כדרך להשוות בין רמות היחסי של העברת RNA, או כל RNA קצרים אחרים, מדגמים שונים בהתבסס על התוספת של ספייק-in תאים המבטאים גנים התייחסות.

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

quantification-abundance-charging-levels-transfer-rnas-escherichia

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

9.2K Views.  University of Copenhagen. כאן אנו מציגים שיטה למדידת ישירות RNA העברה טעינה רמות מטוהרים Escherichia coli RNA, כמו גם כדרך להשוות בין רמות היחסי של העברת RNA, או כל RNA קצרים אחרים, מדגמים שונים בהתבסס על התוספת של ספייק-in תאים המבטאים גנים התייחסות.

Video: Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Genetics

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for protein synthesis by translating codons in mRNA into amino acid sequences. tRNAs were long considered as house-keeping molecules that lacked regulatory functions. However, a growing body of evidence indicates that cellular tRNA levels fluctuate in correspondence to varying conditions such as cell type, environment, and stress. The fluctuation of tRNA expression directly influences gene translation, favoring or repressing the expression of particular proteins. Ultimately comprehending the dynamic of protein synthesis requires the development of methods able to deliver high-quality tRNA profiles. The method that we present here is named SPOt, which stands for Streamlined Platform for Observing tRNA. SPOt consists of three steps starting with metabolic labeling of cell cultures with radioactive orthophosphate, followed by guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction of radioactive total RNAs and finally hybridization on in-house printed macroarrays. tRNA levels are estimated by quantifying the radioactivity intensities at each probe spot. In the protocol presented here we profile tRNAs in Mycobacterium smegmatis mc2155, a nonpathogenic bacterium often used as a model organism to study tuberculosis.

We describe an original transfer RNA analysis platform named SPOt (Streamlined Platform for Observing tRNA). SPOt simultaneously measures cellular levels of all tRNAs in biological samples, in only three steps, and in less than 24 hours.

תיוג מטבולית, יצירת פרופילים של RNAs העברה באמצעות Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

ניתוח דינמיקת tRNA באמצעות AQRNA-seq

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate quantification of the pool of small RNAs. The AQRNA-seq library preparation procedure described here involves the use of custom-designed sequencing linkers and a step for reducing methylation RNA modifications that block reverse transcription processivity, which results in an increased yield of full-length cDNAs. In addition, a detailed implementation of the accompanying bioinformatics pipeline is presented. This demonstration of AQRNA-seq was conducted through a quantitative analysis of the 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG harvested on 5 selected days across a 20-day time course of nutrient deprivation and 6 days of resuscitation. Ongoing efforts to improve the efficiency and rigor of AQRNA-seq will also be discussed here. This includes exploring methods to obviate gel purification for mitigating primer dimer issues after PCR amplification and to increase the proportion of full-length reads to enable more accurate read mapping. Future enhancements to AQRNA-seq will be focused on facilitating automation and high-throughput implementation of this technology for quantifying all small RNA species in cell and tissue samples from diverse organisms.

מחבר זרקור: תפקיד AQRNA-seq במיפוי רנ"א קטן וחשיפת מנגנוני תרגום חלבונים

Absolute quantification RNA sequencing (AQRNA-seq) is a technology developed to quantify the landscape of all small RNAs in biological mixtures. Here, both the library preparation and data processing steps of AQRNA-seq are demonstrated, quantifying changes in the transfer RNA (tRNA) pool in Mycobacterium bovis BCG during starvation-induced dormancy.

AQRNA-seq לכימות רנ"א קטן

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of this method, in comparison to other approaches, is its ability to monitor translation by precisely mapping the position and number of ribosomes on a mRNA transcript.
In this article, we describe the consecutive stages of sample collection and preparation for RIBO-seq method in bacteria, highlighting the details relevant to the planning and execution of the experiment.
Since the RIBO-seq relies on intact ribosomes and related mRNAs, the key step is rapid inhibition of translation and adequate disintegration of cells. Thus, we suggest filtration and flash-freezing in liquid nitrogen for cell harvesting with an optional pretreatment with chloramphenicol to arrest translation in bacteria. For the disintegration, we propose grinding frozen cells with mortar and pestle in the presence of aluminum oxide to mechanically disrupt the cell wall. In this protocol, sucrose cushion or a sucrose gradient ultracentrifugation for monosome purification is not required. Instead, mRNA separation using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by the ribosomal footprint excision (28-30 nt band) is applied and provides satisfactory results. This largely simplifies the method as well as reduces the time and equipment requirements for the procedure. For library preparation, we recommend using the commercially available small RNA kit for Illumina sequencing from New England Biolabs, following manufacturer&#39;s guidelines with some degree of optimization.
The resulting cDNA libraries present appropriate quantity and quality required for next generation sequencing (NGS). Sequencing of the libraries prepared according to the described protocol results in 2 to 10 mln uniquely mapped reads per sample providing sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is quick and relatively easy and can be performed with standard laboratory equipment.

Here we describe the stages of sample collection and preparation for RIBO-seq in bacteria. Sequencing of the libraries prepared according to these guidelines results in sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is simple, uses standard laboratory equipment and takes seven days from lysis to obtaining libraries.

RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene transcripts from infected tissues. Pathogen RNA constitutes a tiny portion of the total RNA isolated from infected tissue samples. Both microarray and RNAseq technologies have difficulties in generating reliable reads for weakly expressed pathogen genes. Mutant pathogen strains with reduced in vivo proliferation pose an even bigger challenge. Here we describe an in vivo gene expression profiling protocol that is very fast, extremely sensitive and highly reproducible. We developed this protocol during our investigation of the fungal pathogen Candida albicans in a murine model of hematogenously disseminated candidiasis. Using this protocol, we have documented time courses of dynamically regulated C. albicans gene expression during kidney infection, and discovered unexpected features of gene expression responses to antifungal drug treatment in vivo.

We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

פרופיל ביטוי גנים של חיידקים הדבקה באמצעות פלטפורמה דיגיטלית ברקוד

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

Immunology and Infection

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

הגנום כולו ניתוח (טעינה) רמות Aminoacylation של tRNA שימוש microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

תיוג מטבולית, יצירת פרופילים של RNAs העברה באמצעות Macroarrays

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

AQRNA-seq לכימות רנ"א קטן

AQRNA-seq לכימות רנ"א קטן

AQRNA-seq לכימות רנ"א קטן

RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

פרופיל ביטוי גנים של חיידקים הדבקה באמצעות פלטפורמה דיגיטלית ברקוד

הגנום כולו ניתוח (טעינה) רמות Aminoacylation של tRNA שימוש microarrays