Name: detection of enterohemorrhagic escherichia coli colonization in murine host by non-invasive in vivo bioluminescence system
Uploaded: 2018-04-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System at JoVE.com

אנו להכיר את צ'י-צ'אנג צ'ן מן המחלקה של מחקר רפואי, המרכז הרפואי של מיי צ'י (איחוד האמירויות הערביות) על העזרה עכבר, זיהום, והתמיכה מהמרכז חיות מעבדה של האוניברסיטה הלאומית צ'נג קונג. עבודה זו נתמכת על ידי שר המדע, הטכנולוגיה (רובם) מעניקה (ביותר 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011,-005 and106-2321-B-006) CC.

זהירות: EHEC O157:H7 היא רמת אבטחה 2 (BSL-2) פתוגן לפי המרכז לבקרת הוראה אבטחה ובקרה מחלות ומניעתן (CDC) (https://www.cdc.gov/). לכן, יש לבצע בכל ההליכים ניסיוני מעורבים EHEC במתקן BSL-2. ללבוש חלוקי מעבדה וכפפות בעת ביצוע הניסוי. עובד מוסמך אבטחה cabinet (BSC). לחטא את הספסל ניסיוני לפני ואחרי ההליך ניסיוני עם 70% אתנול. כל מכשירים או ציוד EHEC קשר (או קשר פוטנציאלי) צריכים להיות נקיים עם 70% אתנול או אקונומיקה. פסולת מזוהמים (או שעשויות להיות מזוהמים) צריך להיות אטום בלוק בקפידה. ללבוש מסיכה, הגנה העין, כפפות כפול או סרבל, במידת הצורך. העכברים נקבה בת שבוע 6-C57BL/6 היו נרכש ומתוחזק באוניברסיטה מעבדה חיה מרכז של הלאומית צ'נג קונג (NCKU). הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של NCKU (אישור מס ' 104-039).
1. Bioluciferase-מתויג EHEC חיידקים דור
<ol><li>חומצה deoxyribonucleic ng לערבב 50 (DNA), 1 μL כל של 10 μM קדימה ולהפוך תחל μL 2 2.5 מ מ deoxynucleotides (dNTPs), 2 μL 10 x מאגר, 0.2 μL DNA פולימראז ומים סטרילי מזוקק פעמיים (ddH2O) באמצעי אחסון הסופי של μL 20 כדי להגביר אנטי-kanamycin קלטת, ג'ין nptII 24. תבנית ה-DNA נמצא pBSL18024, אשר נרכש מן הפרויקט הלאומי BioResource (NBRP). PCR התנאים המפורטים בטבלה 1, הרצף פריימר זמין בטבלה מס ' 2.</li>
	<li>מאתרים ומפסיקים את המוצרים PCR וקטור שיבוט מסחרי בעקבות הערכה פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>בלו השבר ג'ין nptII מן הווקטור שיבוט NsiI , מרק פורטנוי ותשכפלי לתוך pBBR1MCS4, אשר הוא מתעכל על ידי NsiI ואת ScaI pAKlux29 כדי ליצור את פלסמיד kanamycin עמידים, pWF27813.</li>
	<li>לסלק את אופרון luxCDABE , מן לוציפראז לבטא פלסמיד9, pAKlux2, על-ידי SpeI-HF ו ScaI ו שיבוט SpeI-HF , מרק פורטנוי מתעכל pWF278 כדי להפיק kanamycin עמיד ו לוציפראז לבטא פלסמיד, pWF27913. הערה: את הקוד שיחולץ פלסמיד, את purifications פרגמנט נכרת, להשתמש החילוץ פלסמיד מסחרי ערכת חילוץ ג'ל, בהתאמה. עבור אנזים עיכול, לערבב 100 נג ה-DNA, מאגר 1 של 10 x μL, μL 1 של כל אנזים הגבלה שנבחר, ו- ddH סטרילי2O את הנפח הכולל של 10 μL, דגירה ב 37 ° C עבור 2.5-3 h.</li>
	<li>להפוך את פלסמיד pWF279 e. coli O157:H7 EDL933 תאים המוסמכת על ידי אלקטרופורציה עם 2,500 V עבור 4 ms.</li>
	<li>דגירה תאי חיידקים טרנספורמציה במדיום לוריא-Bertani (LB) 1 מ"ל ב 37 ° C עבור 1 h.</li>
	<li>צלחת את החיידקים על צלחת אגר LB בתוספת 50 µg/mL של kanamycin ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16-18 h.</li>
	<li>בדוק את האות ביולומנאסן של הצלחת על ידי של ויוו הדמיה מכונת למחרת. לבחור מושבה בודדת מהצלחת, תרבות זה ב 3 מ ל LB בתוספת 50 µg/mL kanamycin ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16-18 h.</li>
	<li>הכן חיידקי בינוני מניות על ידי דילול גליצרול 100% ב- ddH סטרילי2O כדי להפוך את הפתרון גליצרול 30%.</li>
	<li>הקפאת kanamycin עמיד חיידקים O157:H7 EDL933 e. coli מסתירים את פלסמיד לוציפראז כמו מניה חיידקי ב cryovial קאפ בורג כמו יחס 1:1 של חיידקים תרבות, 30% גליצרול פתרון ב- 80 ° C הריכוז הסופי של גליצרול הוא 15%.</li>
</ol>2. ביולומנאסן EHEC חיידקים לקראת חיסון אוראלי
הערה: ציר תרשים הזרימה של ההליכים ניסיוני עבור העכבר gavage אוראלי והכנה EHEC מוצג באיור 1 כדי לסייע בהכנה ניסיוני.
<ol><li>רצף של e. coli O157:H7 EDL933 החיידקים מחסה לוציפראז פלסמיד על גבי צלחת אגר ליברות עם 50 kanamycin µg/mL במלאי-80 ° C. לגדל את החיידקים במשך 16-18 h ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לבחור מושבה בודדת מ צלחת לילה והתרבות 3 מ ל LB בינוני עם 50 kanamycin µg/mL עבור 16-18 h בחממה 37 ° C-220 סל"ד.</li>
	<li>תת-תרבות החיידקים (דילול מטריים) לתוך kanamycin (50 µg/mL) המכיל ציר ליברות עבור 2.5-3 ש ח בחודש חממה 37 ° C-200 סל ד. (למשל, להוסיף 2 מ"ל תרבותי בין לילה לחיידקים בינוני 200 מ ל LB עם kanamycin (50 µg/mL) בתוספת).</li>
	<li>דגירה החיידק עבור 2.5-3 h ולמדוד את הערך צפיפות אופטית 600 nm (OD600) עד שהערך הוא בין 0.9 ל- 1. המספר תא החיידק הוא על צפיפות של-108 המושבה ויוצרים יחידות (CFU) / mL.</li>
	<li>Centrifuge חיידקים בתרבית מחדש ב g 8,000 x למשך 30 דקות, 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>למחוק את תגובת שיקוע מבלי לזעזע את צניפה של חיידקים ולשטוף את גלולה עם 100 מ ל 0.9% תמיסת סטרילית על ידי עצבנות עדין.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.5 ו- 2.6 פעם אחת.</li>
	<li>לאחר כביסה, centrifuge התרבות חיידקי ב 8000 g x במשך 30 דקות, 4 ° C ולמחוק את תגובת שיקוע בעדינות.</li>
	<li>מעובה בגדר ב 100-fold עם תמיסת מלח סטרילית 0.9%. למשל, אם 200 מ ל חיידקים הם centrifuged, להוסיף 2 מ ל תמיסת להשעות את גלולה.</li>
	<li>לאשר את החיידקים CFU (זה צריך להיות בערך μL CFU/1009 10 לאחר עיבוי בתוך תמיסת מלח רגיל) על ידי ציפוי חיידקים מרוכזת באמצעות דילול טורי 10-fold25.</li>
</ol>3. העכבר Gavage אוראלי של EHEC
<ol><li>פנקו נקבה בת שבוע 6 C57BL/6 עכברים במים סטרפטומיצין (5 g/L) עבור 24 שעות.</li>
	<li>לאחר 24 שעות, לעבור שתייה רגילים עבור עוד 24 שעות לפני gavage. לאחר טיפול עם מים סדירה במשך 24 שעות ביממה, העכברים מוכנים gavage אוראלי של EHEC.</li>
	<li>למלא את המזרק עם 100 μL EHEC חיידקים על ידי למשוך בחזרה על הבוכנה. ודא אין בועות אוויר במזרק. הסר את הבועות על ידי הצמדת את המזרק עם האצבעות.</li>
	<li>הרם לחיה בעדינות ומניחים אותו על גג הכלוב עם טיפול.</li>
	<li>לתפוס את העכבר בזנב בקפידה, החיה לאחוז העליון של הכלוב ולנסות לעבור משם.</li>
	<li>בעדינות לרסן את העכבר על-ידי אחיזה של עור רפוי בצוואר וגב החיה עם האגודל והאצבע כדי למנוע את הראש של העכבר זז.</li>
	<li>החזק את העכבר בצורה מאונכת את המחט gavage ולהבטיח את שראשו של העכבר היא קיבוע ואנכי.</li>
	<li>את המחט gavage לתוך הפה העכבר בעקבות גג הפה והזז לתוך הוושט, לכיוון הבטן.</li>
	<li>כאשר המחט שנוסף הוא חצי או שני שלישים האורך העכבר, להזריק את החיידקים EHEC μL 100, אשר מכילים כ 109 CFU תאים.</li>
</ol>4. ויזואליזציה
<ol><li>לאחר gavage הפה, לזהות את האותות ביולומנאסן בימים 1 ו-2.</li>
	<li>לפני שבחן את האותות ביולומנאסן של בעלי חיים, עזים ומתנגד להם על ידי לשים אותם לתא של 2.5% איזופלוריין עם חמצן 1.5 ליטר/דקה.</li>
	<li>חכו 2-5 דקות עד עכברים כל להיות מודע, תפסיקי לזוז. בעלי חיים מוכנים ויוו גילוי של ביולומינסנציה.</li>
	<li>זיהוי של תמונה אותות ביולומנאסן של בעלי חיים על ידי יישום ויוו מערכת הדמיה. נא עיין בסעיף 5 "קירור והקפאה" לתפעול התוכנה. במהלך תהליך ההדמיה, כל החיות נמצאים תחת אספקה מתמשכת של 2.5% איזופלוריין עם חמצן 1.5 ליטר/דקה.<ol>
<li>לחץ על קובץ > חי, באופן ידני למקד על העכבר.</li>
		<li>בחר את עוצמת לייזר וזמן החשיפה.</li>
		<li>לחץ על רכוש > ללכוד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור ex-vivo הדמיה, המתת חסד העכברים מאת נקע בצוואר הרחם ולהסיר את המעי כולו של עכברים נגועים. למקם את המעיים 9 ס מ פטרי התמונה באמצעות ה ויוו מערכת הדמיה. ההגדרה היא זהה ויוו הדמיה רק בתחום התצוגה מוגדרת בתור A/B. לקבלת פרטים, עיין בסעיף 5 "קירור והקפאה". הערה: השיטה נקע בצוואר הרחם: לרסן את העכברים על גג הכלוב על ידי לתפוס את הזנב עם יד אחת כך החיות לאחוז את הכלוב. הצב עט מרקר או את האגודל והאצבע הראשון של היד השנייה נגד האחורי של הצוואר בבסיס הגולגולת. מהר לדחוף קדימה עם היד או אובייקט בעת הרחקה בראש ומשוך לאחור עם היד מחזיק את הזנב. בדוק מקרוב כדי לאשר דום נשימה, דופק.</li>
</ol>5. קירור והקפאה
הערה: התוכנה ששימשה עבור רכישת נתונים מפורט בטבלה של חומרים.
<ol><li>עבור רכישת התמונה, פתח את לוח הבקרה רכישה של התוכנה (איור 2).</li>
	<li>בחר "זורח", "צילום", ו "כיסוי".</li>
	<li>הגדרת זמן החשיפה בתור "אוטומטי". הגדר Binning כמו "בינוני".</li>
	<li>להגדיר פונקציות צפיפות/עצירה 1 עבור זורח ו- 8 עבור התמונה. פקדים פונקציות צפיפות/להפסיק כמות האור שקיבל גלאי CCD.</li>
	<li>הגדר את שדה הראיה בהתבסס על השדה של תמונות כי הם עניין לרכוש. האפשרות "D" ניתן להתאים עכברים 6 בת חמש, תמונה אותם כל באותו זמן. "C" אפשר תמונה שלושה עכברים בת שבוע 6 בשדה אחד.</li>
	<li>לאחר הדגימות העכברים/מוכן עבור הדמיה, לחץ על "רכוש" עבור רכישת התמונה.</li>
	<li>פתח את נתוני התמונה שנרכשה.</li>
	<li>פתח את החלונית ' הכלי ' הלוח (איור 3).</li>
	<li>בחר כלים ROI. אנו ממליצים על העיגול (אחד השמאלי ביותר) טווח האזור מייצרים אור על תמונות (איור 4).</li>
	<li>לחץ על "מדד ROIs" (סמל העיפרון) כדי למדוד את עוצמת מייצרים אור פני השטח (איור 3). לוח רועי המידות והערכים כימות מופיעים (איור 5).</li>
	<li>השתמש המדידה להגדיר על הפינה השמאלית של הפאנל רועי מדידות כדי לבחור הערכים/המידע הדרוש (איור 6), אחרת לחץ על "לייצא" לייצא את טבלת הנתונים ולשמור בתור קובץ csv (איור 5).</li>
	<li>להשתמש את הערכים בעמודה "סך השטף (p/s)" כימות עוצמת מייצרים אור בקובץ. csv.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pennington, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+O157.">Escherichia coli O157.</a> Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).</li><li>Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shiga+toxins+and+the+pathophysiology+of+hemolytic+uremic+syndrome+in+humans+and+animals.">Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals.</a> Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).</li><li>Tarr, P. I., Gordon, C. A., Chandler, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shiga-toxin-producing+Escherichia+coli+and+haemolytic+uraemic+syndrome.">Shiga-toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uraemic syndrome.</a> Lancet. 365 (9464), 1073-1086 (2005).</li><li>Obrig, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+Shiga+Toxin+Mechanisms+of+Action+in+Renal+Disease.">Escherichia coli Shiga Toxin Mechanisms of Action in Renal Disease.</a> Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).</li><li>Nguyen, Y., Sperandio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterohemorrhagic+E.+coli+(EHEC)+pathogenesis.">Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) pathogenesis.</a> Front Cell Infect Microbiol. 2, 90 (2012).</li><li>Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+monitoring+of+in+vivo+colonization+and+clearance+dynamics+by+light-emitting+bacteria.">Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria.</a> Methods Mol Biol. 574, 137-153 (2009).</li><li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases.">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cell Microbiol. 9 (10), 2315-2322 (2007).</li><li>Rhee, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+spatial+and+temporal+colonization+of+enteropathogenic+E.+coli+and+enterohemorrhagic+E.+coli+in+mice+using+bioluminescent+in+vivo+imaging.">Determination of spatial and temporal colonization of enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli in mice using bioluminescent in vivo imaging.</a> Gut Microbes. 2 (1), 34-41 (2011).</li><li>Karsi, A., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+host+range+fluorescence+and+bioluminescence+expression+vectors+for+Gram-negative+bacteria.">Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria.</a> Plasmid. 57 (3), 286-295 (2007).</li><li>Lane, M. C., Alteri, C. J. S., Smith, S. N., Mobley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+flagella+is+coincident+with+uropathogenic+Escherichia+coli+ascension+to+the+upper+urinary+tract.">Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (42), 16669-16674 (2007).</li><li>Roxas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterohemorrhagic+E.+coli+alters+murine+intestinal+epithelial+tight+junction+protein+expression+and+barrier+function+in+a+Shiga+toxin+independent+manner.">Enterohemorrhagic E. coli alters murine intestinal epithelial tight junction protein expression and barrier function in a Shiga toxin independent manner.</a> Lab Invest. 90 (8), 1152-1168 (2010).</li><li>Siragusa, G. R., Nawotka, K., Spilman, S. D., Contag, P. R., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Real-Time Monitoring of Escherichia coli O157:H7 Adherence to Beef Carcass Surface Tissues with a Bioluminescent Reporter. , (1999).</li><li>Kuo, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+the+Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+Core+LPS+Biosynthesis+Enzyme+RfaD+Confers+Hypersusceptibility+to+Host+Intestinal+Innate+Immunity+In+vivo.">Mutation of the Enterohemorrhagic Escherichia coli Core LPS Biosynthesis Enzyme RfaD Confers Hypersusceptibility to Host Intestinal Innate Immunity In vivo.</a> Front Cell Infect Microbiol. 6, 82 (2016).</li><li>Wiles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+specificity,+colonization+and+clearance+dynamics+in+vivo+following+oral+challenges+with+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium.">Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Cell Microbiol. 6 (10), 963-972 (2004).</li><li>Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium.">In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infect Immun. 74 (9), 5391-5396 (2006).</li><li>Contag, C. H., Contag, P. R., Mullins, J. I., Spillman, S. D., Stevenson, D. K., Benaron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).</li><li>Hardy, J., Francis, K. P., DeBoer, M., Chu, P., Gibbs, K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+replication+of+Listeria+monocytogenes+in+the+murine+gall+bladder.">Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder.</a> Science. 303 (5659), 851-853 (2004).</li><li>Kaniga, K., Sory, M. P., Delor, I., Saegerman, C., Limet, J. N., Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Yersinia+enterocolitica+in+Murine+and+Bovine+Feces+on+the+Basis+of+the+Chromosomally+Integrated+luxAB+Marker+Gene.">Monitoring of Yersinia enterocolitica in Murine and Bovine Feces on the Basis of the Chromosomally Integrated luxAB Marker Gene.</a> Appl Environ Microbiol. 58 (3), 1024-1026 (1992).</li><li>Trcek, J., Fuchs, T. M., Trulzsch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Yersinia+enterocolitica+invasin+expression+in+vitro+and+in+vivo+using+a+novel+luxCDABE+reporter+system.">Analysis of Yersinia enterocolitica invasin expression in vitro and in vivo using a novel luxCDABE reporter system.</a> Microbiology. 156 (Pt 9), 2734-2745 (2010).</li><li>Morin, C. E., Kaper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+stabilized+luciferase-expressing+plasmids+to+examine+in+vivo-induced+promoters+in+the+Vibrio+cholerae+vaccine+strain+CVD+103-HgR.">Use of stabilized luciferase-expressing plasmids to examine in vivo-induced promoters in the Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 57 (1), 69-79 (2009).</li><li>Law, R. J., Gur-Arie, L., Rosenshine, I., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+model+systems+for+studying+enteropathogenic+Escherichia+coli+infections.">In vitro and in vivo model systems for studying enteropathogenic Escherichia coli infections.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (3), a009977 (2013).</li><li>Ritchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+Infection.">Animal Models of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection.</a> Microbiol Spectr. 2 (4), EHEC-0022-2013 (2014).</li><li>Chou, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+O157:H7+Shiga-like+toxin+1+is+required+for+full+pathogenicity+and+activation+of+the+p38+mitogen-activated+protein+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans.">Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Microbiol. 15 (1), 82-97 (2013).</li><li>Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tnl+0+transposon+derivatives+for+insertion+mutagenesis+and+gene+delivery+into+the+chromosome+of+Gram-negative+bacteria.">Mini-Tnl 0 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of Gram-negative bacteria.</a> Gene. 160 (1), 59-62 (1995).</li><li>Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar+and+broth+dilution+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+(MIC)+of+antimicrobial+substances.">Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).</li><li>Pansare, V., Hejazi, S., Faenza, W., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+Long-Wavelength+Optical+and+NIR+Imaging+Materials:+Contrast+Agents,+Fluorophores+and+Multifunctional+Nano+Carriers.">Review of Long-Wavelength Optical and NIR Imaging Materials: Contrast Agents, Fluorophores and Multifunctional Nano Carriers.</a> Chem Mater. 24 (5), 812-827 (2012).</li><li>Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+green+fluorescence.">Improved green fluorescence.</a> Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).</li><li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging.">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).</li><li>Frangioni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging.">In vivo near-infrared fluorescence imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).</li><li>Collins, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrobacter+rodentium:+infection,+inflammation+and+the+microbiota.">Citrobacter rodentium: infection, inflammation and the microbiota.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (9), 612-623 (2014).</li><li>Mallick, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+murine+infection+model+for+Shiga+toxin-producing+Escherichia+coli.">A novel murine infection model for Shiga toxin-producing Escherichia coli.</a> J Clin Invest. 122 (11), 4012-4024 (2012).</li><li>Petty, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Citrobacter+rodentium+genome+sequence+reveals+convergent+evolution+with+human+pathogenic+Escherichia+coli.">The Citrobacter rodentium genome sequence reveals convergent evolution with human pathogenic Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 192 (2), 525-538 (2010).</li><li>Kovach, M. E., Elzer, P. H., Hill, D. S., Robertson , G. T., Farris, M. A., Roop, R. M., Peterson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+new+derivatives+of+the+broad-host-range+cloning+vector+pBBR1MCS,+carrying+different+antibiotic-resistance+cassettes.">Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes.</a> Gene. 166 (1), 175-176 (1995).</li><li>Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Plasmid+Maintenance+in+the+Attenuated+Live+Vector+Vaccine+Strain+Salmonella+typhiCVD+908-htrA.">Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA.</a> Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).</li><li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+pneumococcal+infections+in+the+lungs+of+live+mice+using+bioluminescent+Streptococcus+pneumoniae+transformed+with+a+novel+gram-positive+lux+transposon.">Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon.</a> Infect Immun. 69 (5), 3350-3358 (2001).</li><li>Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+(EHEC)+infection+and+hemolytic+uremic+syndrome+(HUS).">Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS).</a> BMC Med. 10, (2012).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בעבר דווח כי יש כבר מנוצל EHEC טרנספורמציה עם פלסמיד לוציפראז לבחון שלה לוקליזציה מארחים או גנים ביטוי ויוו8,11,12. המודל מאתר המודגמות כאן דווחה גם לזהות את העיתוי EHEC התנחלו ולוקליזציה מארח מאתר8. עם זאת, אנו מספקים פרוטוקול ...

EHEC O157:H7 הוא. חיידק הגורם לשלשול1, HS2, הוס3ואי ספיקת כליות חריפה אפילו4 דרך מזון או מים מזוהמים. EHEC enterobacterium פתוגניים, והצנרות מערכת העיכול של בני אדם1. כאשר EHEC לדבוק קודם אפיתל המעי המארח, הם מזריקים את הגורמים קולוניזציה לתוך התאים המארחים דרך סוג III הפרשת מערכת (T3SS) כי פונקציות כמו מזרק מולקולרית בתדר של הצמדת ו effacing (A/E) הנגע לאחר מכן כדי לאכוף אדהזיה (מושבת)5. אלה גנים המעורבים במערך A/E הנגע מקודדים על ידי מיקומה של האי פתוגניות הצטנעות (לי) enterocyte5.
הארה ביולוגית היא לייצר אור תגובה כימית, ב לוציפראז אשר מזרז luciferin המצע שלה כדי ליצור אור גלוי6. תהליך אנזימטי זה לעיתים קרובות דורשת הנוכחות של חמצן או אדנוזין טריפוספט (ATP)6. ביולומינסנציה הדמיה (בלי) מאפשר חוקרים את הפריט החזותי ו קוונטיזציה של פתוגן-פונדקאי אינטראקציות ב בעלי חיים7. מתה על ניתן לאפיין את מחזור זיהום חיידקי בבעלי חיים על ידי ביצוע חיידקים זוהרים כמו שהם להגר לפלוש לרקמות שונות7; זה מגלה שינוי דינמי של זיהום. יתר על כן, העומס חיידקי בבעלי חיים קשורה האות ביולומנאסן8; לכן, יש חיווי נוח כדי להעריך את התנאים פתולוגי של חיות ניסוי באופן פשוט וישיר.
פלסמיד המשמש כאן הכיל את אופרון לוציפראז, luxCDABE, שבו הוא מן החיידק Photorhabdus luminescens מקודד משלו לוציפראז המצע7,9. על-ידי שינוי צורה זו פלסמיד לבטא לוציפראז לתוך חיידקים, ניתן לנטר את התהליכים קולוניזציה ולדלקת על ידי התבוננות חיידקים זוהרים אלו בבעלי חיים. בסך הכל, בלי וחיידקים התווית על-ידי ביולומינסנציה לאפשר לחוקרים לעקוב אחר המספרים חיידקי, למיקום, הכדאיות חיידקי עם אנטיביוטיקה/טיפול, ביטוי גנים חיידקיים זיהום/מושבת6, 7. חיידקים פתוגניים רבים דווחו כי לבטא את אופרון luxCDABE לבחון זיהום מחזור ו/או גנים ביטוי במעשים זיהום. חיידקים אלה, כולל e. coliuropathogenic10, EHEC8,11,12,13, enteropathogenic e. coli (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, סלמונלה typhimurium16, ליסטריה17,18, Yersinia enterocolitica19, , ויבריו cholerae20, תועדו.
מספר גרסאות ניסיוניות פותחו כדי להקל על המחקר של EHEC קולוניזציה במבחנה , ויוו21,22,23. עם זאת, יש חוסר מודלים מתאימים ללמוד את EHEC קולוניזציה ויוו, ובכך וכתוצאה מכך במחסור של פרטים. כדי להקל על המחקר של ה EHEC קולוניזציה מנגנון ויוו, זה חשוב כדי לבנות מודלים בעלי חיים כדי להתבונן ולכמת EHEC קולוניזציה בבעלי חיים בשיטה לא פולשנית.
כתב יד זה מתאר מודל קולוניזציה העכבר-EHEC משתמש במערכת לביטוי זוהרים כדי לפקח EHEC קולוניזציה לאורך זמן ב חי המארחים. עכברים intragastrically מחוסנים עם התווית על-ידי ביולומינסנציה EHEC ומתגלה האות ביולומנאסן בעכברים עם יישום לא פולשנית ויוו הדמיה מערכת13. עכברים נגועים עם התווית על-ידי ביולומינסנציה EHEC הראה אותות ביולומנאסן משמעותי במעי שלהם לאחר יומיים לפרסם זיהום, אשר הציע כי חיידקים אלה התנחלו במעי המארח לאחר יומיים לפרסם זיהום. Ex-vivo נתוני התמונה הראה כי קולוניזציה הזה הוא במיוחד ב המעי האטום ואת המעי הגס של עכברים. באמצעות מודל זה עכבר-EHEC, הקולוניזציה EHEC ביולומנאסן ניתן להבחין במארח החיים של ויוו מערכת, כדי לחקור את המנגנונים מפורט מושבת בה חיידק, אשר עשוי לקדם הבנה נוספת בהדמיה EHEC-induced פיזיולוגיים ופתולוגיים שינויים.

<table><tbody><tr><td>Shaker incubator</td><td>YIH DER</td><td>LM-570R</td><td>bacteria incubation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Orbital shaking incubator</td><td>FIRSTEK</td><td>S300</td><td>bacteria incubation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pBSL180</td><td></td><td></td><td>source of nptII gene</td></tr><tr><td>pAKlux2</td><td></td><td></td><td>source of luxCDABE operon</td></tr><tr><td>T&amp;amp;A Cloning Kit</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYC001-20P</td><td>use for TA cloning&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Nsi&lt;/em&gt; I</td><td>NEB</td><td>R0127S</td><td>use for plasmid cloning&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sca&lt;/em&gt; I</td><td>NEB</td><td>R0122S</td><td>use for plasmid cloning&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Spe&lt;/em&gt; I-HF</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td>use for plasmid cloning&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sma&lt;/em&gt; I&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td>use for plasmid cloning&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T4 ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td>use for plasmid cloning&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ex Taq</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>use for PCR amplification</td></tr><tr><td>10X Ex Taq Buffer</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>use for PCR amplification</td></tr><tr><td>dNTP Mixture&amp;nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>use for PCR amplification</td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>2720 thermal cycler&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;for PCR amplification</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>SIGMA</td><td>G5516-1L</td><td>use for bacteria stocking solution</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434-5KG-R</td><td>chemical for making LB medium, 10 g/L</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1612.00</td><td>chemical for making LB medium, 10 g/L</td></tr><tr><td>Yeast Extract powder</td><td>Affymetrix</td><td>23547-1 KG</td><td>chemical for making LB medium, 5 g/L</td></tr><tr><td>Agar</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1802.00</td><td>chemical for making LB agar</td></tr><tr><td>kanamycin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>K4000-5G</td><td>antibiotics, use for seleciton</td></tr><tr><td>streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S6501-100G</td><td>antibiotics, eliminate the microbiota in mice</td></tr><tr><td>EDL933 competent cell</td><td>Homemade</td><td></td><td>method is on supplemental document&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>MicroPulser</td><td></td><td>for electroporation</td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes</td><td>Gene Pulser/MicroPulser</td><td>1652086</td><td>for electroporation</td></tr><tr><td>High-speed centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti, J-26S XP</td><td>use for centrifuging bacteria&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fixed-Angle Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA25.5</td><td>use for centrifuging bacteria&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fixed-Angle Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>JLA10.5</td><td>use for centrifuging bacteria&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>centrifuge bottles</td><td>Beckman Coulter</td><td>REF357003</td><td>use for centrifuging bacteria&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>centrifuge bottles</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>3141-0500</td><td>use for centrifuging bacteria&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>eppendorf biophotometer plus&amp;nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>AG 22331 hamburg</td><td>for measuring the OD600 value of bacteria</td></tr><tr><td>C57BL/6 mice&amp;nbsp;</td><td>Laboratory Animal Center of NCKU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lab coat, gloves</td><td></td><td></td><td>for personnel protection&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>isoflurane&amp;nbsp;</td><td>Panion &amp;amp; BF Biotech Inc.</td><td>G-8669</td><td>for mice anesthesia, pharmaceutical grade</td></tr><tr><td>1ml syringe&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>use for oral gavage of mice</td></tr><tr><td>Reusable 22 G ball-tipped feeding needle</td><td></td><td>&amp;phi;0.9 mm X L 50 mm</td><td>use for oral gavage of mice</td></tr><tr><td>surgical&amp;nbsp; scissors&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>use for mice experiment</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200 imaging system</td><td>Perkin Elmer</td><td>IVIS spectrum</td><td>use for bioluminescent image capture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Living Image Software</td><td>Perkin Elmer</td><td>version 4.1</td><td>use for quantifying the image data</td></tr></tbody></table>

detection of enterohemorrhagic escherichia coli colonization in murine host by non-invasive in vivo bioluminescence system

Enterohemorrhagic e. coli (EHEC) O157:H7, אשר הוא. חיידק והקאה causesdiarrhea הזה, מדמם קוליטיס (HS), ו תסמונת אורמיה hemolytic (HUS), ליישב את העיכול של בני אדם. ללמוד מנגנון מפורט של EHEC קולוניזציה ויוו, זה חיוני כדי להיות מודלים בעלי חיים כדי לפקח ולכמת EHEC קולוניזציה. נדגים כאן מודל קולוניזציה העכבר-EHEC בהפיכת את פלסמיד לביטוי זוהרים כדי EHEC כדי לפקח ולכמת כיבוש EHEC חי המארחים. בעלי חיים מחוסן עם התווית על-ידי ביולומינסנציה EHEC להציג אותות ביולומנאסן אינטנסיבי בעכברים על-ידי זיהוי עם יישום לא פולשנית ויוו מערכת הדמיה. לאחר ימים 1 ו-2 פוסט זיהום, אותות ביולומנאסן יכול עדיין ניתן לאתר חיות נגועות, מה שמרמז כי EHEC לישוב ב hosts לפחות 2 ימים. אנחנו גם להוכיח כי אלה EHEC ביולומנאסן לאתר כדי העכבר המעי, בפרט המעי האטום ואת המעי הגס, מתמונות vivo לשעבר . מודל מושבת זה עכבר-EHEC עשוי לשמש כלי לקידום הידע הנוכחי של מנגנון קולוניזציה EHEC.

. הזמנו התווית על-ידי ביולומינסנציה EHEC (~ 109 תאים חיידקיים) 6 - בן שבועיים לעכברים C57BL/6 נשים על-ידי gavage דרך הפה. לאחר חיסון אוראלי של EHEC לעכברים בתוך 1 h, החיות נבדקו לאות זוהרים על-ידי ויוו מערכת ההדמייה, כפי שמוצג באיור 7. התוצאות הראו אות מייצרים אור ...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System at JoVE.com

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

פרוטוקול מפורט של דגם העכבר עבור enterohemorrhagic e. coli (EHEC) מושבת באמצעות חיידקים התווית על-ידי ביולומינסנציה מוצג. זיהוי חיידקים זוהרים אלו באמצעות פולשני ויוו מערכת בבעלי חיים הדמיה יכול לקדם את ההבנה הנוכחית שלנו של EHEC קולוניזציה.

זיהוי של כיבוש Escherichia Coli Enterohemorrhagic מאתר מארח על-ידי המערכת לא פולשנית In Vivo ביולומינסנציה

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

detection-enterohemorrhagic-escherichia-coli-colonization-murine-host

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

9.4K Views.  National Cheng Kung University. פרוטוקול מפורט של דגם העכבר עבור enterohemorrhagic e. coli (EHEC) מושבת באמצעות חיידקים התווית על-ידי ביולומינסנציה מוצג. זיהוי חיידקים זוהרים אלו באמצעות פולשני ויוו מערכת בבעלי חיים הדמיה יכול לקדם את ההבנה הנוכחית שלנו של EHEC קולוניזציה.

Video: Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative medicine. However, direct injection of hESCs, and cells differentiated from hESCs, into living organisms has thus far been hampered by significant cell death, teratoma formation, and host immune rejection. Understanding the in vivo hESC behavior after transplantation requires novel imaging techniques to longitudinally monitor hESC localization, proliferation, and viability. Molecular imaging has given investigators a high-throughput, inexpensive, and sensitive means for tracking in vivo cell proliferation over days, weeks, and even months. This advancement has significantly increased the understanding of the spatio-temporal kinetics of hESC engraftment, proliferation, and teratoma-formation in living subjects.

A major advance in molecular imaging has been the extension of noninvasive reporter gene assays from molecular and cellular biology into in vivo multi-modality imaging platforms. These reporter genes, under control of engineered promoters and enhancers that take advantage of the host cell s transcriptional machinery, are introduced into cells using a variety of vector and non-vector methods. Once in the cell, reporter genes can be transcribed either constitutively or only under specific biological or cellular conditions, depending on the type of promoter used. Transcription and translation of reporter genes into bioactive proteins is then detected with sensitive, noninvasive instrumentation (e.g., CCD cameras) using signal-generating probes such as D-luciferin.

To avoid the need for excitatory light to track stem cells in vivo as is required for fluorescence imaging, bioluminescence reporter gene imaging systems require only an exogenously administered probe to induce light emission. Firefly luciferase, derived from the firefly Photinus pyralis, encodes an enzyme that catalyzes D-luciferin to the optically active metabolite, oxyluciferin. Optical activity can then be monitored with an external CCD camera. Stably transduced cells that carry the reporter construct within their chromosomal DNA will pass the reporter construct DNA to daughter cells, allowing for longitudinal monitoring of hESC survival and proliferation in vivo. Furthermore, because expression of the reporter gene product is required for signal generation, only viable parent and daughter cells will create bioluminescence signal; apoptotic or dead cells will not. 

In this video, the specific materials and methods needed for tracking stem cell proliferation and teratoma formation with bioluminescence imaging will be described.

With the growing interest in stem cell therapies, molecular imaging techniques are ideal for monitoring stem cell behavior after transplantation. Luciferase reporter genes have enabled non-invasive, repetitive assessment of cell survival, location, and proliferation in vivo. This video will demonstrate how to track hESC proliferation in a living mouse.

במבחנה פליטת אור הדמיה vivo ג&#39;ין הכתב של בתאי גזע עובריים אנושיים

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

Biology

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite this similarity, these bacteria show extreme variations in characteristics like growth behavior, intensity of light emission or regulation of bioluminescence. The method presented here is a newly developed assay that combines recording of cell growth and bioluminescent light emission intensity over time utilizing a plate reader. The resulting growth and light emission characteristics can be linked to important features of the respective bacterial strain, such as quorum sensing regulation. The cultivation of a range of bioluminescent bacteria requires a specific medium (e.g., artificial sea water medium) and defined temperatures. The easy to handle, non-bioluminescent standard-research bacterium Escherichia coli (E. coli), on the other hand, can be cultivated inexpensively in high quantities in laboratory scale. Exploiting E. coli by introducing a plasmid containing the whole lux operon can simplify experimental conditions and additionally opens up many possibilities for future applications. The expression of all lux genes utilizing an E. coli expression strain was achieved by construction of an expression plasmid via Gibson cloning and insertion of four fragments containing seven lux genes and three rib genes of the lux-rib operon into a pET28a vector. E. coli based lux gene expression can be induced and controlled via Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG) addition resulting in bioluminescent E. coli cells. The advantages of this system are to avoid quorum sensing regulation restrictions and complex medium compositions along with non-standard growth conditions, such as defined temperatures. This system enables analysis of lux genes and their interplay, by the exclusion of the respective gene from the lux operon, or even addition of novel genes, exchanging the luxAB genes from one bacterial strain by another, or analyzing protein complexes, such as luxCDE.

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

Bioluminescent bacteria regulate light production through a variety of mechanisms, such as quorum sensing. This novel method allows the in situ investigation of bioluminescence and the correlation of light emission to cell density. An artificial bioluminescent Escherichia coli system allows the characterization of lux operons, Lux proteins, and their interplay.

בחיי עיר ובחינת המתאם של צפיפות התאים ואת פליטת אור של חיידקים זוהרים

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

Biochemistry

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

הדמיה בקטריאלי bioluminescent<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

איתור vivo מערכות הדמיה (IVIS) של וירוס אנצפליטים נוירו פולשנית

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

הדמיה של multimodality 4D<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; זיהומים בעכברים

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several animal models have been generated, including the widely used orthotopic mouse models, where cancer cells are injected into the mammary fat pad. However, these models cannot help monitor tumor growth kinetics and metastatic colonization. Cutting-edge tools to monitor cancer cells in real time in mice will significantly advance the understanding of tumor biology. 
Here, breast cancer cell lines stably expressing luciferase and green fluorescent protein (GFP) were established. Specifically, this technique contains two sequential steps initiated by measuring the luciferase activity in vitro and followed by the implantation of the cancer cells into mammary fat pads of nonobese diabetic-severe combined immunodeficiency (NOD-SCID) mice. After the injection, both the tumor growth and metastatic colonization are monitored in real time by the noninvasive bioluminescence imaging system. Then, the quantification of GFP-expressing metastases in the lungs will be examined by fluorescence microscopy to validate the observed bioluminescence results. This sophisticated system combining luciferase and fluorescence-based detection tools evaluates cancer metastasis in vivo, which has great potential for use in breast cancer therapeutics and disease management.

Here, we describe a noninvasive monitoring method involving luciferase and green fluorescent protein expression in various breast cancer cell lines. This protocol provides a technique to monitor tumor formation and metastatic colonization in real time in mice.

ניטור צמיחת סרטן השד והיווצרות מושבה גרורתית בעכברים באמצעות Bioluminescence

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several ...

Cancer Research

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in vivo optical and &#956;CT imaging allow the visualization of biological phenomena in an anatomical context. These imaging modalities may be especially useful to study conditions that impact bone. In particular, orthopaedic implant infections are an important problem in clinical orthopaedic surgery. These infections are difficult to treat because bacterial biofilms form on the foreign surgically implanted materials, leading to persistent inflammation, osteomyelitis and eventual osteolysis of the bone surrounding the implant, which ultimately results in implant loosening and failure. Here, a mouse model of an infected orthopaedic prosthetic implant was used that involved the surgical placement of a Kirschner-wire implant into an intramedullary canal in the femur in such a way that the end of the implant extended into the knee joint. In this model, LysEGFP mice, a mouse strain that has EGFP-fluorescent neutrophils, were employed in conjunction with a bioluminescent Staphylococcus aureus strain, which naturally emits light. The bacteria were inoculated into the knee joints of the mice prior to closing the surgical site. In vivo bioluminescent and fluorescent imaging was used to quantify the bacterial burden and neutrophil inflammatory response, respectively. In addition, &#956;CT imaging was performed on the same mice so that the 3D location of the bioluminescent and fluorescent optical signals could be co-registered with the anatomical &#956;CT images. To quantify the changes in the bone over time, the outer bone volume of the distal femurs were measured at specific time points using a semi-automated contour based segmentation process. Taken together, the combination of in vivo bioluminescent/fluorescent imaging with &#956;CT imaging may be especially useful for the noninvasive monitoring of the infection, inflammatory response and anatomical changes in bone over time.

Combined In vivo Optical and  &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combined optical and &#956;CT imaging in a mouse model of orthopaedic implant infection, utilizing a bioluminescent engineered strain of Staphylococcus aureus, provided the capability to noninvasively and longitudinally monitor the dynamics of the bacterial infection, as well as the corresponding inflammatory response and anatomical changes in the bone.

בשילוב<em&gt; בvivo</em&gt; אופטי וμCT הדמיה למעקב אחר זיהום, דלקת, ועצם אנטומיה בזיהום אורטופדיים שתל בעכברים

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

Medicine

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.

שימוש משופרת פלורסצנטיות ירוק חלבון-הבעת Escherichia Coli כדי להעריך את העכבר מקרופאג הצפק Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging

Urinary tract infections (UTI) rank among the most common bacterial infections in humans and are routinely treated with empirical antibiotics. However, due to increasing microbial resistance, the efficacy of the most used antibiotics has declined. To find alternative treatment options, there is a great need for a better understanding of the UTI pathogenesis and the mechanisms that determine UTI susceptibility. In order to investigate this in an animal model, a reproducible, non-invasive assay to study the course of UTI is indispensable.
For years, the gold standard for the enumeration of bacterial load has been the determination of Colony Forming Units (CFU) for a particular sample volume. This technique requires post-mortem organ homogenates and serial dilutions, limiting data output and reproducibility. As an alternative, bioluminescence imaging (BLI) is gaining popularity to determine the bacterial load. Labeling pathogens with a lux operon allow for the sensitive detection and quantification in a non-invasive manner, thereby enabling longitudinal follow-up. So far, the adoption of BLI in UTI research remains limited.
This manuscript describes the practical implementation of BLI in a mouse urinary tract infection model. Here, a step-by-step guide for culturing bacteria, intravesical instillation and imaging is provided. The in vivo correlation with CFU is examined and a proof-of-concept is provided by comparing the bacterial load of untreated infected animals with antibiotic-treated animals. Furthermore, the advantages, limitations, and considerations specific to the implementation of BLI in an in vivo UTI model are discussed. The implementation of BLI in the UTI research field will greatly facilitate research on the pathogenesis of UTI and the discovery of new ways to prevent and treat UTI.

This manuscript describes the intravesical administration of uropathogenic bacteria with a lux operon to induce a urinary tract infection in mice and subsequent longitudinal in vivo analysis of the bacterial load using bioluminescence imaging.

מעקב אורך של דלקות בדרכי השתן והטיפול שלהם בעכברים באמצעות הדמיית ביו-לומינציה

Urinary tract infections (UTI) rank among the most common bacterial infections in humans and are routinely treated with empirical antibiotics. However, ...

זיהוי של כיבוש Escherichia Coli Enterohemorrhagic מאתר מארח על-ידי המערכת לא פולשנית In Vivo ביולומינסנציה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים

במבחנה פליטת אור הדמיה vivo ג'ין הכתב של בתאי גזע עובריים אנושיים

בחיי עיר ובחינת המתאם של צפיפות התאים ואת פליטת אור של חיידקים זוהרים

הדמיה בקטריאלי bioluminescent

איתור vivo מערכות הדמיה (IVIS) של וירוס אנצפליטים נוירו פולשנית

הדמיה של multimodality 4D

ניטור צמיחת סרטן השד והיווצרות מושבה גרורתית בעכברים באמצעות Bioluminescence

בשילוב

שימוש משופרת פלורסצנטיות ירוק חלבון-הבעת Escherichia Coli כדי להעריך את העכבר מקרופאג הצפק Phagocytosis

מעקב אורך של דלקות בדרכי השתן והטיפול שלהם בעכברים באמצעות הדמיית ביו-לומינציה