Name: purification of biotinylated cell surface proteins from rhipicephalus microplus epithelial gut cells
Uploaded: 2017-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות ל Biosecurity המושבה הטיקאית (מחלקת קווינסלנד לחקלאות ודיג באוסטרליה) על אספקת Rhipicephalus microplus קרציות מנוצל עבור מחקר זה, ו לוקאס Karbanowicz לעזרה עם צילומי וידאו.

1. דיסקציה של אפיתל גוט מ ר microplus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף קרציות חצי מבושל מן הבקר ביום הניסוי. לנתח מתקתק בתוך 24 שעות לאחר הסרת מן המארח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדבוק רצועת סרט דביק לתחתית של צלחת פטרי 92 מ&quot;מ x 16 מ&quot;מ פטרי. הוסף טיפה של דבק סופר לקלטת. מניחים את סמן, בצד הגחון על הדבק סופר, לאפשר יבש במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 100 מ&quot;ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) לתוך צלחת פטרי, או עד הקופסה הוא שקוע לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניצול בגודל 11 אזמל, לחתוך מן החלק העליון של העיניים אל התחתונים התחתונים, משני צידי הקופסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים סטרילית, להסיר לחלוטין את כיח ואת alloscutum , כדי לחשוף את האיברים הפנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החוט הלבן כמו אברים (קנה הנשימה) ו ממברנות אחרות כדי למנוע זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המעיים באמצעות מלקחיים, על ידי צובט את האזור העליון ומשוך מפֶּגֶר. הסר את כל רקמות הבטן הנותרים, להבטיח כי לא רקמות אחרות כבר גזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות gut ב קר קרח קר של תמיסת מלח מאוזן (HBSS) ללא סידן כלורי ו מגנזיום גופרתי עם קוקטייל מעכב proteinase (PIC). הצמד להקפיא את האומץ בקרח יבש לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. הערה: כדי לסייע לנתיחה בטן ופרטים של האיברים הפנימיים של תפר עיין בפרק 3.1 של ד &#39;Sonenshine, &quot;ביולוגיה של קרציות&quot; 19 . </li></ol> 2. דיסוציאציה תא אפיתל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את המעיים גזור על מסנן תא 70 מיקרומטר בתוך צינור 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את רקמת הבטן עם 50 מ&quot;ל קר HBSS קר עם PIC עד הפתרון פועל ברור, ואת האומץ לקחת על המראה לבן / ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות האומץ ב 30 מ&quot;ל קר HBSS קר עם PIC, מערבבים בעדינות צנטריפוגה ב XG 500 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי גלולה המעיים. הסר את supernatant וחזור על תהליך לשטוף שלוש פעמים. </li><lI&gt; כדי לעקור תאי המעיים אפיתל, מחדש להשעות את המעיים ב 10 מ&quot;ל של תרבית תאים בינוני בינוני Dulbecco שונה הנשר (DMEM), 2% עגל בסרום (FCS), 0.5 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), 1 מ&quot;מ טריס (2 Carboxyethyl) פוספין (TCEP), PIC ו דגירה של 60 דקות על 37 מעלות צלזיוס תחת סיבוב איטי באמצעות רולר ב 6 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן את ההשעיה באמצעות מסננת תא 250 מיקרומטר, מערבולת הזרימה דרך ומסנן דרך מסננת 70 מיקרומטר התא לאסוף את זרימת הנותרים דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה ב XG 500 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי גלולה תאים בודדים. </li></ol> 3. בידוד של תאים אפיתל יחיד באמצעות שיפוע צנטריפוגה שיפוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צפיפות צנטריפוגה שיפוע ( למשל , Percoll) על ידי סינון באמצעות נייר AP15 מראש מסנן. הכן 40% ו Percoll 20% ב mqH 2 0 (V / V) ו מגניב על 4 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות לפני שכבת שיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש peristalticהמשאבה להגדיר את המהירות הנמוכה ביותר, שכבת 3 מ&quot;ל של 40% צפיפות צנטריפוגה צנטריפוגה צינור 16 ultracentrifuge, ומאפשר לה להתיישב על קרח במשך 15 דקות. המהירות של המשאבה צריכה להוביל &lt;1 מ&quot;ל לכל שיעור הזרימה המינימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטיית הצינור ל זווית 45 °, להשתמש המשאבה peristaltic שכבת 20% צפיפות צנטריפוגה שיפוע על גבי השכבה 40%. מהירות המשאבה צריכה להוביל ל &lt;1 מ&quot;ל לכל שיעור הזרימה המינימלית. אפשר השכבות להתיישב על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש המשאבה peristaltic ב &lt;1 מ&quot;ל לכל שיעור הזרימה המינימלית לשכבה 3 מ&quot;ל של DMEM בינוני המכיל תאים בטן לתקתק מעל 20-40% צפיפות צנטריפוגה שיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנית צנטריפוגה להאצת מקסימלית האטה מינימלית. צנטריפוגה ב XG 600 במשך 10 דקות. איסוף interphases בין DMEM: 20% צפיפות צנטריפוגה שיפוע, ואת 20%: 40% צפיפות צנטריפוגה gradients לבודד תאים בודדים אפיתל. חנות שנאספו interphases ב 4 מעלות צלזיוס עבור ניתוחים הבאים. </li></ol><html> 4. הערכת בידוד התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המיאצטומטר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות את שקופית hemacytometer עם אלכוהול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . Re- להשעות את התאים על ידי pipetting בעדינות את התאים למעלה ולמטה. פיפטה 100 μL ההשעיה התא במקום צינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 400 μL של 0.4% Trypan כחול. בעדינות לערבב על ידי לחיצה על הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 100 μL של ההשעיה תא כחול Trypan מטופלים לאט למלא שני החדרים של hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את hemocytometer תחת מיקרוסקופ אור, תוך התמקדות קווי הרשת של hemocytometer עם מטרה 10X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מונה ידית יד, לספור את התאים חיים ללא כתם בתוך קבוצה של 16 ריבועים. בתוך אותו ריבוע, ספור את התאים הכחולים המתים. המשך לספור עד שייספרו ארבע קבוצות של 16 ריבועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב התאים הכולל לכל מ&quot;ל באמצעות הנוסחה: 47eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב אחוז הכדאיות התא באמצעות הנוסחה: <img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/55747/55747eq2.jpg" /></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא מבודד ויזואליזציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 1 μL של תאים מבודדים μL 9 של HBSS בצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. קפיצי microcentrifuge את הצינור בעדינות כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 5 μL של תאים מבודדים ב HBSS באמצע שקופית זכוכית. החל שלוש טיפות של המדיום גובר עם 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את השקופית בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. בזהירות במקום להחליק להחליק על ההכנה, הימנעות בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו תאים מוכתמים DAPI ב עירור 360 ננומטר פליטה ב 460 ננומטר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol></li></ol> 5. Cell Cell חלבון Biotinylation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biotinylate 100 μL של תאים תא אפיתל יחיד באמצעות Biotin (סוג A) הצמידהKit, על יחס טוחנת של 1: 1 חלבון פני השטח כדי מצומד, בהתאם להוראות היצרן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תמוגה התא, להוסיף 100 μL של PBS, 1% Triton X-100, גליצרול 10%, 100 מיקרומטר גלוטתיון חמצון PIC לתאים biotinylated. דגירה על קרח במשך 1 שעות עם ערבוב עדין כל 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים biotinylated ב XG 20,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי גלולה חומר מסיס. איסוף supernatant המכיל cytoplasmic, חלבונים הממברנה biotinylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות assay Bradford. </li></ol> 6. בידוד של חלבונים פנימיים Biotinylated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של חרוזים מגנטיים Streptavidin לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור לתוך מעמד מגנטי, איסוף חרוזים כנגד הצד של הצינור. הסר וזורקים את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1000 μL של TBS, 0.1% Tween-20 לצינור. מערבבים בעדינות ולאסוף את החרוזים עם סטן מגנטיד. הסר וזורקים את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 40 מיקרוגרם של חלבונים משטח התא biotinylated, מדולל μL 300 ב 1x PBS עם חרוזים מגנטיים שטף. לדגור על 2 שעות בטמפרטורת החדר עם תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את החרוזים עם מעמד מגנטי, להסיר ולזנוח supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 300 μL של TBS, 0.1% Tween-20 לצינור, בעדינות ערבוב כדי להשעות מחדש את החרוזים. איסוף חרוזים, להסיר ולזנוח supernatant. חזור על צעד זה לשטוף פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μL של 0.1 M גליצין pH 2.0 חרוזים מגנטיים, ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. איסוף חרוזים ולהסיר supernatant המכיל eluted biotinylated חלבונים פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו חלבונים משטח מבודד על ג&#39;ל 4-20% Tris-MOPS SDS-PAGE. </li></ol> 7. הערכה של חלבונים פנימיים Biotinylated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקודה כתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 7 ס&quot;מ x 3 ס&quot;מ רצועה של קרום nitrocellulose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 10 מיקרוגרם סך הכל סמןתוכן (מ 1.8 לעיל), ו 10 מיקרוגרם של חלבון פני השטח biotinylated על הממברנה. אפשר ייבוש במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה למכל ו לצלול ב 100 מ&quot;ל של חיץ חסימה. דגירה בטמפרטורת החדר עם תסיסה במשך שעה. מחק חסימת חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף nitrocellulose קרום μL 100 μL, 0.05% Tween-20 במשך 5 דקות עם תסיסה. בטל לשטוף חיץ לחזור על שוטף שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב 1/5000 Streptavidin חזרת peroxidase (HRP) ב 100 μL PBS, 0.05% Tween-20 עבור 2 שעות עם תסיסה בטמפרטורת החדר, ולבטל כל פתרון שנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף nitrocellulose קרום μL 100 של PBS, 0.05% Tween-20 במשך 5 דקות עם תסיסה. מחק חיץ לשטוף וחזור לשטוף שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזיהוי, להמיס 1 טבליה של 4-chloro-1-napthol ב 10 מ&quot;ל של מתנול קר כקרח. הוסף 4 מ&quot;ל של מלאי מתנול ל 20 מ&quot;ל של כפות. הוסף 10 μL של מי חמצן טריים 30% ו immediaTely להחיל על קרום nitrocellulose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם תסיסה בטמפרטורת החדר עד המצע מייצר מוצר סוף כחול מסיס. פעולה זו עשויה להימשך בין 2-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק פתרון איתור לשטוף את הממברנה שלוש פעמים μl 100 μL 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסאי ELISA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 200 ng של כל מדגם עם 400 μL של 100 מ&quot;מ חיץ ציפוי קרבונט מעיל 2 נתיבים של השורה הראשונה (A #) של צלחת אליסה (בארות תחתית שטוחה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μL של חיץ ציפוי 100 מ&quot;מ קרבונט לכל בארות המתאימים אחרים בשורות (BH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת דילולים סדרתי של כל מדגם על ידי pipetting 100 μL מכל טוב בשורה A, והעברת לתוך שורה ב לערבב בעדינות על ידי pipetting ולהימנע בייצור בועות. חזור על דילולים למטה כל שורה, להשליך את 100 μL הסופי מכל טוב בשורה H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחת עם parafilm ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את platדואר עם 200 μL PBS, 0.05% Tween-20 לכל טוב שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μL של חיץ חסימת על בארות מצופה, לכסות עם Parafilm ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 1 / 15,000 Streptavidin-HRP לחסום חיץ ולהוסיף 100 μL היטב כל צלחת. כיסוי עם parafilm ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 200 μL PBS, 0.05% Tween-20 לכל טוב חמש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות, להוסיף 100 μL של מגיב TMB לכל טוב. לאחר פיתוח צבע מספיק, בדרך כלל בין 10-15 דקות, להוסיף 100 μL של 1 M חומצה זרחתית לעצור את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא את ספיגת כל טוב ב λ = 450nm. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rodriguez-Valle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Rhipicephalus+(Boophilus)+microplus+Bm86+against+Hyalomma+dromedarii+and+Amblyomma+cajennense+tick+infestations+in+camels+and+cattle.">Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle.</a> Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).</li><li>De Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bm86+antigen+induces+a+protective+immune-response+against+Boophilus+microplus+following+DNA+and+protein+vaccination+in+sheep.">Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).</li><li>Garc&#237;a-Garc&#237;a, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variations+in+the+Boophilus+microplus+Bm86+locus+and+implications+for+immunoprotection+in+cattle+vaccinated+with+this+antigen.">Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen.</a> Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).</li><li>Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acaricide+resistance+in+cattle+ticks+and+approaches+to+its+management:+The+state+of+play.">Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play.</a> Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).</li><li>Kearney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks. , (2013).</li><li>Foil, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+influence+the+prevalence+of+acaricide+resistance+and+tick-borne+diseases.">Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases.</a> Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+level+expression+of+the+B.+microplus+Bm86+antigen+in+the+yeast+Pichia+pastoris+forming+highly+immunogenic+particles+for+cattle.">High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle.</a> J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+vaccination+with+a+recombinant+Bm86+antigen+preparation+on+natural+infestations+of+Boophilus+microplus+in+grazing+dairy+and+beef+pure+and+cross-bred+cattle+in+Brazil.">Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil.</a> Vaccine. 13 (18), 1804-1808 (1995).</li><li>Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+reverse+vaccinology+approaches+for+the+development+of+vaccines+against+ticks+and+tick+borne+diseases.">A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases.</a> Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).</li><li>Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+removal+and+characterization+of+the+microvillar+membranes+isolated+from+two+midgut+regions+of+Spodoptera+frugiperda+(Lepidoptera).">Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera).</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).</li><li>Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+separate+apical,+lateral+and+basal+plasma+membrane+from+cells+of+an+insect+epithelium.+A+procedure+based+on+tissue+organization+and+ultrastructure.">Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure.</a> Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).</li><li>Koefoed, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+method+to+isolate+the+basal+lamina+of+insect+midgut+epithelial+cells.">A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells.</a> Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).</li><li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon.">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).</li><li>Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membranes+from+insect+midgut+cells.">Plasma membranes from insect midgut cells.</a> An. Acad. Bras. Ci&#234;nc. 78, 255-269 (2006).</li><li>Vargas, A. E., Markoski, M. M., Ca&#241;edo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation+and+culture+of+intestinal+epithelial+stem+cells+from+murine+intestine.">Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine.</a> Stem Cells. 879, 479-490 (2012).</li><li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function.">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).</li><li>Karhemo, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+isolation+of+biotinylated+cell+surface+proteins+reveals+novel+players+in+cancer+metastasis.">An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis.</a> J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).</li><li>Obenchain, F. R., Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+Ticks.">Physiology of Ticks.</a> Current Themes in Tropical Science Volume 1. , 201-205 (1982).</li><li>Sonenshine, D., Roe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.1.">Chapter 3.1.</a> &amp;#34;Biology of Ticks&amp;#34. 1, (2014).</li><li>Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &amp;#34;An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure&amp;#34 (English Translation). , (1983).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

התפשטות בקר קרים מהווים בעיה רצינית עבור תעשיית הבקר באזורים טרופיים וסובטרופיים של העולם, עם השיטה הנפוצה ביותר של שליטה להסתמך על שימוש אקריצידים 1 , 4 . Bm86 זוהה בעבר בתוך השטח האפיתל במעיים לתקתק כמו אנטיגן המגן נגד ר microplus שריצה ...

Rhipicephalus microplus , סמן בקר, הוא ectoparasite משמעותי ביותר במונחים של השפעה כלכלית על תעשיית הבקר של אזורים טרופיים תת טרופיים כפי שהוא נוקט קדחת הבקר קדחת (babesiosis), anaplasmosis ו piroplasmosis סוס 1 , 2 , 3 , 4 . המאמצים הוקדשו לבקרת סמן בקר, כדי להפחית את ההשפעה המזיקה, אולם לשיטות קונבנציונליות כגון שימוש בחומרי אקריצידים כימיים יש חסרונות משתמעים, כגון נוכחות של שאריות כימיות בחלב ובבשר, ועלייה בשכיחות של קרציות עמידות כימית 5 , 6 , 7 . כתוצאה מכך, פיתוח שיטות חלופיות של בקרת טיקים נחקרו, כגון שימוש בבקר התנגדות טבעי, בקרה ביולוגית (biopesticides) וחיסוןInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . במרדף אחר חלבונים המסוגלים לשמש מועמדים לחיסונים, המחקר הנוכחי מתמקד במעי הגס. קיר midgut בנוי משכבה אחת של תאים אפיתל מנוחה על לאמידה בסיסית דקה, עם החיצוני של הלמידה הבסיסית להרכיב רשת של שרירים. אור ותצפיות מיקרוסקופ אלקטרונים מציינות כי midgut מורכב משלושה סוגים של תאים: מילואים (לא מובחנים), הפרשה, ומערכת העיכול. מספר סוגי התאים משתנה במידה ניכרת בהתאם לשלב הפיזיולוגי. תאי הפרשה ותאי העיכול מקורם בתאי מילואים 18 , 19 , 20 . בניית ספריות cDNAכדי לבחון את ההרכב של המעיים סמן גרמה לזיהוי של חלבונים אנטיגניים, כגון Bm86, כמו מועמדים חיסונים פוטנציאליים 2 , 3 , 4 . Glycoprotein Bm86 הוא מקומי על פני השטח של תאים מעיים לתקתק וגורם תגובה חיסונית מגן נגד סמן בקר ( ר microplus ) בבקר מחוסן. Anti-Bm86 IgGs המיוצר על ידי המארח החוסן הם ingested על ידי סמן, לזהות אנטיגן זה על פני השטח של תאים מעיים לתקתק, ולאחר מכן להפריע לתפקוד רקמות המעיים ואת היושרה. חיסונים המבוססים על אנטיגנים Bm86 הראו שליטה אפקטיבית של ר &#39; microplus ו Rhipicephalus annulatus, על ידי הקטנת מספר, משקל ויכולת הרבייה של נקבות נקבות, וכתוצאה מכך הפחתת הזחל מופחת בדורות דלקת הבאים 4 . עם זאת, חיסונים המבוססים על Bm86 אינם יעילים כנגד כל שלבי הסימוןהוכיחו יעילות משביעת רצון נגד כמה זנים גיאוגרפיים של ר &#39;microplus , וכתוצאה מכך את בשר בקר תעשיות חלב אימצו כראוי חיסונים אלה 2 , 4 . היכולת לבודד תאים אפיתל מן המעיים סמן הוא חידוש משמעותי אשר יאפשר את התקדמות המחקר כדי לקבוע הרכב חלבון חלבון כולל מורפולוגיה ופיזיולוגיה בתנאים סביבתיים שונים. השיטה המתוארת כאן מנצל את הסוכן chelating ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ואת הסוכן הפחתת tris (2-carboxyethyl) פוספין (TCEP) לשחרר את האפיתל מן הרקמות תמיכה תת אפיתל שלה 10 . אפיתל הוא התאושש בעקבות שיבוש מכני של הרקמות על ידי רועד, ואחריו צנטריפוגה שיפוע רציפה Percoll. מאמר זה מתאר טכניקה ריאלי ו אפשרי לבידוד של מעי גס epiהתאים. חלבונים משטח התא biotinylated, מבודדים מפני השטח של תאים אלה אפיתל ניתח לאחר מכן ביישומים במורד הזרם כגון FACS ו / או LC-MS / MS- ניתוח.

<table><tbody><tr><td>0.4% Trypan Blue</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tube</td><td>Eppendorf</td><td>3322</td><td></td></tr><tr><td>100mM Carbonate Buffer</td><td></td><td></td><td>3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6</td></tr><tr><td>16 mL centrifuge tubes with sealing cap</td><td>Thermo Scientific</td><td>3138-0016</td><td>Cool in ice prior to gradient</td></tr><tr><td>250 &amp;micro;M cell strainer</td><td>Thermo Fisher</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;,5,5&amp;prime;-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td>Stored at 4C</td></tr><tr><td>30% Hydrogen Peroxide</td><td>Labscene</td><td>BSPA5.500</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Tris-MOPS Gel</td><td>Gen Script</td><td>M42015</td><td></td></tr><tr><td>4-Chloro-1-naphthol tablet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6788</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon Tube</td><td>Corning Blue</td><td></td><td>30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;M cell strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>AP15 filter paper</td><td>Millipore</td><td>AO1504200</td><td></td></tr><tr><td>Biotin (Type A) Conjugation Kit</td><td>Abcam</td><td>Ab102865</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>DP Manager&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>2.2.1.195</td><td>Cell imagery software</td></tr><tr><td>Duct Tape</td><td>Home Handyman</td><td></td><td>48mm x 25mm Duct Tape</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>DMEM - ice cold for protocol</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Amresco</td><td>0105-500G</td><td></td></tr><tr><td>F96 Maxisorp Immuno Plate</td><td>Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td>FCS</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Olympus&amp;nbsp;</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield with DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057-20ML</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td></td><td>#9 Dumont - Switerzland</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Glycerol for molecular biology &gt;99%</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Hand-Held Counter</td><td>Officeworks</td><td>JA0376230</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>H9394</td><td>HBSS &amp;ndash; ice cold for protocol</td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Optik Lakor</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>L-Glutathione oxidized</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4376</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Separation Stand</td><td>Novagen</td><td>-</td><td>4-Tube Magnetic Separation Rack</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Water</td><td>Millipore</td><td>ZRXQ003WW</td><td>Integral Water Purification System for Ultrapure Water</td></tr><tr><td>Nitrocellulose Membrane</td><td>Life Sciences</td><td>66485</td><td>30cm x 3M pure nitrocellulose membrane</td></tr><tr><td>PageRuler Prestained protein Ladder</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SM0671</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump</td><td>Masterflex</td><td>7518-10</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6560</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer</td><td>Thermo-Scientific</td><td>37573</td><td>Stored at 4C. Blocking Buffer</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215-5ML</td><td>PIC &amp;ndash; stored at -20 &lt;b&gt;&amp;deg;&lt;/b&gt;C</td></tr><tr><td>Quick Start Bradford Dye Reagent 1x</td><td>Biorad</td><td>500-0205</td><td>For Bradford Assay</td></tr><tr><td>Quick Start BSA Standards</td><td>Biorad</td><td>500-0207</td><td>BSA standards for Bradford Assay</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Lab. Co</td><td></td><td>Size 11 Scalpel</td></tr><tr><td>SilverQuest TM Staining Kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr><tr><td>Simply Blue TM Safe Stain&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall C6+ Ultracentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin (HRP)</td><td>Abcam</td><td>AB7403</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Magnetic Beads</td><td>New England Biolabs</td><td>S1420S</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue - Ultra Fast Mini</td><td>UHU</td><td></td><td>UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini</td></tr><tr><td>Table-top Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Thermo Fisher</td><td>20490</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Biorad</td><td>161-0407</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Ratek</td><td>VM1</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Grant</td><td>GD100</td><td></td></tr></tbody></table>

purification of biotinylated cell surface proteins from rhipicephalus microplus epithelial gut cells

Rhipicephalus microplus - תווית בקר - הוא ectoparasite משמעותי ביותר במונחים של השפעה כלכלית על בעלי חיים כמו וקטור של מספר פתוגנים. המאמצים הוקדשו לשלוט בקר בקר כדי להפחית את ההשפעות המזיקות שלה, עם דגש על גילוי של מועמדים חיסון, כגון BM86, הממוקם על פני השטח של תאים מעיים לתאי אפיתל. המחקר הנוכחי מתמקד בשימוש של cDNA וגנום ספריות, כדי המסך עבור מועמדים חיסון אחרים. הבידוד של תאים מעיים לתקתק מהווה יתרון חשוב בחקירת הרכב של חלבונים פני השטח על קרום תאים בטן קרום. מאמר זה מהווה שיטה חדשנית וראוי לבידוד של תאי אפיתל, מן התוכן מעיים לתקתק של מיקרופלוס חצי רתומה למחצה . פרוטוקול זה מנצל TCEP ו EDTA לשחרר את התאים אפיתל מן הרקמות תמיכה subepithelial ו צפיפות רציפה צנטריפוגה gradieNt לתאי אפיתל נפרדים מסוגי תאים אחרים. חלבונים משטח התא היו biotinylated ומבודדים מן התאים בטן אפיתל בטן, באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin מקושר המאפשר עבור יישומים במורד FACS או LC-MS / MS- ניתוח.

תאים אפיתל היו מבודדים מרקמות המעיים של ר microplus לפי סכימה הציג באיור 1 . נציג מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקרינה של תאים מעיים לתאי אפיתל מוכן באמצעות פרוטוקול זה מוצגים בתרשים 2A ו 2 ב.</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells at JoVE.com

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

צפיפות שונה צנטריפוגה מבוססי מתודולוגיה שיפוע מבוסס נוצל לבודד תאים אפיתל מ רקמה Rhipicephalus רקמת microplus . משטח חלבונים הקשורים היו biotinylated ו מטוהרים באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin עבור יישומים במורד הזרם.

טיהור של biotinylated Cell חלבונים משטח מ<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; תאים אפיתל גוט

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

purification-biotinylated-cell-surface-proteins-from-rhipicephalus

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

9.4K Views.  The University of Queensland.  צפיפות שונה צנטריפוגה מבוססי מתודולוגיה שיפוע מבוסס נוצל לבודד תאים אפיתל מ רקמה Rhipicephalus רקמת microplus . משטח חלבונים הקשורים היו biotinylated ו מטוהרים באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin עבור יישומים במורד הזרם. 

Video: Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual nuances in expression from patient to patient. Current methodologies that try to separate cells to fill this niche result in disruption of physiological expression, making the separation technique useless as a diagnostic tool. In this protocol, we describe the functionalization and optimization of a surface for the cellular capture and release. This functionalized surface integrates biotinylated antibodies with a glass surface functionalized with an aminosilane (APTES), desthiobiotin and streptavidin. Cell release is facilitated through the introduction of biotin, allowing the recollection and purification of cells captured by the surface. This release is done through the targeting of the secondary moiety desthiobiotin, which results in a much more gentle release paradigm. This reduction in harsh reagents and shear forces reduces changes in cellular expression. The functionalized surface captures up to 80% of cells in a single cell mixture and has demonstrated 50% capture in a dual-cell mixture. Applications of this technology to xenografts and cancer separation studies are investigated. Quantification techniques for surface verification such as plate reader and ImageJ analyses are described as well.

This protocol describes customizable surface functionalization of the desthiobiotin, streptavidin, and APTES system in order to isolate specific cell types of interest. In addition, this manuscript covers the applications, optimization, and verification of this process.

שיטה של ​​בידוד תא ממוקד באמצעות Functionalization משטח הזכוכית

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

Cancer Research

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced that allow the proximity-dependent labeling of proteins in living cells. One such enzyme, BirA* (used in the BioID approach), mediates the biotinylation of proteins within a range of approximately 10 nm. Hence, when fused to a protein of interest and expressed in cells, it allows the labeling of proximal proteins in their native environment. As opposed to AP that relies on the purification of assembled protein complexes, BioID detects proteins that have been marked within cells no matter whether they are still interacting with the protein of interest when they are isolated. Since it biotinylates proximal proteins, one can moreover capitalize on the exceptional affinity of streptavidin for biotin to very efficiently isolate them. While BioID performs better than AP for identifying transient or weak interactions, both AP- and BioID-mass spectrometry approaches provide an overview of all possible interactions a given protein may have. However, they do not provide information on the context of each identified PPI. Indeed, most proteins are typically part of several complexes, corresponding to distinct maturation steps or different functional units. To address this common limitation of both methods, we have engineered a protein-fragments complementation assay based on the BirA* enzyme. In this assay, two inactive fragments of BirA* can reassemble into an active enzyme when brought in close proximity by two interacting proteins to which they are fused. The resulting split-BioID assay thus allows the labeling of proteins that assemble around a pair of interacting proteins. Provided these two only interact in a given context, split-BioID then allows the analysis of specific context-dependent functional units in their native cellular environment. Here, we provide a step-by-step protocol to test and apply split-BioID to a pair of interacting proteins.

We provide a step-by-step protocol for split-BioID, a protein fragments-complementation assay based on the proximity-labeling technique BioID. Activated on the interaction of two given proteins, it allows the proteomics analysis of context-dependent protein complexes in their native cellular environment. The method is simple, cost-effective and only requires standard laboratory equipment.

פיצול-BioID — ניתוח פרוטיאומיה מבנית של חלבון ספציפי ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most widely used host organism. The flexibility of the system allows for the addition of moieties such as a biotin tag (for streptavidin interactions) and larger functional proteins like green fluorescent protein or cherry red protein. Also, the integration of unnatural amino acids like metal ion chelators, uniquely reactive functional groups, spectroscopic probes, and molecules imparting post-translational modifications has enabled better manipulation of protein properties and functionalities. As a result this technique creates customizable fusion proteins that offer significant utility for various fields of research. More specifically, the biotinylatable protein sequence has been incorporated into many target proteins because of the high affinity interaction between biotin with avidin and streptavidin. This addition has aided in enhancing detection and purification of tagged proteins as well as opening the way for secondary applications such as cell sorting. Thus, biotin-labeled molecules show an increasing and widespread influence in bioindustrial and biomedical fields. For the purpose of our research we have engineered recombinant biotinylated fusion proteins containing nerve growth factor (NGF) and semaphorin3A (Sema3A) functional regions. We have reported previously how these biotinylated fusion proteins, along with other active protein sequences, can be tethered to biomaterials for tissue engineering and regenerative purposes. This protocol outlines the basics of engineering biotinylatable proteins at the milligram scale, utilizing&#160; a T7 lac inducible vector and E. coli expression hosts, starting from transformation to scale-up and purification.

Developing biotinylatable fusion proteins has many potential applications in various fields of research. Recombinant protein engineering is a straight forward procedure that is cost-effective, providing high yields of custom-designed proteins.

ביטוי, בידוד וטיהור של מסיס ובלתי מסיסים חלבונים Biotinylated להתחדשות רקמת עצב

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Bioengineering

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

זיהוי של פני שטח התא באמצעות הגנום בקנה מידה CRISPR/Cas9 מסכים גנטיים

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Genetics

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Biology

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

הערכה של תגובות T-cell Zika וירוס ספציפיים באיברים Immunoprivileged של עכברים נגועים Ifnar1- / -

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Immunology and Infection

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at the plasma membrane. Here, we present detailed protocols for 2 methods that facilitate the study of such processes, both of which are based on the principle of the biotinylation of cell-surface proteins. The first is designed to allow for the semi-quantitative determination of the relative levels of a particular protein at the cell-surface. In it, the lysine residues of the plasma membrane proteins of cells are first labeled with a biotin moiety. Once the cells are lysed, these proteins may then be specifically precipitated via the use of agarose-immobilized streptavidin by exploiting the natural affinity of the latter for biotin. The proteins isolated in such a manner may then be analyzed via a standard western blotting approach. The second method provides a means of determining the endocytic rate of a particular cell-surface target over a period of time. Cell-surface proteins are first modified with a biotin derivative containing a cleavable disulfide bond. The cells are then shifted back to normal culture conditions, which causes the endocytic uptake of a proportion of biotinylated proteins. Next, the disulfide bonds of non-internalized biotin groups are reduced using the membrane-impermeable reducing agent glutathione. Via this approach, endocytosed proteins may thus be isolated and quantified with a high degree of specificity.

Two biotinylation-based methods, designed for determining the cell-surface expression and endocytic rate of proteins expressed at the plasma membrane, are presented in this report.

קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Neuroscience

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Cell-surface Biotinylation Assay

A cell can regulate the amount of particular proteins on its cell membrane through endocytosis, following which cell surface proteins are effectively sequestered in the cytoplasm. Once within a cell, these surface proteins can be either destroyed or &#8220;recycled&#8221; back to the membrane. The cell surface biotinylation assay provides researchers with a way to study these phenomena. The technique makes use of a derivative of the small molecule biotin, which can label surface proteins and then be chemically cleaved. However, if the surface protein is endocytosed, the biotin derivative will be protected from cleavage. Thus, by analyzing the uncleaved, endocytosed biotin label, scientists can assess the amounts of internalized surface proteins.In this video, we review the concepts behind the biotinylation assay, delving into the chemical structure of the biotin derivative and the mechanism of its cleavage. This is followed by a generalized protocol of the technique, and finally, a description of how researchers are currently using it to study the dynamics of different cell surface proteins.

אסיית ביוטינילציה על פני תא

A cell can regulate the amount of particular proteins on its cell membrane through endocytosis, following which cell surface proteins are effectively ...

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Cell Biology

Assessing the Internalization of  Target Surface Proteins Using a Biotin Derivative

Source: Tham, D. K. L., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55974">Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a method to assess target protein internalization in the mouse cortical astrocytes using biotinylation, followed by cell lysis, streptavidin-based protein extraction, denaturation, and Western blot analysis to confirm successful internalization.

הערכת הפנמה של חלבוני פני השטח של המטרה באמצעות נגזרת ביוטין

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Determining Internalization ...

טיהור של biotinylated Cell חלבונים משטח מ

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שיטה של בידוד תא ממוקד באמצעות Functionalization משטח הזכוכית

פיצול-BioID — ניתוח פרוטיאומיה מבנית של חלבון ספציפי ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית

ביטוי, בידוד וטיהור של מסיס ובלתי מסיסים חלבונים Biotinylated להתחדשות רקמת עצב

זיהוי של פני שטח התא באמצעות הגנום בקנה מידה CRISPR/Cas9 מסכים גנטיים

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

הערכה של תגובות T-cell Zika וירוס ספציפיים באיברים Immunoprivileged של עכברים נגועים Ifnar1^{- / -}

קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

אסיית ביוטינילציה על פני תא

הערכת הפנמה של חלבוני פני השטח של המטרה באמצעות נגזרת ביוטין

טיהור של biotinylated Cell חלבונים משטח מ

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שיטה של ​​בידוד תא ממוקד באמצעות Functionalization משטח הזכוכית

פיצול-BioID — ניתוח פרוטיאומיה מבנית של חלבון ספציפי ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית

ביטוי, בידוד וטיהור של מסיס ובלתי מסיסים חלבונים Biotinylated להתחדשות רקמת עצב

זיהוי של פני שטח התא באמצעות הגנום בקנה מידה CRISPR/Cas9 מסכים גנטיים

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

הערכה של תגובות T-cell Zika וירוס ספציפיים באיברים Immunoprivileged של עכברים נגועים Ifnar1- / -

קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

אסיית ביוטינילציה על פני תא

הערכת הפנמה של חלבוני פני השטח של המטרה באמצעות נגזרת ביוטין

שיטה של בידוד תא ממוקד באמצעות Functionalization משטח הזכוכית

הערכה של תגובות T-cell Zika וירוס ספציפיים באיברים Immunoprivileged של עכברים נגועים Ifnar1^{- / -}