Name: quantitative 3d in silico modeling (q3dism) of cerebral amyloid-beta phagocytosis in rodent models of alzheimer's disease
Uploaded: 2016-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative 3D In Silico Modeling q3DISM of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease at JoVE.com

M-V.G-S. is supported by a BrightFocus Foundation Alzheimer's Disease Research Fellowship Award (A2015309F) and an Alzheimer's Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. is supported by an ARCS Foundation and John Douglas French Alzheimer's Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. This work was supported by the National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, to T.T.), an Alzheimer's Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, to T.T.), and an American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, to T.T.). We are grateful for startup funds from the Zilkha Neurogenetic Institute, which helped to make this work possible. &#8195;

הצהרה של אתיקה של מחקר: כל הניסויים מעורבים בעלי חיים המפורטים כאן אושרו על ידי האוניברסיטה של טיפול בבעלי חיים מוסדיים דרום קליפורניה ועדת שימוש (IACUC) וביצע בהתאם קפדנית עם National Institutes of הנחיות בריאות והמלצות מהאגודה הערכה וההסמכה של מעבדה הבינלאומי טיפול בבעלי חיים. בידוד מוח 1. מכרסמים והכנת Immunostaining יום 1: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חולדות TgF344-AD בגילאי (14 בן חודש) או APP / עכברים PS1 (12 בן חודש) בהרדמה isoflurane עמוק רציפה (4%). להעריך את עומק ההרדמה על ידי צביטת בוהן והיעדר רפלקס נסיגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך דרך משני צידי בית החזה ולהרים כדי לחשוף את הלב. הכנס מחט 23 G לתוך החדר השמאלי של הלב ולעשות חתך קטן לתוך העלייה הימנית. המשך exsanguination ידי זלוף transcardial עם פוספט שנאגרו מלוחים קר כקרח(PBS) באמצעות משאבת peristaltic (30 מ&quot;ל לעכברים; 150 - 200 מ&quot;ל לחולדות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך קו האמצע הזנב לתוך העור ולהזיז את העור והשרירים בצד. חותך דרך החלק העליון של הגולגולת לאורך קו האמצע בין העיניים. הסר את צלחות עצם ולבודד את המוח כולו מהגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את המוח לתוך מטריצת מוח מכרסם העטרה ופורס אותו לרבעים. דגירת רבעים אחוריים O / N (16 שעות) מקבע paraformaldehyde (PFA 4% PBS) ב 4 ° C.. 3x לשטוף PBS, ולאחר מכן להעביר עד 70% אתנול. זהירות: PFA הוא רעיל יש לטפל מתחת למכסה המנוע כימי עם ציוד מיגון אישי המתאים. </li></ol> יום 2: <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח רבעים מוח לתוך קלטות הטבעה בהדרגה מייבשי רקמה באמבטיות יותר מרוכזות 1 h אתנול ברציפות (70%, 80%, 95% ו -100% x3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתנול מנקה מהרקמה עם שלוש אמבטיות קסילן רצופות 100% (1 h כל אחד). זהירות: קסילן רעיל shולד להיות מטופלים מתחת למכסה המנוע כימי עם ציוד מיגון אישי המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטמע רקמה בבלוקי פרפין לאחר שתי אמבטיות מותכות פרפין שעווה (56 - 58 ° C, 90 דקות כל אחד). </li></ol> יום 3: <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 10 סעיפים מיקרומטר בעובי של המוח פרפין מוטבע באמצעות microtome. סעיפים לטבול באמבט מים (50 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות) ולמרוח על שקופיות מיקרוסקופ. השאירו את השקופיות להתייבש O / N, הבטחת הידבקות רקמות לשקופית. </li></ol> 2. Immunostaining הערה: שילובים שונים של נוגדנים יכולים להיות מנוצלים עבור ההליך המכתים המתואר להלן. קוקטיילים נוגדן תואם רקמות המוח מפני חולדות ועכברים מפורטים בטבלה 1. יום 4: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deparaffinize החלק במוח באמצעות אמבטיות קסילן 2x 100% (12 דקות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם חלקים במוח באמבטיות אתנול רצופות - 100% במשך 10 דקות, 95% במשך 5 דקות, 80% במשך 10 דקות, ולבסוף 70% במשך 15 דקות - followeד על ידי שטיפות 3x PBS [5 דקות ב RT, עם תסיסה אור]. בינתיים, פתרון יחזור אנטיגן חום עד 95 - 97 ° C על פלטה חשמלית עם ערבוב בר מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חלקה במוח בתמיסה יחזור אנטיגן ב 95 - C ° 97 למשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף 3x ב PBS (5 דקות ב RT, עם תסיסה אור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות יבשות במהירות באמצעות מגבי משימה עדינים כדי למנוע התייבשות רקמה, ולהסיק מחסום הידרופובי מסביב לאזור הרקמה עם עט מחסום הידרופובי. מלא את אזור הרקמה הקיף עם חסימת חיץ [PBS המכיל 0.3% Triton X-100 ו -10% סרום דונקי רגיל (NDS)], לדגור על RT עבור 1 שעות בתא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלף חיץ חסימה עם נוגדן ראשוני Iba1 (מדולל במאגר חסימה) לתייג פגוציטים mononuclear, דגירת O / N ב 4 מעלות צלזיוס בתא humidified. עבור המארחים נוגדן דילולים עובדים, ראה טבלה 1 טבלה של חומרים. </li></ol> יום 5: <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לִשְׁטוֹףנוגדן ראשוני עם אמבטיות 3x PBS (5 דקות ב RT עם תסיסה אור). דגירה עם נוגדנים משני ניאון (מצומדות עם fluorophore פליטה 594 ננומטר) עבור H 1 (בחסימת המאגר ב RT בחושך) ואחריו אמבטיות 3x PBS (5 דקות ב RT עם תסיסה אור). בשלב זה, לשמור על סעיפים בחושך כדי למנוע הלבנת אות ניאון. </li></ol> יום 6 - 7: <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 2.5 &amp; 2.6 עם CD68 (מוח עכברוש) או LAMP1 (רקמות עכבר) נוגדנים ונוגדנים משני מתאימים (בשילוב עם fluorophore פליטה 488 ננומטר) לתייג phagolysosomes. </li></ol> יום 7 - 8: <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 2.5 &amp; 2.6 עם OC (רקמות חולדה) או 4G8 (מוח עכבר) נוגדנים ונוגדנים משני מתאימים (מצמיד את fluorophore 647 ננומטר) לתייג פיקדונות Aβ. הערה: לחלופין, נוגדני 6E10 יכול לשמש היא בהצלחה על רקמות עכבר וחולדה. עבור שילובים נוגדנים מתאימים, ראה טבלה של חומרים </strאונג&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר סעיפים לגמרי יבש O / N ב RT בחושך. לאחר מכן, לכסות דגימות עם תלוש כיסוי האטום על ידי תקשורת הרכבת קרינה המכילה DAPI. </li></ol> 3. רכישת מערכי נתונים גדולים Confocal Z- מחסנית הערה: פרוטוקול זה דורש מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר אוטומטי לחלוטין מצויד מטרה 60X ו 405 ננומטר, 488 ננומטר, 594 ננומטר, ו 647 nm לייזרים. כל הציוד הוא מחשב בשליטת תוכנות שליטה הדמיה לייזר. לפני תחילת פרוטוקול ההדמיה, כוח על מנורת המחשב, epifluorescent, מיקרוסקופ, לייזרי מצלמה. יום 9: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מטרת מיקרוסקופ 60X. מוסיפים שמן טבילה העדשה, ומניחים את המדגם על מחזיק השקופיות הבמה מיקרוסקופ. הרם את המטרה עד שהשמן יוצר קשר עם השקופיות. התאם את מישור המוקד לאיתור פלאק עמילואיד בהיפוקמפוס או קליפת המוח באמצעות תאורה epifluorescent דרך oculars. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת im confocalהגילאים של פגוציטים mononuclear מופעל שמסביב פיקדונות עמילואיד בהיפוקמפוס או קליפת מכרסמים על ידי מיקרוסקופ confocal (בהגדלה 60X, צעדים Z- מחסנית: 0.25 מיקרומטר &lt;z &lt;0.40 מיקרומטר, מספר צעדים 25 &lt;n &lt;35). </li></ol> 4. q3DISM הערה: על מנת להניב תוצאות משמעותיות, אנו ממליצים לנתח מינימום של 3 תמונות לכל חיה / אזור של עניין. עבור כל תמונה, השפע של תאים לנתח עשוי להשתנות תלוי פרדיגמות ניסוי. בתוצאות נציג שהוכח בדו&quot;ח זה, ניתחנו מצב 3 תאים / (למשל, mononuclear פגוציטים רחוקים או הקשורים הפלאק; לראות 1C דמויות - D ו- 2C - D). יום 10: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח מערכי נתונים confocal עם colocalization תוכנת ניתוח עיבוד תמונה 3D מדעית (coloc) מודול בקרבה מרחבית של Iba1 / CD68 (רקמות חולדה) או Iba1 / LAMP1 (רקמות העכבר) מכתים בכל z-מטוסים בו זמנית.צור איבא + / CD68 + או איבא + / LAMP1 + colocalization הערוצים מתאימות phagolysosomes בתוך פגוציטים mononuclear מופעל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר TRITC עבור ערוץ A (המקביל ל מכתים Iba1 יחד עם 594 fluorophore ננומטר) FITC עבור B ערוץ (המקביל ל CD68 או מכתים LAMP1 יחד עם 488 fluorophore ננומטר). בצד הימני של חלון התוכנה עבור &#39;בדיקת מצב, בחר&#39; סף &#39;ועבור&#39; עוצמות coloc &#39;בחר&#39; ערוצי מקור &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;ערוך&#39; כדי לבחור &#39;צבע coloc&#39; בצד הימני של חלון התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל ערוץ בנפרד, להתאים ספים לכלול מכתים ספציפי ואינו כולל אותות רקע / הלא ספציפיים. לאחר מותאם, לא לשנות ספים בין תמונות על מנת להבטיח ניתוח משוחד. ווקסלים colocalized (פיקסלים מכל Z- ערימות) יופיעו בצבע שנבחר בשלב 4.1.2 בכל Z- ערימות SIMultaneously. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;לבנות ערוץ coloc&#39;. ערוץ colocalization נוצר יופיע בחלון התאמת תצוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקישו על ערוץ coloc לפתוח סטטיסטיקת הערוץ. ערך &#39;% נפח / חומר מעל לסף colocalized&#39; מייצגים את% ממסר Iba1 (ווקסלים המתאימים fluorophore 594 ננומטר) colocalized עם LAMP1 או אות CD68 (ווקסלים המתאימים fluorophore 488 ננומטר). יותר פשוט, זה הוא נפח מונוציטים שנכבשו על ידי phagolysosomes (ראה איורים 1 ג ו 2C). הערה: &#39;% של נפח / חומר B מעל לסף colocalized&#39; תואמת% ממסר LAMP1 או CD68 colocalized עם Iba1. זה צריך להיות קרוב ל -100%, כפי phagolysosomes הם מבנים תאיים. הערכים מבוססים על יחס של אות מכל Z- ערימות מעל לסף colocalized. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מודול coloc, לנתח את ערוץ coloc שנוצרה בשלב 4.1 בקרבה מרחבית עם OC (עכברוש tissue) או 4G8 (רקמות העכבר) אותות Aβ. זה מאפשר לכמת Aβ הכמוס בתוך phagolysosomes. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו בערוץ מערך נתונים coloc (המקביל ל Iba1 / CD68 או Iba1 / LAMP1 coloc ערוץ שנוצרה בשלב 4.1) ו Cy5 עבור B ערוץ (fluorophore המתאים OC או 4G8 מכתים יחד עם 647 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניית ערוץ coloc כמתואר 4.1.2 צעדים 4.1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקישו על ערוץ coloc לפתוח סטטיסטיקת הערוץ. ערך &#39;% נפח / חומר מעל לסף colocalized&#39; מייצגים את% של Iba1 / LAMP1 או Iba1 / CD68 (ווקסלים מקבילים לערוץ coloc נבנה בשלב 4.1.5.) Colocalized עם OC או אות 4G8 (ווקסלים מתאימים 647 fluorophore ננומטר). זהו נפח phagolysosomal שנכבשו על ידי Aβ (ראו תרשימים 1D ו 2 ד). הערה: &#39;% של נפח / חומר B מעל לסף colocalized&#39; מתכתב עם% ממסר Aβ הכולל colocalized עם phagolysosomes.זה יכול לשמש כדי להעריך את החלק היחסי של פיקדונות Aβ הכוללים כמוסות בתוך phagolysosomes (לא מוצג בתוצאות הנציג הנוכחיות). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מודול לעלות לשחזר את ערימות תמונת confocal וליצור מודלי 3D של Aβ הכמוס בתוך phagolysosomes מונוציטים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון &#39;תצוגת ההתאמה&#39;, בחר TRITC (כדי להציג רק מכתים Iba1). בחלון &#39;מאפייני נפח&#39;, לחץ על &#39;הוסף שטח חדש&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב &#39;1/5 אלגוריתם&#39;, ב &#39;הגדרות&#39;, בחר &#39;משטח&#39;. כמו כן, ב &#39;צבע&#39;, בחר סוג צבע צבעים או RGB ולהתאים שקיפות (אדום מוגדר ב 60% שקיפות איורים 1B ו -2). סמן תיבה &#39;בחר אזור של אינטרס &quot;. לחץ הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב &#39;2/5 האזור של עניין, &quot;לצייר חלון סביב תא העניין על ידי התאמת x, y ו- z קואורדינטות (ראו תיבות לבנות איורי 1A </strong&gt; ו 2 א). לחץ הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב &#39;ערוץ מקור 3/5&#39;, בחרו בערוץ מקור TRITC. סמן את התיבה &#39;חלקה&#39; ורמת פירוט שטח מוגדר 0.4 מיקרומטר. עבור &#39;thresholding,&#39; לבחור עוצמת מוחלטת. לחץ הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב &#39;4/5 סף, &quot;להתאים סף כך הנפח נוצר חופף באופן מושלם עם אות ערוץ TRITC. לחץ הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב &#39;5/5 לסווג משטחים, &quot;בסעיף&quot; סוג מסנן, &quot;בחר אובייקטים בהתאם לגודלם להיכלל או מחוץ כרכים להיווצר. לחץ על סיום, לבצע את כל שלבי היצירה, וצא האשף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.3.1 עד 4.3.6 כדי ליצור משטח 3D עבור הערוץ FITC (LAMP1 + או CD68 + phagolysosomes). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.3.1 עד 4.3.6 כדי ליצור משטח 3D עבור הערוץ Cy5 (OC + או 4G8 + Aβ פיקדונות). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Brookmeyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+estimates+of+the+prevalence+of+Alzheimer's+disease+in+the+United+States.">National estimates of the prevalence of Alzheimer's disease in the United States.</a> Alzheimers Dement. 7 (1), 61-73 (2011).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).</li><li>Heneka, M. T., Golenbock, D. T., Latz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+Alzheimer's+disease.">Innate immunity in Alzheimer's disease.</a> Nat Immunol. 16 (3), 229-236 (2015).</li><li>Mawuenyega, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+clearance+of+CNS+beta-amyloid+in+Alzheimer's+disease.">Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer's disease.</a> Science. 330 (6012), 1774 (2010).</li><li>Hickman, S. E., Allison, E. K., El Khoury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+dysfunction+and+defective+beta-amyloid+clearance+pathways+in+aging+Alzheimer's+disease+mice.">Microglial dysfunction and defective beta-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer's disease mice.</a> J Neurosci. 28 (33), 8354-8360 (2008).</li><li>Johnston, H., Boutin, H., Allan, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+contribution+of+inflammation+in+models+of+Alzheimer's+disease.">Assessing the contribution of inflammation in models of Alzheimer's disease.</a> Biochem Soc Trans. 39 (4), 886-890 (2011).</li><li>Gjoneska, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+epigenomic+signals+in+mice+and+humans+reveal+immune+basis+of+Alzheimer's+disease.">Conserved epigenomic signals in mice and humans reveal immune basis of Alzheimer's disease.</a> Nature. 518 (7539), 365-369 (2015).</li><li>Reitz, C., Mayeux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer+disease:+epidemiology,+diagnostic+criteria,+risk+factors+and+biomarkers.">Alzheimer disease: epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers.</a> Biochem Pharmacol. 88 (4), 640-651 (2014).</li><li>Hazrati, L. -. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+association+of+CR1+with+Alzheimer's+disease:+a+tentative+disease+mechanism.">Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism.</a> Neurobiol Aging. 33 (12), 2949 (2012).</li><li>Griciuc, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+Disease+Risk+Gene+CD33+Inhibits+Microglial+Uptake+of+Amyloid+Beta.">Alzheimer's Disease Risk Gene CD33 Inhibits Microglial Uptake of Amyloid Beta.</a> Neuron. , 1-13 (2013).</li><li>Li, X., Long, J., He, T., Belshaw, R., Scott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+genomic+approaches+identify+major+pathways+and+upstream+regulators+in+late+onset+Alzheimer's+disease.">Integrated genomic approaches identify major pathways and upstream regulators in late onset Alzheimer's disease.</a> Scientific reports. 5, 12393 (2015).</li><li>Weitz, T. M., Town, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+Alzheimers+Disease:+"Its+All+About+Context".">Microglia in Alzheimers Disease: "Its All About Context".</a> Int J Alzheimers Dis. , 314185 (2012).</li><li>Guillot-Sestier, M. -. V., Doty, K. R., Town, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity+Fights+Alzheimer's+Disease.">Innate Immunity Fights Alzheimer's Disease.</a> Trends Neurosci. 38 (11), 674-681 (2015).</li><li>Guillot-Sestier, M. -. V., Town, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+Alzheimer's+disease:+a+complex+affair.">Innate immunity in Alzheimer's disease: a complex affair.</a> CNS Neurol Disord Drug Targets. 12 (5), 593-607 (2013).</li><li>Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., Borchelt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-expression+of+multiple+transgenes+in+mouse+CNS:+a+comparison+of+strategies.">Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies.</a> Biomol Eng. 17 (6), 157-165 (2001).</li><li>Guillot-Sestier, M. -. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Il10+deficiency+rebalances+innate+immunity+to+mitigate+Alzheimer-like+pathology.">Il10 deficiency rebalances innate immunity to mitigate Alzheimer-like pathology.</a> Neuron. 85 (3), 534-548 (2015).</li><li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+Alzheimer+rat+with+plaques,+tau+pathology,+behavioral+impairment,+oligomeric+a&#946;,+and+frank+neuronal+loss.">A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric a&#946;, and frank neuronal loss.</a> J Neurosci. 33 (15), 6245-6256 (2013).</li><li>Imai, Y., Ibata, I., Ito, D., Ohsawa, K., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene+iba1+in+the+major+histocompatibility+complex+class+III+region+encoding+an+EF+hand+protein+expressed+in+a+monocytic+lineage.">A novel gene iba1 in the major histocompatibility complex class III region encoding an EF hand protein expressed in a monocytic lineage.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (3), 855-862 (1996).</li><li>Ohsawa, K., Imai, Y., Sasaki, Y., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/macrophage-specific+protein+Iba1+binds+to+fimbrin+and+enhances+its+actin-bundling+activity.">Microglia/macrophage-specific protein Iba1 binds to fimbrin and enhances its actin-bundling activity.</a> J Neurochem. 88 (4), 844-856 (2004).</li><li>Bandyopadhyay, U., Nagy, M., Fenton, W. A., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+lipofuscin+in+motor+neurons+of+SOD1-linked+ALS+mice.">Absence of lipofuscin in motor neurons of SOD1-linked ALS mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (30), 11055-11060 (2014).</li><li>Holness, C. L., Simmons, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+CD68,+a+human+macrophage+marker+related+to+lysosomal+glycoproteins.">Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins.</a> Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).</li><li>Connor, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+the+translation+initiation+factor+eIF2alpha+increases+BACE1+levels+and+promotes+amyloidogenesis.">Phosphorylation of the translation initiation factor eIF2alpha increases BACE1 levels and promotes amyloidogenesis.</a> Neuron. 60 (6), 988-1009 (2008).</li><li>Cai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+D1+corrects+impaired+betaAPP+trafficking+and+neurite+outgrowth+in+familial+Alzheimer's+disease-linked+presenilin-1+mutant+neurons.">Phospholipase D1 corrects impaired betaAPP trafficking and neurite outgrowth in familial Alzheimer's disease-linked presenilin-1 mutant neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1936-1940 (2006).</li><li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adaptive+immune+system+restrains+Alzheimer's+disease+pathogenesis+by+modulating+microglial+function.">The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (9), 1316-1325 (2016).</li><li>Lefterov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+deficiency+increases+cerebral+amyloid+angiopathy+and+cognitive+deficits+in+APP/PS1DeltaE9+mice.">Apolipoprotein A-I deficiency increases cerebral amyloid angiopathy and cognitive deficits in APP/PS1DeltaE9 mice.</a> J Biol. Chem. 285 (47), 36945-36957 (2010).</li><li>Blurton-Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+improve+cognition+via+BDNF+in+a+transgenic+model+of+Alzheimer+disease.">Neural stem cells improve cognition via BDNF in a transgenic model of Alzheimer disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13594-13599 (2009).</li><li>Stalder, M., Deller, T., Staufenbiel, M., Jucker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-Reconstruction+of+microglia+and+amyloid+in+APP23+transgenic+mice:+no+evidence+of+intracellular+amyloid.">3D-Reconstruction of microglia and amyloid in APP23 transgenic mice: no evidence of intracellular amyloid.</a> Neurobiol Aging. 22 (3), 427-434 (2001).</li><li>Leinenga, G., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+ultrasound+removes+amyloid-&#946;+and+restores+memory+in+an+Alzheimer's+disease+mouse+model.">Scanning ultrasound removes amyloid-&#946; and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model.</a> Sci Transl Med. 7 (278), 33 (2015).</li><li>Liarski, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+distance+mapping+identifies+functional+T+follicular+helper+cells+in+inflamed+human+renal+tissue.">Cell distance mapping identifies functional T follicular helper cells in inflamed human renal tissue.</a> Sci Transl Med. 6 (230), 46 (2014).</li><li>Nichols, L., Pike, V. W., Cai, L., Innis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+in+vivo+quantitation+of+beta-amyloid:+an+exemplary+biomarker+for+Alzheimer's+disease.">Imaging and in vivo quantitation of beta-amyloid: an exemplary biomarker for Alzheimer's disease.</a> Biol Psychiatry. 59 (10), 940-947 (2006).</li><li>Skovronsky, D. M., Zhang, B., Kung, M. P., Kung, H. F., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+detection+of+amyloid+plaques+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (13), 7609-7614 (2000).</li><li>Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -. A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-Microglia+Cross+Talk+through+Complement+Activation+Modulates+Amyloid+Pathology+in+Mouse+Models+of+Alzheimer's+Disease.">Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease.</a> J Neurosci. 36 (2), 577-589 (2016).</li><li>Novotny, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Synthetic+A&#946;+to+In+Vivo+Active+Seeds+and+Amyloid+Plaque+Formation+in+a+Hippocampal+Slice+Culture+Model.">Conversion of Synthetic A&#946; to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model.</a> J Neurosci. 36 (18), 5084-5093 (2016).</li><li>Tartaro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+fluorescence-based+in+vivo+phagocytosis+assay+to+measure+mononuclear+phagocyte+system+function+in+the+rat.">Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat.</a> J Immunotoxicol. 12 (3), 239-246 (2015).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

הפרוטוקול זה אנו מתארים בדוח זה כדי לכמת 3D אמיתי של phagocytosis Aβ in vivo על ידי פגוציטים mononuclear מסתמך על תיוג ספציפי של תאים סלולריים ו subcellular וכן פיקדונות Aβ. באופן ספציפי, אנו משתמשים Iba1 (מיונן בסידן כריכה מתאם המולקולה 1), חלבון כי הוא מעורב עלעול קרום phagocytosis על תא הפעלה ...

מחלת אלצהיימר (AD), דמנציה 1 הקשורה הגיל הנפוץ ביותר, מאופיין עמילואיד-β מוחין (Aβ) הצטברות כמו &quot;סנילי&quot; הפלאק β עמילואיד, neuroinflammation ברמה נמוכה כרונית, tauopathy, איבוד עצבי, והפרעה קוגניטיבית 2 . במוחות המטופל לספירה, neuroinflammation מיועד ידי תגובתי אסטרוציטים פגוציטים mononuclear (המכונה microglia, למרות המרכזי שלהם לעומת ממוצא הפריפריה עדיין לא ברור) שמסביב Aβ פיקדונות 3. כמו זקיפים החיסון המולדת של מערכת העצבים המרכזית, microglia ממוקמים מרכזי להצליל Aβ. עם זאת, גיוס microglial הפלאק Aβ מלווה מעט מאוד, אם בכלל, Aβ phagocytosis 4,5. אחת ההשערות היא כי microglia הם בתחילה נוירו ידי phagocytozing מכלולים קטנים של Aβ. עם זאת, בסופו של דבר תאים אלה הופכים הנוירו כמו נטל Aβ המכריע ו / או ד תפקודית כתוצאה מהזדקנותecline, מעורר microglia לתוך פנוטיפ מעודד דלקת מתפקדת, תורם לירידה ברעילות וקוגניטיביות 6. הגנום כולו אחרונים מחקרים אגודים (GWAS) זיהו מקבץ של אללים לסיכון לחלות באלצהיימר השייכים מסלולי חיסון מולדים ליבת 7 לווסת phagocytosis 8-11. כתוצאה מכך, התגובה החיסונית בתצהיר עמילואיד מוחין הפך אזור מרכזי של עניין, הן מבחינת הבנת האטיולוגיה לספירה לפיתוח גישות טיפוליות חדשות 12-14. עם זאת, יש צורך חיוני מתודולוגיה להערכת phagocytosis Aβ in vivo. כדי לתת מענה לצורך מסופקים זה, פיתחנו 3D כמותית בדוגמנות סיליקון (q3DISM) כדי לאפשר quantitation 3D אמיתי של phagocytosis Aβ מוחין ידי פגוציטים mononuclear במודלים של מכרסמים של מחלת אלצהיימר דמוי. מוגבל רק על ידי המידה שבה הם לשחזר מחלה, במודלים של בעלי החיים ישהוכח שלא יסולא בפז להבנה לספירה pathoetiology ולהערכה רפוי ניסיון. בשל העובדה כי מוטציות בגנים presenilin (PS) ו חלבון מקדים עמילואיד (APP) עצמאי לגרום לספירה אוטוזומלית דומיננטית, transgenes מוטציה אלה נעשה שימוש נרחב כדי ליצור מודלים מכרסם מהונדס. מהונדס APP / PS1 עכברים coexpressing זמנית &quot;שוודית&quot; APP האנושי מוטציה (swe APP) ו Δ אקסון 9 presenilin 1 אדם מוטציה (PS1ΔE9) הנוכחי עם עמילואידוזיס מוחין מואץ neuroinflammation 15,16. יתר על כן, יצרנו חולדות דו-מהונדס coinjected עם APP swe ובונה PS1ΔE9 (קו TgF344-AD, על רקע פישר 344). בניגוד למודלים עכבר מהונדס של עמילואידוזיס מוחין, חולדות TgF344-AD לפתח עמילואיד מוחין שמקדים tauopathy, אובדן אפופטוטיים של נוירונים, ו ליקוי התנהגותי 17. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים פרוטוקול עבור IMMunostaining microglia, phagolysosomes ופיקדונות Aβ בסעיפי מוח מעכברי APP / PS1 וחולדות TgF344-AD, ורכישת תמונות confocal z-ממדי גדולות. נפרטנו בדור סיליקון וניתוח של שחזורי 3D אמיתיים ממערכות נתוני confocal המאפשרים לכמת ספיגת Aβ לתוך phagolysosomes microglial. באופן כללי יותר, מתודולוגיה נפרט כאן ניתן להשתמש כדי לכמת כמעט כל צורה של phagocytosis in vivo.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott</td><td>NDC 0044-5260-05</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors Blunt tip</td><td>VWR</td><td>82027-588</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>VWR</td><td>94024-408</td><td></td></tr><tr><td>23 G needle</td><td>VWR</td><td>BD305145</td><td></td></tr><tr><td>peristaltic pump FH10</td><td>Thermo Scientific</td><td>72-310-010</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Bioland Scientific</td><td>PBS01-02</td><td>Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x</td></tr><tr><td>Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm&amp;nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm&amp;nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>RBMS-305C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA)</td><td>EMS</td><td>15714-S</td><td>Caution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>89125-188</td><td>Various concentrations, see protocol</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura</td><td>VWR</td><td>25608-774</td><td></td></tr><tr><td>Embedding and Infiltration Paraffin</td><td>VWR</td><td>15147-839</td><td></td></tr><tr><td>Microtome Leica RM2125</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable Microtome Blades&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608-964</td><td></td></tr><tr><td>Water bath Leica HI 1210</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro slide Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056-4X4L</td><td>Caution: Toxic&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Target Retrieval Solution 10x</td><td>DAKO</td><td>S1699</td><td>Working concentration 1x</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic PAP pen</td><td>VWR</td><td>95025-252</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>97062-208</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum (NDS)</td><td>Jackson Immuno</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slide Rack</td><td>VWR</td><td>100492-942</td><td></td></tr><tr><td>Iba1 antibody (polyclonal, rabbit)</td><td>Wako</td><td>019-19741&amp;nbsp;</td><td>Working concentration 1:200</td></tr><tr><td>Iba1 antibody (polyclonal, goat)</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B2645</td><td>Working concentration 1:200</td></tr><tr><td>rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse)</td><td>Abcam</td><td>ab955</td><td>Working concentration 1:200</td></tr><tr><td>mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat)</td><td>Abcam</td><td>ab53444</td><td>Working concentration 1:200</td></tr><tr><td>mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat)</td><td>Affymetrix</td><td>14-1071</td><td>Working concentration 1:100</td></tr><tr><td>Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse)</td><td>Covance</td><td>SIG-39220</td><td>Working concentration 1:200</td></tr><tr><td>Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse)</td><td>Covance</td><td>SIG-39320</td><td>Working concentration 1:200</td></tr><tr><td>OC antibody (polyclonal, rabbit)</td><td>Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine)</td><td>Working concentration 1:200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Working concentration 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 rat secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11006</td><td>Working concentration 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>Working concentration 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11080</td><td>Working concentration 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td>Working concentration 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-21443</td><td>Working concentration 1:1,000</td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A1 Confocal microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Advanced Research software</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris:Bitplane software version 7.6</td><td>Bitplane</td><td></td><td>&quot;coloc&quot; and &quot;supass&quot; modules are used.&amp;nbsp;Alternatively, the open-source freeware&amp;nbsp;ImageJ can be used for colocalization&amp;nbsp;analysis of confocal z-stacks datasets.</td></tr></tbody></table>

quantitative 3d in silico modeling (q3dism) of cerebral amyloid-beta phagocytosis in rodent models of alzheimer's disease

Neuroinflammation מוכרת כיום כגורם אטיולוגי מרכזי למחלות ניווניות. פגוציטים mononuclear הם תאי מולד חיסוניים אחראים phagocytosis ופינוי פסול שאריות. תאים אלה כוללים מקרופאגים CNS-תושב המכונה microglia, ואת phagocytes mononuclear שחדר מהפריפריה. במיקרוסקופ אור כבר משמש בדרך כלל כדי לחזות phagocytosis ב מכרסמים או דגימות מוח אנושי. עם זאת, שיטות איכותיות לא ספקו ראיות מוחלטות של in vivo phagocytosis. כאן אנו מתארים 3D כמותית בדוגמנות סיליקון (q3DISM), שיטה חזקה המאפשרת לכמת 3D אמיתי של עמילואיד-β (Aβ) phagocytosis ידי פגוציטים mononuclear במחלת מכרסם אלצהיימר (AD) מודלים. השיטה כרוכה fluorescently חזותי Aβ כמוסה בתוך phagolysosomes בסעיפי מוח מכרסם. מערכי נתונים confocal z-ממדי גדולים אז 3D המשוחזר כדי לכמת את A &amp;# 946; מרחבית colocalized בתוך phagolysosome. אנו מדגימים את היישום המוצלח של q3DISM כדי מוח עכבר וחולדה, אבל מתודולוגיה זו ניתן להרחיב כמעט כל אירוע phagocytic בכל רקמה.

באמצעות מתודולוגיה רב שלבית עבור q3DISM שפורטו לעיל, אנו מסוגלים לכמת ספיגת Aβ לתוך phagolysosomes מונוציטים במוחם של עכברים APP / PS1 (איור 1) וחולדות TgF344-AD (איור 2). לכן, המתודולוגיה q3DISM אפשרה ניתוח פגוציטים mononuclear במודלים של עכברים וחולדה של AD. מ?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative 3D In Silico Modeling q3DISM of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease at JoVE.com

Quantitative 3D In Silico Modeling q3DISM of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

פיתחנו מתודולוגיה 3D כמותית בדוגמנות סיליקון (q3DISM) של-β עמילואיד מוחין (Aβ) phagocytosis ידי פגוציטים mononuclear במודלים של מכרסמים של מחלת אלצהיימר. שיטה זו ניתן להכליל עבור quantitation של כמעט כל אירוע phagocytic in vivo.

3D כמוני<em&gt; סיליקו</em&gt; דוגמנות (q3DISM) של Phagocytosis עמילואיד-ביתא מוחין במודלים של מכרסמים של מחלת אלצהיימר

Neuroinflammation is now recognized as a major etiological factor in neurodegenerative disease. Mononuclear phagocytes are innate immune cells responsible ...

quantitative-3d-silico-modeling-q3dism-cerebral-amyloid-beta

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

7.9K Views.  University of Southern California (USC).  פיתחנו מתודולוגיה 3D כמותית בדוגמנות סיליקון (q3DISM) של-β עמילואיד מוחין (Aβ) phagocytosis ידי פגוציטים mononuclear במודלים של מכרסמים של מחלת אלצהיימר. שיטה זו ניתן להכליל עבור quantitation של ...

Video: Quantitative 3D In Silico Modeling q3DISM of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

איתור של הפלאק מדלקת עצבים במודל מחלת אלצהיימר עכבר

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Neuroscience

Establishment of a Valuable Mimic of Alzheimer's Disease in Rat Animal Model by Intracerebroventricular Injection of Composited Amyloid Beta Protein

Alzheimer&#39;s disease (AD) is an irreversible, progressive brain disease that slowly destroys memory and is accompanied by neuron loss and structure change. With the increase of AD patients worldwide, the pathology and treatment of the disease has become a focus in the International Pharmaceutical Industry. Thus, the establishment of the animal model to mimic AD in the laboratory is of great importance.
Here, we describe a detailed protocol for establishing a mimic of AD in a rat animal model though intracerebroventricular injection of amyloid beta protein 25-35 (A&#946;25-35) combined with aluminum trichloride (AlCl3) and anterodorsal thalamic nucleus injection of recombinant human transforming growth factor-&#946;1 (RHTGF-&#946;1) to rats. The related markers of AD were measured, including: spatial memory, neuronal structure and substructure, neuronal A&#946;, and neurofibrillary tangles (NFT) production. This rat model demonstrates spatial memory impairment, neuronal structure and substructure pathological changes, neuron intracellular A&#946; burden, and NFT aggregation, and provides a close mimic of the neuronal structure and function disorder to that of clinical AD patients. Thus, the presented AD rat modelprovides a valuable in vivo tool for exploring neuronal function, neuronal pathology, and drug screening of AD.

This is a protocol to mimic Alzheimer&#39;s Disease in rats by evaluation of spatial memory impairment, neuronal pathological changes, neuronal amyloid beta protein (A&#946;) burden, and neurofibrillary tangles aggregation, induced by the injection of A&#946;25-35 combined with aluminum trichloride and recombinant human transforming growth factor-&#946;1.

הקמת לחקות יקר של מחלת אלצהיימר במודל בעלי חיים עכברים באמצעות הזרקת Intracerebroventricular החלבון בטא עמילואיד שערכת

Alzheimer&#39;s disease (AD) is an irreversible, progressive brain disease that slowly destroys memory and is accompanied by neuron loss and structure ...

Behavior

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

עירוי stereotaxic של Oligomeric עמילואיד-ביתא להיפוקמפוס העכבר

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Intracerebroventricular Injection of Amyloid-&#946; Peptides in Normal Mice to Acutely Induce Alzheimer-like Cognitive Deficits

Amyloid-&#946; (A&#946;) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, progressive accumulation of A&#946; oligomers and plaques is observed. Such A&#946; abnormalities are believed to block long-term potentiation, impair synaptic function, and induce cognitive deficits. Clinical and experimental evidences have revealed that the acute increase of A&#946; levels in the brain allows development of Alzheimer-like phenotypes. Hence, a detailed protocol describing how to acutely generate an AD mouse model via the intracerebroventricular (ICV) injection of A&#946; is necessary in many cases. In this protocol, the steps of the experiment with an A&#946;-injected mouse are included, from the preparation of peptides to the testing of behavioral abnormalities. The process of preparing the tools and animal subjects before the injection, of injecting the A&#946; into the mouse brain via ICV injection, and of assessing the degree of cognitive impairment are easily explained throughout the protocol, with an emphasis on tips for effective ICV injection of A&#946;. By mimicking certain aspects of AD with a designated injection of A&#946;, researchers can bypass the aging process and focus on the downstream pathology of A&#946; abnormalities.

The amyloid-&#946; (A&#946;)-injected animal model enables the administration of a defined quantity and species of A&#946; fragments and reduces individual differences within each study group. This protocol describes the intracerebroventricular (ICV) injection of A&#946; without stereotactic instruments, enabling the production of Alzheimer-like behavioral abnormalities in normal mice.

הזרקת intracerebroventricular של פפטידים עמילואיד-β בעכברים נורמליים כדי לגרום בחריפות גירעונות אלצהיימר דמוי קוגניטיבית

Amyloid-&#946; (A&#946;) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, ...

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&#946; and Tau Neuropathology

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional motor behaviors in transgenic mouse models of &#946;-amyloidosis and tauopathy. The paradigm includes tests for spontaneous alternation in a Y-maze, novel object recognition, and limb clasping. These tests were selected because they: 1) interrogate function of cognitive or motor domains and the correlate neural circuitry relevant to the human disease state, 2) have clearly defined endpoints, 3) have easily implementable quality control checks, 4) can be run in a moderate throughput format, and 5) require little intervention by the investigator. These methods are designed for investigators looking to screen compounds for activity in short-term and working memory tasks, or functional motor behaviors associated with Alzheimer's disease mouse models. The methods described here use behavioral tests that engage a number of different brain regions including hippocampus and various cortical areas. Investigators that desire cognitive tests that specifically assess cognition mediated by a single brain region could use these techniques to supplement other behavioral tests.

Described here is a staged, behavioral screening approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional motor behaviors in transgenic mouse models of &#946;-amyloidosis and tauopathy. These methods are optimized to screen compounds for activity in short-term and working memory tasks.

הערכה של חלופה ספונטנית, זיהוי אובייקטים רומנטי ו Clbing איברים מודלים עכבר מהונדס של Amyloid-β ו נוירופתולוגיה טאו

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional ...

Detecting Amyloid-&#946; Accumulation via Immunofluorescent Staining in a Mouse Model of Alzheimer's Disease

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease that contributes to 60-70% dementia around the world. One of the hallmarks of AD undoubtedly lies on accumulation of amyloid-&#946; (A&#946;) in the brain. A&#946; is produced from the proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &#946;-secretase and &#947;-secretase. In pathological circumstances, the increased &#946;-cleavage of APP leads to overproduction of A&#946;, which aggregates into A&#946; plaques. Since A&#946; plaques are a characteristic of AD pathology, detecting the amount of A&#946; is very important in AD research. In this protocol, we introduce the immunofluorescent staining method to visualize A&#946; deposition. The mouse model used in our experiments is 5&#215;FAD, which carries five mutations found in human familial AD. The neuropathological and behavioral deficits of 5xFAD mice are well-documented, which makes it a good animal model to study A&#946; pathology. We will introduce the procedure including transcardial perfusion, cryosectioning, immunofluorescent staining and quantification to detect A&#946; accumulation in 5&#215;FAD mice. With this protocol, researchers can investigate A&#946; pathology in an AD mouse model.

In the neuropathology of Alzheimer's disease, one of the most crucial characteristics is the deposition of amyloid-&#946;. In this protocol, we describe the method of immunofluorescent staining in 5&#215;FAD transgenic mouse to detect amyloid-&#946; accumulation in plaques. The process of perfusion, cryosectioning, staining and quantification will be described in detail.

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease that contributes to 60-70% dementia around the world. One of the hallmarks of AD undoubtedly lies ...

Full- versus Sub-Regional Quantification of Amyloid-Beta Load on Mouse Brain Sections

Extracellular accumulation of amyloid-beta (A&#946;) plaques is one of the major pathological hallmarks of Alzheimer's disease (AD), and is the target of the only FDA-approved disease-modifying treatment for AD. Accordingly, the use of transgenic mouse models that overexpress the amyloid precursor protein and thereby accumulate cerebral A&#946; plaques are widely used to model human AD in mice. Therefore, immunoassays, including enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and immunostaining, commonly measure the A&#946; load in brain tissues derived from AD transgenic mice. Though the methods for A&#946; detection and quantification have been well established and documented, the impact of the size of the region of interest selected in the brain tissue on A&#946; load measurements following immunostaining has not been reported. Therefore, the current protocol aimed to compare the A&#946; load measurements across the full- and sub-regions of interest using an image analysis software. The steps involved in brain tissue preparation, free-floating brain section immunostaining, imaging, and quantification of A&#946; load in full- versus sub-regions of interest are described using brain sections derived from 13-month-old APP/PS1 double transgenic male mice. The current protocol and the results provide valuable information about the impact of the size of the region of interest on A&#946;-positive area quantification, and show a strong correlation between the A&#946;-positive area obtained using the full- and sub-regions of interest analyses for brain sections derived from 13-month-old male APP/PS1 mice that show widespread A&#946; deposition.

The present protocol describes and compares the procedure to perform a full-region or sub-region of interest analysis of sagittal mouse brain sections to quantify amyloid-beta load in the APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.

כימות מלא לעומת תת-אזורי של עומס עמילואיד-בטא על מקטעי מוח של עכבר

Extracellular accumulation of amyloid-beta (A&#946;) plaques is one of the major pathological hallmarks of Alzheimer's disease (AD), and is the target of ...

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic amyloid-&#946; (A&#946;) fragments, eventually leading to the classical features of the disease: amyloid plaques, neurofibrillary tangles and synaptic and neuronal loss. The lack of relevant non-transgenic preclinical models reflective of disease progression is one of the main factors hindering the discovery of effective drug treatments. To this end, we have developed a protocol for the fabrication of alginate microbeads containing amyloid-secreting cells useful for the study of the effects of chronic A&#946; production.
Chinese hamster ovary cells previously transfected with a human APP gene, secreting A&#946; (i.e., 7PA2 cells), were used in this study. A three-dimensional (3D) in vitro model for the sustained release of A&#946; was fabricated by encapsulation of 7PA2 cells in alginate. The process was optimized to target a bead diameter of 500-600 &#956;m for further in vivo studies. Optimization of 7PA2 cell encapsulation in alginate was performed altering fabrication parameters, e.g., alginate concentration, gel flow rate, electrostatic potential, head vibration frequency, gelling solution. Levels of secreted A&#946; were analyzed over time and compared between alginate beads and standard cell culture methods (up to 96 h).
A concentration of 1.5 x 106 7PA2 cells/mL and an alginate concentration of 2% (w/v) buffered with HEPES and subsequent gelation in 0.5 M calcium chloride for 5 min were found to fabricate the most stable microbeads. Fabricated microbeads were 1) of uniform size, 2) with an average diameter of 550 &#956;m, 3) containing about 100-150 cells per microbead and 4) able to secrete A&#946;.
In conclusion, our optimized method for the production of stable alginate microbeads containing amyloid-producing 7PA2 cells might enable the modeling of important aspects of AD both in vitro and in vivo.

This protocol illustrates a cell encapsulation method by rapid physical gelation of alginate to immobilize cells. Obtained microbeads allow controlled and sustained secretion of amyloid-&#946; over time and can be used to study the effects of secreted amyloid-&#946; in in vitro and in vivo models.

הייצור של עמילואיד-β-הפרשה Alginate מיקרו חרוזי לשימוש ב דוגמנות מחלת אלצהיימר

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...

Biology

Establishing an Alzheimer's Disease Rat Model Through an Amyloid-Beta Peptide Injection

Source: Xiaoguang, W., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56157">Establishment of a Valuable Mimic of Alzheimer&#39;s Disease in Rat Animal Model by Intracerebroventricular Injection of Composited Amyloid Beta Protein.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the procedure for injecting amyloid-beta peptides, aluminum chloride, and a neuroinflammatory growth factor, which collectively aids in toxic amyloid plaque formation in the hippocampus region. This causes memory impairment in the rat, characteristic of Alzheimer&#39;s disease.

ביסוס מודל חולדות למחלת אלצהיימר באמצעות הזרקת פפטיד עמילואיד-בטא

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Neurodegenerative Diseases

Direct Stereotaxic Brain Infusion of Amyloid-Beta Proteins for an Alzheimer's Disease Model

Source: Jean, Y. Y. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52805">Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the precise stereotaxic infusion of amyloid beta into the dentate gyrus to establish a mouse model of Alzheimer&#39;s disease. Accurate coordinate determination and controlled delivery of amyloid beta proteins result in neuronal degradation, disrupting memory processing and contributing to Alzheimer&#39;s disease development.

3D כמוני

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video