אנו מודים גארי לאייבסקי לדיונים מועילים על מיקרוסקופיה. עבודה זו מומנה על ידי NIH מענקים R01GM061107 ו R01GM067758 כדי ERG

הערה: ההליך להסרת שריר (איור 1) הוא שינוי של שיטות שתוארו קודם לכן להכנת פילת זחל. השלבים שקודמים אחרי הסרת שריר מתוארים בקצרה ואת הקורא נקרא בעבודה קודמת 10, 11 לתיאורים מפורטים יותר. 1. לנתח זחל מלוח קר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין דילול עובד של מלוחים HL3.1 הקרים 15 או Ca הקר 2 + ללא HL3.1 מלוח 11 (טבלה 1). מניחים את הזחל בצלחת אלסטומר סיליקון עם מי מלח קר מספיק כדי לכסות את החלק התחתון של המנה. הערה: ראה דיון לגבי הבחירה מלוחה. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1x HL3.1 מלוח (pH 7.2) </td></tr><tr><td> 5 HEPES מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 70 מ&quot;מ NaCl </td></tr><tr&gt; <td> 5 מ&quot;מ KCl </td></tr><tr><td> 1.5 מ&quot;מ CaCl 2 (להשמיט עבור Ca 2+ מלוחים -חינם) </td></tr><tr><td> 4 מ&quot;מ MgCl 2 </td></tr><tr><td> 10 מ&quot;מ NaHCO 3 </td></tr><tr><td> 5 trehalose מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 115 סוכרוז mM </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> סנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C </td></tr><tr><td> הערה: מחק רכב חרקי hemolymph </td></tr></tbody></table> רכב טבלת 1. קרה מלוחה. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הזחל עם למעלה בצד הגחון. המשטח הגחון של הזחל יכול להיות מזוהה על ידי חגורות dentical הבטן בצד הגבי על ידי צינורות לקנה הנשימה הזחל העיקרי פועל מן הקדמי אל האחורי. מתחו את הזחל בכיוון הקדמי, האחורי ולהצמיד את הראש והזנב עלאלסטומר סיליקון לנתח צלחת באמצעות סיכות חרקים. השתמש במספריים לנתח בסדר לחתוך לאורך קו האמצע הגחון, החל בקצה אחד מתקדם לעבר הקצה השני. הערה: כיוון זה משמר את האשכול הגבה למד הנפוצה של דה נוירונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזחל הוא חתך פתוח, להצמיד מארבע כנפות כדי בצלחת לנתח כאילו לפתוח ספר. שימוש במלקחיים כדי לתפוס ולהסיר איברים פנימיים כולל מערכת העצבים המרכזית, המעיים, ואת קנה הנשימה. התאם סיכות חרקים כך הפילה מתוחה אבל לא נמתח מקסימאלי. הערה: שרירים מעוגנים אל קיר הגוף בגבולות מגזריים. למרות שרירים המכסים את רוב קיר הגוף, הם נעדרים אזור צר ליד קו האמצע הגבה. </li></ol> הסרת שרירים 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את קו האמצע הגבי של הזחל, שבו רקמת שריר תיאור. יישור שיניים מלקחיים אחת כזאת שזה יכול להיות מוכנס מתחת רקמת שריר בכיוון השטוח ביותר האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחיל בקו אמצע הגב, ליד הגבול הקדמי של המגזר, החלק בזהירות את שן המלקחיים בין השרירים האפידרמיס, מקפיד לצמצם מגע בין המלקחיים האפידרמיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את המלקחיים כלפי מעלה כדי לשבור את החיבור של השריר אל קיר הגוף בשלב עוגן אחד. חזור על תהליך זה עבור חמי קטע הנותרים (ים) של עניין. הערה: פרוטוקול זה מייעל שימור האחורי של כל שדה דנדריט נוירון דה. כדי לשמר את החלק הקדמי של השדה דנדריט, עדיף להכניס את שן מלקחיים בקצה האחורי של כל פלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים מחדש סיכות חרקים כך פילת הזחל נמתחה מקסימלי לכל הכיוונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הפילה בזמן שהוא עדיין מוצמד אל הצלחת לנתח באמצעות פורמלדהיד 4% קרים, מוכן טרי PBS במשך 25 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 5 פעמים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים כדי להתרחק רקמות שריר בזהירות מנקודות העוגן הנותרים, מקפיד למזער contact עם האפידרמיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביטול הצמדה ולהסיר את פילה מצלחת לנתח לצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. בצע את כל הכביסה הבאה, חסימה, והצעדים המכתימים immunofluorescence, כפי שתואר לעיל 11. </li></ol> 3. רכב את פילת הזחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית להסיר את הראש והזנב באמצעות מספריים לנתח גלם על מנת להפוך את המדגם שטוח ככל האפשר. הר פילה על coverslip ב antifade mountant עם המשטח הפנימי של פילה מול coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שקופית מיקרוסקופ על coverslip ולחץ בעדינות כדי לפזר את ההרכבה בינונית. תהפכו את השקופית מיקרוסקופ שוב לאטום את coverslip בשקופית באמצעות לק. ניתן לאחסן שקופיות ב -20 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד לפחות. </li></ol>

<ol>
	<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+out:+mechanisms+of+dendritic+arborization.">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+establish+dendrite-substrate+relationships+that+promote+dendritic+self-avoidance+and+patterning+in+Drosophila+sensory+neurons.">Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).</li><li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+regulate+repulsion-mediated+dendritic+patterning+of+Drosophila+sensory+neurons+by+restricting+dendrites+in+a+2D+space.">Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space.</a> Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).</li><li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+Drosophila+sensory+neurons.">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li><li>Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+bantam+regulates+a+developmental+transition+in+epithelial+cells+that+restricts+sensory+dendrite+growth.">The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth.</a> Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).</li><li>Meltzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermis-derived+Semaphorin+promotes+dendrite+self-avoidance+by+regulating+dendrite-substrate+adhesion+in+Drosophila+sensory+neurons.">Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).</li><li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+cells+are+the+primary+phagocytes+in+the+fragmentation+and+clearance+of+degenerating+dendrites+in+Drosophila.">Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila.</a> Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li><li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+analysis+of+Drosophila+larval+peripheral+sensory+neuron+dendrites+and+axons+using+genetic+mosaics.">Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics.</a> J Vis Exp. (57), e3111 (2011).</li><li>Gustafsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+flow+quantified+beyond+the+diffraction+limit+by+spatiotemporal+image+correlation+of+structured+illumination+microscopy+data.">Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data.</a> Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).</li><li>Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound+response+mediated+by+the+TRP+channels+NOMPC,+NANCHUNG,+and+INACTIVE+in+chordotonal+organs+of+Drosophila+larvae.">Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae.</a> PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

הנה פרוטוקול מתואר על הסרה ידנית של רקמת שריר מן פילת זחל תסיסנית. פרוטוקול זה משנה תאר טכניקות לנתיחת זחל בעבר 10,11. לאחר הזחל גזור בצלחת אלסטומר סיליקון, קו אמצע הגב ממוקם. ראש חץ מלקחיים יחיד, באורינטציה האפשרית השטוח שלה, מוכנס בזהירות בין רקמת השריר ואת ה...

נוירונים arborization הדנדריטים זחל תסיסנית (da) לספק מודל ערך ללימוד פיתוח עצבי בשל amenability שלהם מניפולציה גנטית ואת הקלות שבה הם יכולים להיות צלמו. עצב סנסורי אלה כבר סייע בזיהוי מסלולים רבים השולטים דנדריט morphogenesis 1-3. ארבע כיתות של דה נוירונים (אני בכיתה - IV) המעצבבים האפידרמיס הזחל. נוירונים אלה שיוותרו בין קרום במרתף ואת האפידרמיס, עם הדנדריטים שלהם ויוצרים מערכים דו מימדי בעיקר 4,5. של ארבע כיתות, נוירונים דה IV סוג יש סוכות מסועפת מאוד ביותר, כמו עצב סנסורי של בעלי חיים אחרים, פירוט של סוכות אלה מחייב גורמים פנימיים כמו גם רמזים מרקמות שכנות, במיוחד האפידרמיס, להתפתחותם 6-9 . מחקרים כדי לקבוע כיצד כגון עצבי עובדה נוספת עצביתORS לשלוט תועלת המורפוגנזה דנדריט מהיכולת לזהות ביטוי חלבון באתרו על ידי immunofluorescence. לציפורן החיצוני של הזחל הוא בלתי חדיר נוגדנים, אבל מניעה זו היא להתגבר בקלות על ידי הכנת פילת זחל באמצעות שיטות לנתיחה ומבוססות 10,11. עם זאת, רקמת השריר בגוף הקיר שנמצאה רק פנים אל הקרום במרתף מציגה מספר אתגרים כלפי להדמיה של נוירונים דה ותאי אפידרמיס. ראשית, רקמת השריר, אשר הקווים ביותר של קיר הגוף, מטשטשים אותות ניאון מאוד שמקורם ברקמה עצבית או אפידרמיס. זה מפחית באופן משמעותי את יחס האות לרעש במדגם. שנית, חלבונים רלוונטיים רבים עשויים לבוא לידי ביטוי ברקמת השריר כמו גם בתאי העצב או האפידרמיס. אותות קרינת נגזרות שריר זה עשוי זיהוי מעורפל נוסף של אות קרינה מן הנוירון או האפידרמיס. לבסוף, ההתקדמות בטכנולוגיות מיקרוסקופיה לאהדמית יתר w של דגימות ברזולוצית המשנה דיפרקציה וכן עשויה להיות מועילה במיוחד הבחנת הלוקליזציה של חלבונים אשר מתבטאים בנוירונים והסביבה תא אפידרמיס 12,13. עם זאת, הדמיה באמצעות הטבות מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה מ איתות חזקה יחס רעש בסמיכות של המדגם כדי coverslip. בנוסף הפחתת יחס האות לרעש, מרחקי שריר קיר גוף הזחל דה נוירונים מן coverslip, וכך להגביל את רזולוציית תמונה המשופרת שניתן להשיג עם שיטות מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה. מלבד אתגרים לניתוח immunofluorescence, רקמת שריר מציגה מחסום הקלטת אלקטרו מן עצב סנסורי בקיר גוף הזחל. הסרתו ולכן הטבות מניפולציה הנוירופיזיולוגיים של עצב סנסורי 14. הנה שיטה להסרה ידנית של רקמת שריר זחל תסיסנית מתוארת. אנו מראים כי p הפרוטוקול שלנוהדמיה immunofluorescence ermits של חלבונים כי הם מוסתרים אחרת על ידי רקמת שריר, משפר את יחס אות לרעש להדמיה של נוירונים דה IV בכיתה, ומאפשר את השימוש במיקרוסקופ סופר-רזולוציה להפלות יחסים מרחבית טובה יותר של חלבונים ומבנים הסלולר דה נוירונים האפידרמיס.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 tweezers</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-D</td><td></td></tr><tr><td>Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips</td><td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>for dissecting plates</td></tr><tr><td>Austerlitz insect pins, 0.1 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Fostec 8375 light source</td><td>Artisan Technology Group</td><td>62792-4</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifade mounting medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>for confocal microscopy</td></tr><tr><td>Prolong Diamond antifade mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36970</td><td>for structured illumination microscopy</td></tr><tr><td>Micro cover glass, 22 x 22 mm, No. 1.5</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Coracle antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>C615.16</td><td>supernatant, dilute 1:50</td></tr><tr><td>Mouse anti-Discs large antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4F3</td><td>supernatant, dilute 1:50</td></tr><tr><td>Rabbit anti-dsRed antibody</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>dilute 1:1,000</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>dilute 1:1,000</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>dilute 1:500</td></tr></tbody></table>

removal of drosophila muscle tissue from larval fillets for immunofluorescence analysis of sensory neurons and epidermal cells

נוירונים arborization הדנדריטים הזחל תסיסנית (דה) הם מודל פופולרי על חקירת מנגנוני המורפוגנזה העצבית. נוירונים דה להתפתח תקשורת עם תאי אפידרמיס הם מעצבבים ובכך יתרונות הניתוח שלהם להדמיה באתרו של שני החלבונים הביעו neuronally ו epidermally ידי immunofluorescence. שיטות מסורתיות של הכנת פילת זחל לניסויי immunofluorescence להשאיר על כנו את רקמת השריר שמכסה את רוב קיר הגוף, הצגת מספר אתגרי הדמית חלבונים עצביים ו אפידרמיס. כאן אנו מתארים שיטה להסרת רקמת שריר מן פילת זחל תסיסנית. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של חלבונים כי הם מוסתרים אחרת על ידי רקמת שריר, משפר יחס אות לרעש, ומקל על שימוש במיקרוסקופ ברזולוצית סופר ללמוד דה פיתוח נוירון.

אנו להדגים את התועלת של הליך ההסרה שריר לשיפור יחס אות לרעש בניסויים immunofluorescence לשתף לדמיין חלבונים צומת septate Coracle (קורה) ו דיסקים-גדול (DLG) יחד עם נוירונים דה IV בכיתה שכותרתו עם סמן קרום CD4- tdTomato. קורה כבר השתמשו בעב?...

Watch this Scientific Journal Video about Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells at JoVE.com

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

מחקרים של המורפוגנזה העצבית באמצעות arborization הדנדריטים הזחל תסיסנית (da) נוירונים ליהנות להדמיה באתרו של חלבונים עצביים ו אפידרמיס על ידי immunofluorescence. אנו מתארים הליך המשפר ניתוח immunofluorescence של דה נוירונים ותאי אפידרמיס סביב על ידי הסרת רקמת שריר מקיר גוף הזחל.

הסרה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; רקמת שריר מן הזחל פילה עבור ניתוח Immunofluorescence של עצב סנסורי ותאי עוריות

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

removal-drosophila-muscle-tissue-from-larval-fillets-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

8.9K Views.  Princeton University.  מחקרים של המורפוגנזה העצבית באמצעות arborization הדנדריטים הזחל תסיסנית (da) נוירונים ליהנות להדמיה באתרו של חלבונים עצביים ו אפידרמיס על ידי immunofluorescence. אנו מתארים הליך המשפר ניתוח immunofluorescence של דה נוירונים ותאי אפידרמיס סביב על ידי הסר...

Video: Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

חיתוך של דרוזופילה מלאנוסטר שרירי הטיסה לגישות omics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Genetics

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

תסיסנית הזחל Dissection NMJ

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Biology

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

תסיסנית הזחל NMJ אימונוהיסטוכימיה

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

צפייה ברשתות מיקרוטובולים בצמתים עצביים-שריריים של דרוזופילה ובתאי שריר

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

מחבר זרקור: הבנת רשת מיקרוטובולים בצמתים עצביים-שריריים דרוזופילה 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with ...

אבלציה של נוירון יחיד בדרוזופילה לחקר הסתגלות מערכת העצבים

Laser Cell Ablation in Intact Drosophila Larvae Reveals Synaptic Competition

The protocol describes single-neuron ablation with a 2-photon laser system in the central nervous system (CNS) of intact Drosophila melanogaster larvae. Using this non-invasive method, the developing nervous system can be manipulated in a cell-specific manner. Disrupting the development of individual neurons in a network can be used to study how the nervous system can compensate for the loss of synaptic input. Individual neurons were specifically ablated in the giant fiber system of Drosophila, with a focus on two neurons: the presynaptic giant fiber (GF) and the postsynaptic tergotrochanteral motor neuron (TTMn). The GF synapses with the ipsilateral TTMn, which is crucial to the escape response. Ablating one of the GFs in the 3rd instar brain, just after the GF starts axonal growth, permanently removes the cell during the development of the CNS. The remaining GF reacts to the absent neighbor and forms an ectopic synaptic terminal to the contralateral TTMn. This atypical, bilaterally symmetric terminal innervates both TTMns, as demonstrated by dye coupling, and drives both motor neurons, as demonstrated by electrophysiological assays. In summary, the ablation of a single interneuron demonstrates synaptic competition between a bilateral pair of neurons that can compensate for the loss of one neuron and restore normal responses to the escape circuit.

מחבר זרקור: חקירת המנגנונים של הרכבת מעגלים עצביים והיווצרות סינפסות בדרוזופילה

This protocol demonstrates the laser cell ablation of individual neurons in intact Drosophila larvae. The method enables the study of the effect of reducing competition between neurons in the developing nervous system.

אבלציה של תאי לייזר בזחלי דרוזופילה שלמים חושפת תחרות סינפטית

The protocol describes single-neuron ablation with a 2-photon laser system in the central nervous system (CNS) of intact Drosophila melanogaster larvae. ...

הסרה של

Summary

Explore More Videos

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

חיתוך של דרוזופילה מלאנוסטר שרירי הטיסה לגישות omics

תסיסנית הזחל Dissection NMJ

תסיסנית הזחל NMJ אימונוהיסטוכימיה

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים

שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים

שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים

אבלציה של תאי לייזר בזחלי דרוזופילה שלמים חושפת תחרות סינפטית