Name: preparation of extracellular matrix protein fibers for brillouin spectroscopy
Uploaded: 2016-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy at JoVE.com

This work was supported by the Engineering and Physical Sciences Research Council [grant number EP/M028739/1]. RSE was supported by a Santander Postgraduate Research Award 2015.

זהירות: יש להתייעץ פרוטוקולי בטיחות ביולוגיים וכל גיליונות נתוני בטיחות חומרים הרלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. הלייזר המועסקים ניסויים אלה היא לייזר 3B מחלקה; ועמידה בכללי מקומי לשימוש בטוח של המערכת נדרשת. אנא להשתמש בכל שיטות הבטיחות המתאימות בעת ביצוע מדידת ספקטרוסקופיה ליזר כולל השימוש בציוד מגן אישי (משקפי בטיחות). גידי זנב התקבלו חולדות Wistar ישנות 7-8 בשבוע המורדם למטרות אחרות בהתאם לתקנות איחוד אירופאיות 1099/2009 ורווחת בעלי החיים (שחיטה או הריגה) לתקנות 1995. רצועות עורפיות השור התקבלו מטבחיים מקומי. 1. הכנת סיבים לדוגמא הערה: סיבי חלבון של מטריקס ניתן לחלץ מרקמות שונות, באמצעות הליכים שונים. פרוטוקולים זוקקו בהתאם לנהלים מיושמים באופן נרחב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"><strong&gt; הפקת סיבי קולגן מזנב עכברוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן עכברוש ידי הזרקה תוך הצפק של 100 מ&quot;ג / ק&quot;ג של pentobarbitone נתרן משקל הגוף. ואז לנתק את הזנב ישירות בנקודת המגע עם הגוף, לחיצה עם סכין גילוח חד בקצה. עוטפים את הזנב בניילון ולאחסן קפוא זה ב -20 ° C עד הנדרשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף בזנב מהמקפיא, לחתוך קטע ארוך 20 מ&quot;מ מהקצה הפרוקסימלי תוך עדיין קפוא ואז להשאירו להפשיר בצלחת פטרי מלאות בופר פוספט (PBS) פתרון (pH 7.4) בשעה RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזנב הוא מופשר, עושים חתך לאורכו של קטע באמצעות אזמל לפצל את העור. ואז לקלף בחזרה לחשוף ארבע צרורות גיד עטופות על חולית הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר נזהרים שלא חל כל-זן מראש, בעדינות לצייר כל סיב מתוך מעטפת ולמקם אותו בקבוקון המכיל מים מזוקקים עם 0.01% w / v אזיד הנתרן (NaN 3) יחסי ציבוראירוע התפתחות חיידקים, ולאחסן בקירור. זנב יחיד מניב סביב שלושים סיבי הגיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל סוג סיבי טהור שאני קולגן, להחיל תהליך עיכול אנזימטי שלושה חלק 10 לסיבי הגיד להסיר את proteoglycans וכל חומר noncollagenous אחר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לטבול את הסיבים 0.125 U / ml chondroitinase ABC ב 0.05 חיץ M טריס ו 0.06 M נתרן אצטט (CH 3 COONa) ב- pH 8.0 למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס חממה רועד ב 200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לטבול את הסיבים 1 U / ml hyaluronidase Streptomyces 0.05 חיץ M טריס ו 0.15 M נתרן כלורי (NaCl) ב- pH 6.0 ולחזור אל האינקובטור רעד במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, לטבול את הסיבים 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל של טריפסין ב 0.05 M פוספט נתרן (NaHPO 4) ו 0.15 M NaCl ב- pH 7.2 עבור 16 שעות בחממה רועד ב 37 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את סיבי מטוהרים המצוננים בקבוקונים המכילים מים מזוקקים, wi0.01 ה% NaN 3 על מנת למנוע התפתחות חיידקים, עד הנדרשים למדידה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת סיבי האלסטין מן הרצועה עורפית שור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג רצועה עורפית שור מן מטבחיים, לעטוף אותו בניילון ולאחסן קפוא זה ב -20 ° C עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצר אלסטין טהור, לאסוף את הרצועה מהמקפיא, לאפשר לו להפשיר ב RT, defat זה באמצעות אזמל ולעכל את הרצועה באמבט מים רותחים על פי הנוהל Lansing, 11 כדלקמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 0.1 M פתרון של נתרן הידרוקסידי (NaOH) במים מזוקקים ולהוסיף אותו הרצועה הנטולה השומן בבקבוק חרוטים, מכסה את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיח את הבקבוק בתוך אמבט מים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרצועה מבקבוק העיכול ולשטוף את גוש הרקמה המסיס במים מזוקקים מספר פעמים עד pH 7.0 (פיקוח באמצעות מד pH) מתקבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת הרקמה מהגמרלשטוף פתרון לצלול אותו במים מזוקקים (מעורבב עם 0.01% NaN 3 על מנת למנוע התפתחות חיידקים) במיכל אטום ולאחסן אותו בקירור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את רקמות מהמקרר, נזהרים שלא להפעיל כוח רב מדי-זן מראש, פינצטה שימוש למשוך פלחי ואלסטין קטן בעדינות (20 עד 50 מ&quot;מ אורך, בערך 2 מ&quot;מ עובי) הרחק בלוק גדול יותר ומניחים אותם בצלחת פטרי עם פתרון PBS (pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר, בעדינות להקניט צרורות סיבים קטנים סביב 1 מ&quot;מ עובי וחותכים אותם באורכים של כמה מ&quot;מ באמצעות אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את סיבי כדי בקבוקונים המכילים מים מזוקקים (עם 0.01% NaN 3 על מנת למנוע התפתחות חיידקים) ולאחסן בקירור אותם עד הנדרשים למדידה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבת הסיבים על מצע רעיוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות חותך יהלומים, לחתוך חתיכה של שקופיות סיליקון רעיוניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור compartme hydratedNT, לחתוך רצועה של Parafilm כדי להתאים את השקופית סיליקון עם חתך חלול במרכז (גדול מספיק כדי להתאים סיב) ולמקם אותו על גבי המצע סיליקון. הערה: עבור מדידות סיבים יבשות, לחתוך את parafilm לתוך צורת U כך שאחד מארבעת הצדדים נשאר פתוח לאוויר כאשר אטום בשלב 1.3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסיבים מהמקרר, להשתמש זוג מלקחיים בסדר לאסוף סיב בודד מפתרון האחסון ומניח אותו בצלחת קטנה פטרי מלא מים טהורים ב RT במשך 5 דקות כדי לשטוף את המדגם. לאחר מכן, לאסוף את הסיב ולהעבירו למרכז החלול parafilm על פני מצע סיליקון. זהירות: למנוע נזק סיבים ידי מותח אותו במהלך פעולה זו, ולהימנע לצידוד המדגם על פני המצע, מכיוון שהדבר עלול לגרום לשינוי תכונות מכניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח coverslip זכוכית דק על הסיבים ולאטום את החדר על ידי עובר מלחם מחומם בעדינות על משטח הזכוכית כדי להמס את parafilm מתחתהזכוכית. זהירות: למנוע נזק סיבים לא להביא למצב קצה הלחמה קרוב מדי או חימום המצע מוגזם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את התא האטום על משטח שטוח תחת משקל קטן ולהשאיר אותה במשך כ -12 שעות כדי להשיג קשר טוב בין המצע המדגם סיליקון, תוך הימנעות ניזק הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המשקל ולאבטח את התא במקום על פני המצע, באמצעות ברגים. </li></ol></li></ol> 2. הגדרת הניסוי ברילואן ורכישת סיבים ספקטרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תא מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר מדגם מוכן כמו חלק 1.3 על בעל אנכי מצויד goniometer לאפשר סיבוב מטוס של המדגם תוך שמירה על זווית פיזור קבוע (2 Φ = 90 °, ראה איור SI-1) ופיזרו עמדה נפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע התאמה מדויקת להתמקד של אור הליזר על המדגם דרך leננו-שניות. 9 זהירות: הכוח פלט לייזר עשוי להיות גבוה מדי ולייצר כוויה במדגם. ודא כי הוא מוגדר גבוה מספיק כדי לתת רגישות טובה אך לא גבוהה מדי כדי למנוע נזק המדגם. כאן השתמשנו כוח של CA. 76 mW על המדגם. זה היה מספיק כדי לקבל רגישות טובה בלי לשרוף את המדגם, גם בהתחשב שמדובר דק במגע עם מצע מסייע שמגרש את החום שנוצר על ידי תאורת ליזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את המדגם בזווית של 45 מעלות (Φ) אל קרן הלייזר האירוע באמצעות סולם Vernier. להשיג מיצוב אופטימלי על ידי הפעלת מדידה למקסם את עוצמת הפסגות בספקטרום (ראה להלן). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת ספקטרומטר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנה לרכישה ומניפולציה של הנתונים ולהגדיר את רכישת ספקטרום ברילואן של המדגם 12. ההליך המתואר כאן חל על muאינטרפרומטר טנדם ltipass (איור SI-1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את השנייה פברי פרו- (FP) התאבכות שינוי המתח עצמאי להחיל את פייזו ידי יחידת הבקרה. עבור הליך טרום יישור זה, מלאו אחר האור המוחזר על ידי כל FP. כאשר עוצמת שמשתקף שני FPS שואף לאפס, את היישור הנכון הוא הגיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיול הספקטרום: טווח התדרים נגישים, או בטווח הספקטרום חינם (FSR), תלוי את המרחק בין שתי מראות של חלל FP הראשון, L, דרך FSR = c / 2 L, כאשר c היא מהירות האור L נמדדת על ידי מד חיוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנכרן את הסריקות של שתי התאבכות FP ולעבור המערכת האופטית לתצורת multipass טנדם. פקד משוב של עוצמת אור הליזר מועברת אוטומטית ישמור על היישור של שני FPS במהלך המדידה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדידת רמת נוזלf ברילואן ספקטרה זהירות: הספקטרום ברילואן תלוי מאוד הטמפרטורה הידרציה של המדגם ובקר כה נזהר בפרמטרים הוא מפתח להשגת ספקטרום לשחזור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל רכישת ספקטרום ברילואן של המדגם ולהפעיל אותו עד יחס אות לרעש טוב מושגת. פעולה זו עשויה להימשך מספר דקות, בהתאם חתך פיזור, הריכוז והעובי של המדגם. הערה: אין כלל אצבע עבור יחס אות לרעש אבל האיכות ספקטרלי נבדקת על ידי בניסויים על פי המדגם המבוקש המנותח. יש trade-off בין איכות רפאים ומשך המדידה, ולכן הפרמטרים הניסיונות צריכות להיבחר בהתאם ליישום הספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור המדידה של דגימות יבשות, את הספקטרום רצוף - עבור כל אחד מהם, לאחר שלב 2.3.1 - עד אין שינויים במצב של הפסגות iים שנצפה. זו מושגת כאשר המדגם הוא בשיווי משקל עם האווירה בחדר ולא ייבוש נוסף ישפיע על הספקטרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את קיטוב האור (VV או VH; V מייצג אנכיים H עבור הכיוון האופקי של יחסי קיטוב האור לכדור פיזור) ולרכוש ספקטרום בכל זווית לציר סיבים (θ; איור SI-1) על ידי החלפה של מדגם מטוס ביד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הספקטרום ברילואן להגיש לעיבוד שלאחר מכן. </li></ol></li></ol> 3. ניתוח של ברילואן ספקטרה הערה: ניתוח Fit של פסגות ברילואן ניתן לבצע באמצעות פונקציות שונות. מתנד הרמוני דיכא (DHO) 4,13 פונקציה נבחר זהו מודל תקף פסגות שמקורם מצבי אקוסטי דיכא במדיה viscoelastic. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח Fit של פסגות ברילואן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את טווח הספקטרום עבור השיא של עניין הדואר ספקטרום ברילואן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר בסיס ב בכושר אם ברקע ספקטרלי הוא הרבה יותר גבוה מאפס. הערה: הבסיס יכול להשתנות בין ספקטרומים. ודא כי התיקון מיושם באופן שיטתי לשחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח ריבועים מפורטים לפחות הולם באמצעות פונקציה DHO 4,13 אל פסגת ברילואן עניין איטרטיבי עד ההתכנסות מושגת ואת עקומת ההתאמה האופטימלית מתקבלת. כעת שמור את התוצאות לנכון להגיש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג ערכים ממוצעים מהפרמטרים ההתאמה של שני שיאים של כל כפיל ברילואן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את מהירות גל אקוסטי מתדירות השיא (באמצעות הביטוי להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את תוצאות בכושר באמצעות גרפים, למשל, מהירות גל אקוסטי לעומת זווית לציר סיבים, θ , ולהחיל מודלים רלוונטיים (למשל, עבור מערכות איזוטרופי אקוסטית 9) כדי לחלץ כמויות מכאניות כגון מקדמי מותח גמישות. </li></ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brillouin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+de+la+lumi&#232;re+et+des+rayonnes+X+par+un+corps+transparent+homog&#232;ne;+influence+de+l'agitation+thermique.">Diffusion de la lumi&#232;re et des rayonnes X par un corps transparent homog&#232;ne; influence de l'agitation thermique.</a> Ann. Phys. 17, 88-122 (1922).</li><li>Caponi, S., Corezzi, S., Mattarelli, M., Fioretto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+effects+on+the+elastic+properties+of+amorphous+polymeric+materials.">Stress effects on the elastic properties of amorphous polymeric materials.</a> J. Chem. Phys. 141 (21), 214901 (2014).</li><li>Mattarelli, M., Montagna, M., Still, T., Schneider, D., Fytas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibration+spectroscopy+of+weakly+interacting+mesoscopic+colloids.">Vibration spectroscopy of weakly interacting mesoscopic colloids.</a> Soft Matter. 8 (15), 4235-4243 (2012).</li><li>Comez, L., Masciovecchio, C., Monaco, G., Fioretto, D., Robert, E. C., Robert, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Solid State Physics. 63, 1-77 (2012).</li><li>Madami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+a+propagating+spin+wave+induced+by+spin-transfer+torque.">Direct observation of a propagating spin wave induced by spin-transfer torque.</a> Nat. Nanotechnol. 6 (10), 635-638 (2011).</li><li>Harley, R., James, D., Miller, A., White, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phonons+and+the+elastic+moduli+of+collagen+and+muscle.">Phonons and the elastic moduli of collagen and muscle.</a> Nature. 267 (5608), 285-287 (1977).</li><li>Cusack, S., Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+elastic+constants+of+collagen+by+Brillouin+light+scattering.">Determination of the elastic constants of collagen by Brillouin light scattering.</a> J. Mol. Biol. 135 (1), 39-51 (1979).</li><li>Vaughan, J. M., Randall, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brillouin+scattering,+density+and+elastic+properties+of+the+lens+and+cornea+of+the+eye.">Brillouin scattering, density and elastic properties of the lens and cornea of the eye.</a> Nature. 284 (5755), 489-491 (1980).</li><li>Palombo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanics+of+fibrous+proteins+of+the+extracellular+matrix+studied+by+Brillouin+scattering.">Biomechanics of fibrous proteins of the extracellular matrix studied by Brillouin scattering.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (101), (2014).</li><li>Sivan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+accumulation+of+pentosidine+in+aggrecan+and+collagen+from+normal+and+degenerate+human+intervertebral+discs.">Age-related accumulation of pentosidine in aggrecan and collagen from normal and degenerate human intervertebral discs.</a> Biochem. J. 399 (1), 29-35 (2006).</li><li>Soskel, N. T., Wolt, T. B., Sandberg, L. B., Leon, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 144, 196-214 (1987).</li><li>Fioretto, D., Scarponi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+a+glassy+polymer+studied+by+Brillouin+light+scattering.">Dynamics of a glassy polymer studied by Brillouin light scattering.</a> Mater. Sci. Eng. A. 521-522, 243-246 (2009).</li><li>Palombo, F., Madami, M., Stone, N., Fioretto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+mapping+with+chemical+specificity+by+confocal+Brillouin+and+Raman+microscopy.">Mechanical mapping with chemical specificity by confocal Brillouin and Raman microscopy.</a> Analyst. 139 (4), 729-733 (2014).</li><li>Scarcelli, G., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistage+VIPA+etalons+for+high-extinction+parallel+Brillouin+spectroscopy.">Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy.</a> Opt. Express. 19 (11), 10913-10922 (2011).</li><li>Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Measurement+of+Age-Related+Stiffening+in+the+Crystalline+Lens+by+Brillouin+Optical+Microscopy.">In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy.</a> Biophys. J. 101 (6), 1539-1545 (2011).</li><li>Scarcelli, G., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Brillouin+optical+microscopy+of+the+human+eye.">In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye.</a> Opt. Express. 20 (8), 9197-9202 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ספקטרוסקופיה ברילואן הפיזור היא כלי ייחודי שבו הרכיבים הבודדים של מותח האלסטיות של סיבי חלבון ניתן לאפיין בפירוט חסר תקדים. יתר על כן, המדידות יכולות להתבצע על בקנה מידה מיקרוסקופי ובכך תספקנה לנו תובנה רומן לתוך מכניקת מייקרו בקנה המידה של מבנים ביולוגיים, מה שמאפשרים לנו, בפעם הראשונה, כדי להבין את המכנים, וכנראה תפקודי, משמעות של המורכבויות באדריכלות וביוכימיה מטריקס אשר נחשף בשנים האחרונות. הטכניקה מודדת תכונות מכאניות בתחום תדרי GHz. תחום זה לא נחקר לפני עבור biopolymers מבני וזה הוא מעלה מספק את האמצעים כדי לענות על שאלות בסיסיות אודות מנגנונים מולקולריים של גמישות. תיארנו את השלבים הדרושים כדי לחלץ סיבי קולגן ואלסטין מרקמות של בעלי חיים כדי למדוד ברילואן scattering ספקטרום באמצעות מצע רעיוני כדי להשיג את התיאור המלא של ביומכניקה סיבים. צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול הם אלה המבטיחים כי סיבי מטוהרים מתקבלים תנאי ניסוי מתאימים נמצאים במקום למדידות לשחזור של החלבונים הסיביים. עם זאת, הוא חייב לזכור כי הליכי המיצוי רשאיים לשנות את התכונות המכאניות של הסיבים. שינויים של הטכניקה כרוך הצימוד עם מיקרוסקופיה אופטית עבור פיזור ברילואן microfocused ומיפוי מתקרב 13 ואת השילוב האפשרי עם טכניקות משלימות (למשל, פיזור ראמאן). יישומים נוכחיים של הטכניקה הם התמקדו בעיקר חומרים ביולוגיים ניכרים, אבל התפתחויות חשובות, למשל, אלה המבוססים על etalons VIPA מספר 14, עושים אפשרי התרגום של טכניקה זו מן המעבדתיים אל מיטתו עם מגוון רחב של יישומים כבר שדstrated 15,16 כולל פוטנציאל ביישומים vivo. גישת VIPA מהווה חלופה למה שאנו מתארים; יש לו זמן רכישה מהר אבל אינו מתאים בהכרח במקרה של דגימות אטומות כגון אלה נתחו כאן. יתר על כן, השימוש מצע רעיוני אינו מעשי קופצים להגדיר המשתמשות etalons VIPA כי בניגוד שלהם לא יהיה מספיק כדי לדחות את האור מעין-אלסטי. מגבלות הקשורות למהירות של רכישת מערך נתונים ספקטרליים ואת חתך פיזור החלש מטבעו של החומר עלולות להגביל יישומים למערכות ביולוגיות דינמיות לרכישת נתונים ממעמקי רקמות, אבל חידודים טכניים עשויים לשפר על ביצועים נוכחיים. BLS מבטיח להיות כלי מרכזי במחקר ביו-יסודי על תאי מטריקס ובכך לייצר תובנות חדשות אודות האבולוציה של תכונות מכניות במהלך הצמיחה מטריקס ההפסד שלהם פתולוגינִווּן. עם זאת, חשוב לזכור כי המדידות הן לא פולשנית, ולפיכך עלולה להתבצע in vivo. ואכן, זה כבר הושג בתוך הקרנית 16 ו עבודה כזו עשויה לספק פלטפורמה לפיתוח כלי אבחון חדש עבור מגוון רחב של הפרעות רקמות חיבור. elastography אולטראסאונד במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הם שיטות חלופיות המדידה micromechanical, אבל הטכניקה BLS מציעה רזולוציה מרחבית טובה יותר (בסולם subcellular) מאשר לשעבר, ובניגוד AFM, מטילה שום כוחות מכניים על הדגימה אינו מוגבל הניתוח רק של תכונות פני השטח. moduli ברילואן של קולגן ואלסטין הם בטווח GPA, תוך moduli של צעירים זנים מקרוסקופית הם בסדר גודל של מגפ&quot;ס (לפרטים נוספים ידווחו במקום אחר). תוצאה זו מצביעה על מודולוס הפרש אלסטי עם תלות חזקה על תדר העירור, בשלהתנהגות viscoelastic של הסיבים. BLS ניתן ליישם במגוון רחב של בעיות וחומרים במדעים ביו. זה יכול לעזור לענות על שאלות על הפיזיולוגיה והפתולוגיה של רקמות ביולוגיות, כמו גם לספק כלי פיזי עבור הבנה בסיסית של חומרים ואינטראקציות ברמה המולקולרית.

פיזור אור ברילואן (BLS) האפקט התגלה על ידי לאון ברילואן בשנת 1922. 1 הוא מורכב של הפיזור הקשיח של אור הנראה על ידי פונונים אקוסטי מופעלים תרמית בחומר. בפיסיקה של מצב מוצק, פונונים אקוסטי הן תנודות קוהרנטית של כל האטומים בסריג. שרשרת חד ממדית של שני סוגי לסירוגין של אטומים בסריג היא מודל פשוט הממחיש את ההבדל בין פונונים אקוסטית, נחשפו על ידי BLS, ו פונונים אופטי, נחקרו על ידי קליטת IR ו פיזור ראמאן (איור 1). פונונים אקוסטיות נמצאים פאזיים תנועות של אטומים בשרשרת עם תזוזה לאורך כיוון התפשטות (פונונים אקוסטי האורך) או בניצב לכיוון התפשטות (רוחבי פונונים אקוסטית), תוך פונונים אופטי הם מחוץ פאזיים תנועות של אטומים הפקת מומנט דיפול חשמלי נדנוד (אורך או מצבים רוחביים). spectro BLSscopy נעשה שימוש במדע אנליטיים מאז 1920; עם זאת, רק מאז 1980 יש מדידות ניגודיות גבוהה התאפשרה הודות לשימוש ספקטרומטר פברי פרו- multipass טנדם. מאז, מספר גדל והולך של ההתקדמות BLS עבור יישומים אנליטיים החומר המעובה (שבו האינטראקציה-פונון פוטון מנוצלת) 2-4 ומגנטיות חומרים (באמצעות אינטראקציה פוטון-מניון) 5 הובא על. עבודות הזרע על יישומים ביו 6-8 סללו את הדרך לפיתוח גישות שונות, כולל אחת מיושם פה אחד שתואר לעיל 9 באמצעות מצע רעיוני בתצורה דמוי טסיות להשיג את התיאור המלא של מותח גמישות דוגמית. בעבודה הנוכחית, אנו מיישמים ספקטרוסקופיה BLS אל מרכיביו הבסיסיים של תאי מטריקס ברקמות חיבור, החלבונים הסיביים אלסטין Type I-קולגן. Type לי קולגן הוא מולקולת סליל נוקשה, משולשת אשר מרכיבה רוחבי longitudinally עם לחצות קישור נרחב ליצירה סיבית נוקשה למעשה ברקמות כגון גידים. רשתות של קולגן שלרוב מתקיימות עם רשתות של אלסטין, חלבון אשר, באופן יוצא דופן, יוצר גמישות לטווח ארוך באמצעות שילוב של אנטרופיה אינטראקציות הידרופוביות עם הסביבה והוא חיוני לפונקציות של רקמות כגון ריאות ועור. סיבי שניהם מודל באמצעות מודל קריסטל משושה במחקר הנוכחי. 9 בחלק 1, אנו מתארים את הפרוטוקול לחלץ סיבים מרקמות של בעלי חיים כדי להכין את המדגם עבור מדידות ספקטרוסקופיות. בחלק 2, ההליך להקמת המנגנון ברילואן ורכישת ספקטרה מסיבי מוצג. חלק 3 נותן פרטים של ניתוח נתונים להחיל את ספקטרום ברילואן כדי לחלץ את המידע המכאני הרלוונטי הכלול בו. לאחר מכן, תוצאות נציגים מוצגות discusseד.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chondroitinase ABC&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2905</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tris Buffer&lt;/strong&gt;</td><td>Fluka</td><td>93358</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sodium Acetate&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S608-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PBS&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sodium Azide&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Streptomyces Hyaluronidase&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1136-1AMP</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sodium Chloride&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Trypsin&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4665</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sodium Phosphate&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sodium Hydroxide&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S320-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pure Water&lt;/strong&gt;</td><td>Millipore</td><td>ZRQS0P3WW</td><td>Produced in-house</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Distilled Water&lt;/strong&gt;</td><td>Bibby Scientific Limited</td><td>D4000</td><td>Produced in-house from water still</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Euthatal&lt;/strong&gt;</td><td>Merial&amp;nbsp;</td><td>J01601A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tandem Interferometer TFP-1&lt;/strong&gt;</td><td>JRS Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Freezer&lt;/strong&gt;</td><td>Lec</td><td>TU55144</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Refrigerator&lt;/strong&gt;</td><td>Zanussi</td><td>ZBA15021SA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Hot Plate&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88857206</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Clamps&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>241-7311 &amp;amp; 241-7201</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Clamp Stand&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>&amp;nbsp;241-0093</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Thermometer&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-201-401</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cling Film&lt;/strong&gt;</td><td>Sainsbury&#039;s</td><td>7650540</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Parafilm&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Silicone&lt;/strong&gt;</td><td>IDB Technologies</td><td>N/A</td><td>No catalogue number. Order upon request.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cover Glass&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>631-1571</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Conical Flask&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>214-1175</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Beaker&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>213-0469</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Measuring Cylinder&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>612-3838</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Vial&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>548-0051 &amp;amp; 548-0863</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Petri Dish&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>391-0441</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Scalpel&lt;/strong&gt;</td><td>Swann Morton Ltd</td><td>&amp;nbsp;0914 &amp;amp; 0308</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Diamond Scribe&lt;/strong&gt;</td><td>RS Instruments</td><td>394-217</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Soldering Iron&lt;/strong&gt;</td><td>RS Instruments</td><td>231-5332</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fine Forceps&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>232-0188</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Double Micro-Spatula&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>Various Sizes</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;pH Meter&lt;/strong&gt;</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI-2210-02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Orbital Shaker&lt;/strong&gt;</td><td>IKA</td><td>&amp;nbsp;0002819000</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of extracellular matrix protein fibers for brillouin spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy at JoVE.com

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

הכנת סיבי חלבון תאי מטריקס עבור ספקטרוסקופיה ברילואן

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

preparation-extracellular-matrix-protein-fibers-for-brillouin

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.3K Views.  University of Exeter. We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Video: Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

הכנת מטריצות תלונה לכימות התכווצות נייד

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but important bioinstruments capable of testing the force dependence of structural features in proteins. Scale has been a limiting parameter on how accurately researchers can peer into the nanomechanical world of molecules, such as nucleic acids, enzymes, and motor proteins that perform life-sustaining work. Atomic force microscopy (AFM) is well tuned to determine native structures of fibrous proteins with a distance resolution on par with electron microscopy. However, in AFM force studies, the forces are typically much higher than a single molecule might experience 1, 2. Optical traps (OT) are very good at determining the relative distance between the trapped beads and they can impart very small forces 3. However, they do not yield accurate absolute lengths of the molecules under study. Molecular simulations provide supportive information to such experiments, but are limited in the ability to handle the same large molecular sizes, long time frames, and convince some researchers in the absence of other supporting evidence2, 4.
The gravitational force spectrometer (GFS) fills a critical niche in the arsenal of an investigator by providing a unique combination of abilities. This instrument is capable of generating forces typically with 98% or better accuracy from the femtonewton range to the nanonewton range. The distance measurements currently are capable of resolving the absolute molecular length down to five nanometers, and relative bead pair separation distances with a precision similar to an optical trap. Also, the GFS can determine stretching or uncoiling where the force is near equilibrium, or provide a graded force to juxtapose against any measured structural changes. It is even possible to determine how many amino acid residues are involved in uncoiling events under physiological force loads 2. Unlike in other methods where there is extensive force calibration that must precede any assay, the GFS requires no such force calibration 5. By complementing the strengths of other methods, the GFS will bridge gaps in understanding the nanomechanics of vital proteins and other macromolecules.

This is a step-by step guide showing the purpose, operation, and representative results from the novel gravitational force spectrometer.

הדגמת שימושים של ספקטרומטר הכבידה רומן כוח כדי למתוח מדוד חלבונים סיביים

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Writing Bragg Gratings in Multicore Fibers

Fiber Bragg gratings in multicore fibers can be used as compact and robust filters in astronomical and other research and commercial applications. Strong suppression at a single wavelength requires that all cores have matching transmission profiles. These gratings cannot be inscribed using the same method as for single-core fibers because the curved surface of the cladding acts as a lens, focusing the incoming UV laser beam and causing variations in exposure between cores. Therefore we use an additional optical element to ensure that the beam shape does not change while passing through the cross-section of the multicore fiber. This consists of a glass capillary tube which has been polished flat on one side, which is then placed over the section of the fiber to be inscribed. The laser beam enters the fiber through the flat surface of the capillary tube and hence maintains its original dimensions. This paper demonstrates the improvements in core-to-core uniformity for a 7-core fiber using this method. The technique can be generalized to larger multicore fibers.

We describe a technique for inscribing identical fiber Bragg gratings into each core of a multicore fiber. This is achieved by introducing an additional surface into the optical path to mitigate lensing by the curved surface of the fiber cladding.

כתיבת Gratings בראג בסיבים מרובי-ליבות

Fiber Bragg gratings in multicore fibers can be used as compact and robust filters in astronomical and other research and commercial applications. Strong ...

Engineering

High-speed Continuous-wave Stimulated Brillouin Scattering Spectrometer for Material Analysis

Recent years have witnessed a significant increase in the use of spontaneous Brillouin spectrometers for non-contact analysis of soft matter, such as aqueous solutions and biomaterials, with fast acquisition times. Here, we discuss the assembly and operation of a Brillouin spectrometer that uses stimulated Brillouin scattering (SBS) to measure stimulated Brillouin gain (SBG) spectra of water and lipid emulsion-based tissue-like samples in transmission mode with &lt;10 MHz spectral-resolution and &lt;35 MHz Brillouin-shift measurement precision at &lt;100 ms. The spectrometer consists of two nearly counter-propagating continuous-wave (CW) narrow-linewidth lasers at 780 nm whose frequency detuning is scanned through the material Brillouin shift. By using an ultra-narrowband hot rubidium-85 vapor notch filter and a phase-sensitive detector, the signal-to-noise-ratio of the SBG signal is significantly enhanced compared to that obtained with existing CW-SBS spectrometers. This improvement enables measurement of SBG spectra with up to 100-fold faster acquisition times, thereby facilitating high spectral-resolution and high-precision Brillouin analysis of soft materials at high speed.

We describe the construction of a rapid continuous-wave-stimulated-Brillouin-scattering (CW-SBS) spectrometer. The spectrometer employs single-frequency diode-lasers and an atomic vapor notch-filter to acquire transmission spectra of turbid/non-turbid samples with high spectral-resolution at speeds up to 100-fold faster than those of existing CW-SBS spectrometers. This improvement enables high-speed Brillouin material analysis.

ספקטרומטר פיזור מהיר ברילואן מגורה מכ לניתוח גשמי

Recent years have witnessed a significant increase in the use of spontaneous Brillouin spectrometers for non-contact analysis of soft matter, such as ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled protein polymerization process is always a challenge. Here, we have developed an enzymatic methodology for constructing polymerized protein step by step in a rationally-controlled sequence. In this method, the C-terminus of a protein monomer is NGL for protein conjugation using OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) while the N-terminus was a cleavable TEV (tobacco etch virus) cleavage site plus an L (ENLYFQ/GL) for temporary N-terminal protecting. Consequently, OaAEP1 was able to add only one protein monomer at a time, and then the TEV protease cleaved the N-terminus between Q and G to expose the NH2-Gly-Leu. Then the unit is ready for next OaAEP1 ligation. The engineered polyprotein is examined by unfolding individual protein domain using atomic force microscopy-based single-molecule force spectroscopy (AFM-SMFS). Therefore, this study provides a useful strategy for polyprotein engineering and immobilization.

Here, we present a protocol to conjugate protein monomer by enzymes forming protein polymer with a controlled sequence and immobilize it on the surface for single-molecule force spectroscopy studies.

OaAEP1-תיווך אנזימטית והשתק של חלבון פלסטריזציה לספקטרוסקופיית מולקולות יחיד

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Biochemistry

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

סינתזה של nanofiber קראטין מבוסס על הנדסה ביו רפואית

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a non-contact measurement method that can be used to obtain direct readouts of viscoelastic material properties. It has been a useful tool in material characterization, structural monitoring and environmental sensing. In the past, Brillouin spectroscopy has usually employed scanning Fabry-Perot etalons to perform spectral analysis. This process requires high illumination power and long acquisition times, making the technique unsuitable for biomedical applications. A recently introduced novel spectrometer overcomes this challenge by employing two VIPAs in a cross-axis configuration. This innovation enables sub-Gigahertz (GHz) resolution spectral analysis with sub-second acquisition time and illumination power within the safety limits of biological tissue. The multiple new applications facilitated by this improvement are currently being explored in biological research and clinical application.

Here we present a protocol to build a rapid Brillouin spectrometer. Cascading virtually imaged phase array (VIPA) etalons achieve a measurement speed more than 1,000 times faster than traditional scanning Fabry-Perot spectrometers. This improvement provides the means for Brillouin analysis of tissue and biomaterials at low power levels in vivo.

ספקטרומטר תת-GHz מהירות גבוהה לניתוח פיזור רילואן

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure and healing. Extraction of extracellular matrix from fibrogenic cell cultures in vitro has potential for generation of ECM from human- and potentially patient-specific cell lines, minimizing the presence of xenogeneic epitopes which has hindered the clinical success of some existing ECM products. A significant challenge in in vitro production of ECM suitable for implantation is that ECM production by cell culture is typically of relatively low yield. In this work, protocols are described for the production of ECM by cells cultured within sacrificial hollow fiber membrane scaffolds. Hollow fiber membranes are cultured with fibroblast cell lines in a conventional cell medium and dissolved after cell culture to yield continuous threads of ECM. The resulting ECM fibers produced by this method can be decellularized and lyophilized, rendering it suitable for storage and implantation.

The goal of this protocol is production of whole extracellular matrix fibers targeted for wound repair which are suitable for preclinical evaluation as part of a regenerative scaffold implant. These fibers are produced by the culture of fibroblasts on hollow fiber membranes and extracted by dissolution of the membranes.

ייצור סיבים מטריצה חוץ-תאית באמצעות תרבית תאים הממברנה ההקרבה הולופייבר

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the cells themselves. Here, we present the method of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins (LIMAP) using the PRIMO system as a patterning technique to produce micro-patterned extracellular matrix (ECM) substrates using a single or combination of proteins. The method enables printing of ECM patterns in micron resolution with excellent reproducibility. We provide a step-by-step protocol and demonstrate how this can be applied to study the processes of neuronal pathfinding. LIMAP has significant advantages over existing micro-printing methods in terms of the ease of patterning more than one component and the ability to generate a pattern with any geometry or gradient. The protocol can easily be adapted to study the contribution of almost any chemical component towards cell fate and cell behavior. Finally, we discuss common issues that can arise and how these can be avoided.

Our overall aim is to understand how cells sense extracellular cues that lead to directed axonal growth. Here, we describe the methodology of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins, used to produce defined micro-patterns of extracellular matrix components in order to study specific events that govern axon outgrowth and pathfinding.

המושרה באור Adsorption מולקולרית של חלבונים באמצעות מערכת פרימו עבור מיקרו הפנינג כדי ללמוד התגובות לתא מטריצות חלבונים מטריקס

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...