This work was supported by the Engineering and Physical Sciences Research Council [grant number EP/M028739/1]. RSE was supported by a Santander Postgraduate Research Award 2015.

تحذير: يرجى الرجوع إلى بروتوكولات السلامة البيولوجية وجميع بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. الليزر المستخدمة في هذه التجارب هو الليزر من الفئة 3B. مطلوب الامتثال للقواعد المحلية لاستخدام الآمن للنظام. الرجاء استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة عند إجراء القياس الطيفي بالليزر بما في ذلك استخدام معدات الوقاية الشخصية (نظارات وقاية). وقد تم الحصول على الأوتار الذيل 7-8 الاسبوع فئران ويستار القديمة الموت الرحيم لأغراض أخرى وفقا للائحة الاتحاد الأوروبي 1099/2009 ورعاية الحيوانات (ذبح أو قتل) لعام 1995. وقد تم الحصول على الأبقار رباط قفوي من المسالخ المحلية. 1. إعداد ألياف عينة ملاحظة: ألياف البروتين المصفوفة خارج الخلية يمكن استخلاصها من الأنسجة المختلفة، وذلك باستخدام إجراءات مختلفة. وتم صقل البروتوكولات على أساس الإجراءات المطبقة على نطاق واسع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"><stroنانوغرام&gt; استخراج ألياف الكولاجين من ذيل فأر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 100 ملغم / كغم من وزن الجسم الصوديوم بنتوباربيتون. ثم قطع الذيل مباشرة عند نقطة اتصال مع الجسم، والضغط إلى أسفل مع شفرة الحلاقة حافة واحدة. التفاف الذيل في التشبث الفيلم وتخزينه في المجمد -20 درجة مئوية حتى المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الذيل من الثلاجة، وقطع شريحة 20 مم طويل من نهاية القريبة في حين لا تزال مجمدة ثم ترك الأمر لذوبان الجليد في طبق بتري مليئة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل (7.4 درجة الحموضة) في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم إذابة الذيل، وجعل شق على طول الجزء باستخدام مشرط لتقسيم الجلد. ثم قشر العودة إلى الكشف عن أربع حزم وتر مغمد حول فقرة الذيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط غرامة والحرص على عدم تطبيق أي سلالة قبل، رسم بلطف كل الألياف من غمد ووضعه في قارورة تحتوي على الماء المقطر مع 0.01٪ ث / ت أزيد الصوديوم (نان 3) إلى العلاقات العامةالمبردة نمو البكتيريا الحدث، ومخزن. وذيل واحد ينتج حوالي ثلاثين ألياف وتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على نوع يفي النقي أنا الكولاجين، وتطبيق ثلاثة أجزاء عملية الهضم الأنزيمي 10 إلى ألياف وتر لإزالة بروتيوغليكان وجميع المواد غير كولاجيني أخرى. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا، تزج الألياف في 0.125 U / مل chondroitinase ABC في 0.05 عازلة M تريس و 0.06 M خلات الصوديوم (CH 3 COONa) في درجة الحموضة 8.0 لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز في 200 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم، تزج الألياف في 1 يو / مل السبحية هيالورونيداز في 0.05 عازلة M تريس و 0.15 كلوريد الصوديوم M (كلوريد الصوديوم) في الرقم الهيدروجيني 6.0 والعودة إلى الحاضنة تهتز لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأخيرا، تزج الألياف في 1 ملغ / مل من التربسين في 0.05 M فوسفات الصوديوم (NaHPO 4) و 0.15 م كلوريد الصوديوم في درجة الحموضة 7.2 لمدة 16 ساعة في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الألياف النقاء المبردة في قارورة تحتوي على الماء المقطر، وايال 0.01٪ نان 3 لمنع نمو البكتيريا، حتى المطلوبة للقياس. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج ألياف الإيلاستين من الرباط القفوي البقري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الرباط القفوي الأبقار من مسلخ، ألفه في التشبث الفيلم وتخزينه في المجمد -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنتاج الإيلاستين نقية، وجمع في الرباط من الثلاجة، والسماح لذوبان الجليد في RT، يزيل الدهن باستخدام مشرط وهضم الرباط في حمام ماء يغلي وفقا للإجراء لانسينغ، 11 على النحو التالي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول 0.1 M من هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) في الماء المقطر، وإضافته إلى الرباط منزوع الدهن في قارورة مخروطي الشكل، وتغطي الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغلي القارورة في حمام مائي عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الرباط من القارورة الهضم وغسل كتلة الأنسجة غير القابلة للذوبان في الماء المقطر مرارا وتكرارا حتى يتم الحصول على درجة الحموضة 7.0 (رصدها باستخدام مقياس درجة الحموضة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأنسجة من المباراة النهائيةغسل الحل ويغرق في الماء المقطر (مختلطة مع 0.01٪ نان 3 لمنع نمو البكتيريا) في حاوية مغلقة وتخزينه المبردة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الأنسجة من الثلاجة و، والحرص على عدم تطبيق الكثير من القوة وما قبل السلالة، واستخدام الملقط لسحب بلطف شرائح الإيلاستين أصغر (20-50 ملم طويلة، كاليفورنيا. 2 مم) بعيدا عن الكتلة الأكبر ووضعها في طبق بيتري مع حل PBS (7.4 درجة الحموضة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط غرامة، ندف بلطف حزم ألياف صغيرة حوالي 1 مم وقطع منها إلى أطوال ملم عدد قليل باستخدام مشرط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الألياف إلى قارورة تحتوي على الماء المقطر (مع 0.01٪ نان 3 لمنع نمو البكتيريا) وتخزينها المبردة حتى المطلوبة للقياس. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب الألياف على الركيزة عاكسة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام قطع الماس، وقطع قطعة من شريحة سيليكون العاكسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنشاء compartme رطبالإقليم الشمالي، وقطع شريط من بارافيلم لتناسب على شريحة سيليكون مع خفض جوفاء في مركز (كبير بما يكفي لتناسب الألياف) ووضعه على الركيزة السيليكون. ملاحظة: للحصول على القياسات الألياف الجافة، وقطع بارافيلم إلى U- شكل حتى أن واحدا من الجوانب الأربعة يبقى مفتوحا في الهواء عندما مختومة في الخطوة 1.3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الألياف من الثلاجة، واستخدام زوج من ملقط غرامة لجمع واحد من الألياف من حلول التخزين ووضعه في طبق بيتري صغير مملوء بالماء النقي في RT لمدة 5 دقائق لغسل العينة. ثم، وجمع الألياف وتحويلها إلى مركز جوفاء بارافيلم على الركيزة السيليكون. الحذر: تجنب الإضرار الألياف التي تمتد أنه خلال هذه العملية، وتجنب إعادة توجيه العينة على الركيزة لأن هذا قد يؤدي إلى تغير في الخواص الميكانيكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ساترة زجاج رقيقة على الألياف وختم الغرفة عن طريق تمرير حام الحديد ساخنا بلطف على سطح الزجاج لإذابة بارافيلم تحتالزجاج. الحذر: تجنب الإضرار الألياف التي لا تجلب طرف لحام قريبة جدا أو تسخين الركيزة بشكل مفرط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غرفة مغلقة على سطح مستو تحت ثقل صغير وتترك لمدة حوالي 12 ساعة لتحقيق الاتصال الجيد بين العينة والسيليكون الركيزة مع تجنب الأضرار التي لحقت العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الوزن وتأمين غرفة في مكان على الركيزة، وذلك باستخدام مسامير. </li></ol></li></ol> 2. إعداد تجربة Brillouin والحصول الألياف الأطياف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حجرة العينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل العينة أعد كما هو الحال في الجزء 1.3 على حامل العمودي مجهزة مقياس الزوايا لتمكين دوران في الطائرة من العينة مع الحفاظ على زاوية التشتت ثابتة (2 Φ = 90 °؛ انظر الشكل SI-1) ونثر موقف حجم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تعديل تركيز دقيق من ضوء الليزر على عينة من خلال جنيهنانو ثانية. 9 الحذر: قد يكون انتاج الطاقة ليزر عالية جدا وينتج حرق في العينة. تأكد من أن يتم تعيين عالية بما فيه الكفاية لإعطاء حساسية جيدة ولكن ليست عالية جدا لتجنب الأضرار التي لحقت العينة. نحن هنا استخدام القوة من كاليفورنيا 76 ميغاواط على العينة. وكان هذا كافيا للحصول على حساسية جيدة دون حرق العينة، معتبرا أن هذا هو رقيق وفي اتصال مع الركيزة التي تساعد على تبديد الحرارة المتولدة عن إضاءة ليزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع العينة على زاوية 45 درجة (Φ) لشعاع الليزر الحادث باستخدام مقياس الورنية. تحقيق لتحديد المواقع الأمثل عن طريق تشغيل قياس وتعظيم شدة القمم في الطيف (أنظر أدناه). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء مطياف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح البرنامج لاقتناء والتلاعب في البيانات وإعداد الاستحواذ على الطيف Brillouin من العينة 12. الإجراء الموضح هنا ينطبق على موltipass تداخل جنبا إلى جنب (الشكل SI-1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة اثنين فابري بيرو (FP) التداخل المتغيرة بشكل مستقل الفولتية المطبقة على بيزو قبل وحدة التحكم. لهذا الإجراء قبل المحاذاة، ومراقبة الضوء المنعكس من قبل كل FP. عندما تميل كثافة تعكسها ضباط الإتصال اثنين من الصفر، يتم الوصول إلى المحاذاة الصحيحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة الطيف: نطاق التردد يمكن الوصول إليها، أو النطاق الطيفي مجانا (FSR)، تعتمد على المسافة بين اثنين من المرايا أول تجويف FP، L، من خلال FSR = ج / 2 لتر، حيث c هي سرعة الضوء، و يتم قياس L عن طريق الاتصال الهاتفي عيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزامنة بمسح اثنين من التداخل FP وتبديل النظام البصري لتكوين جنبا إلى جنب المتعددة الدخول. وهناك مراقبة ردود الفعل من شدة ضوء الليزر تنتقل تلقائيا الحفاظ على المواءمة بين ضباط الإتصال اثنين أثناء القياس. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس مستوى السوائلو Brillouin الأطياف الحذر: الطيف Brillouin يعتمد إلى حد كبير على درجة الحرارة والماء من العينة ومراقبة دقيقة جدا من هذه المعايير هو مفتاح الحصول على أطياف استنساخه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء الاستحواذ على الطيف Brillouin من العينة وتشغيله حتى يتم التوصل إلى جيدة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. قد يستغرق هذا عدة دقائق اعتمادا على نثر المقطع العرضي والتركيز وسمك العينة. ملاحظة: ليس هناك قاعدة الإبهام لنسبة الإشارة إلى الضوضاء ولكن يتم التحقق من جودة الطيفية التي التجريبي استنادا إلى عينة محددة تحليلها. هناك مفاضلة بين الجودة الطيفية ومدة القياس، وبالتالي المعلمات التجريبية يجب اختيارها وفقا لتطبيق معين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس عينة الجافة، واتخاذ أطياف التوالي - لكل منهم، بعد خطوة 2.3.1 - حتى أي تغييرات في الموقف من قمم طالصورة احظ. ويتحقق هذا عندما تكون العينة في حالة توازن مع جو الغرفة ولن تجفيف مزيد يؤثر على الطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الاستقطاب ضوء (VV أو VH، V لتقف على رأسي وH للالاتجاه الأفقي من الاستقطاب الخفيفة نسبة إلى الطائرة تناثر) والحصول على الأطياف في كل زاوية لمحور الألياف (θ؛ الشكل SI-1) عن طريق تدوير العينة في طائرة باليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ أطياف Brillouin إلى ملف لمعالجتها لاحقا. </li></ol></li></ol> 3. تحليل Brillouin الأطياف ملاحظة: تحليل صالح من قمم Brillouin يمكن تنفيذها باستخدام وظائف مختلفة. وقد تم اختيار وثبط المذبذب التوافقي (DHO) وظيفة 4،13 لأن هذا هو نموذج صالح للقمم القادمة من وسائط صوتية ثبط في وسائل الإعلام اللزجة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل مناسبا من قمم Brillouin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد النطاق الطيفي للذروة الاهتمام عشرالبريد Brillouin الطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمكين أساس في صالح إذا كانت الخلفية الطيفية هي أعلى بكثير من الصفر. ملاحظة: خط الأساس يمكن أن تختلف بين الأطياف. ضمان أن يتم تطبيق التصحيح بطريقة منهجية وقابلة للتكرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق مفصلة المربعات المناسب باستخدام وظيفة DHO 4،13 إلى الذروة Brillouin الاهتمام بشكل متكرر حتى يتم تحقيق التقارب ويتم الحصول على أفضل منحنى المناسب. ثم، حفظ نتائج صالحة للملف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على متوسط ​​القيم من المعلمات تناسب اثنين من قمم كل صدرة Brillouin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب سرعة الموجة الصوتية من ذروة تردد (باستخدام التعبير أدناه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم نتائج مناسبة من خلال الرسوم البيانية، على سبيل المثال، الصوتية سرعة موجة مقابل زاوية لمحور الألياف، θ ، وتطبيق النماذج ذات الصلة (على سبيل المثال، لأنظمة متباين الخواص سمعيا 9) لاستخراج كميات الميكانيكية مثل معامل مرونة الموترة. </li></ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brillouin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+de+la+lumi&#232;re+et+des+rayonnes+X+par+un+corps+transparent+homog&#232;ne;+influence+de+l'agitation+thermique.">Diffusion de la lumi&#232;re et des rayonnes X par un corps transparent homog&#232;ne; influence de l'agitation thermique.</a> Ann. Phys. 17, 88-122 (1922).</li><li>Caponi, S., Corezzi, S., Mattarelli, M., Fioretto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+effects+on+the+elastic+properties+of+amorphous+polymeric+materials.">Stress effects on the elastic properties of amorphous polymeric materials.</a> J. Chem. Phys. 141 (21), 214901 (2014).</li><li>Mattarelli, M., Montagna, M., Still, T., Schneider, D., Fytas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibration+spectroscopy+of+weakly+interacting+mesoscopic+colloids.">Vibration spectroscopy of weakly interacting mesoscopic colloids.</a> Soft Matter. 8 (15), 4235-4243 (2012).</li><li>Comez, L., Masciovecchio, C., Monaco, G., Fioretto, D., Robert, E. C., Robert, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Solid State Physics. 63, 1-77 (2012).</li><li>Madami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+a+propagating+spin+wave+induced+by+spin-transfer+torque.">Direct observation of a propagating spin wave induced by spin-transfer torque.</a> Nat. Nanotechnol. 6 (10), 635-638 (2011).</li><li>Harley, R., James, D., Miller, A., White, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phonons+and+the+elastic+moduli+of+collagen+and+muscle.">Phonons and the elastic moduli of collagen and muscle.</a> Nature. 267 (5608), 285-287 (1977).</li><li>Cusack, S., Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+elastic+constants+of+collagen+by+Brillouin+light+scattering.">Determination of the elastic constants of collagen by Brillouin light scattering.</a> J. Mol. Biol. 135 (1), 39-51 (1979).</li><li>Vaughan, J. M., Randall, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brillouin+scattering,+density+and+elastic+properties+of+the+lens+and+cornea+of+the+eye.">Brillouin scattering, density and elastic properties of the lens and cornea of the eye.</a> Nature. 284 (5755), 489-491 (1980).</li><li>Palombo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanics+of+fibrous+proteins+of+the+extracellular+matrix+studied+by+Brillouin+scattering.">Biomechanics of fibrous proteins of the extracellular matrix studied by Brillouin scattering.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (101), (2014).</li><li>Sivan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+accumulation+of+pentosidine+in+aggrecan+and+collagen+from+normal+and+degenerate+human+intervertebral+discs.">Age-related accumulation of pentosidine in aggrecan and collagen from normal and degenerate human intervertebral discs.</a> Biochem. J. 399 (1), 29-35 (2006).</li><li>Soskel, N. T., Wolt, T. B., Sandberg, L. B., Leon, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 144, 196-214 (1987).</li><li>Fioretto, D., Scarponi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+a+glassy+polymer+studied+by+Brillouin+light+scattering.">Dynamics of a glassy polymer studied by Brillouin light scattering.</a> Mater. Sci. Eng. A. 521-522, 243-246 (2009).</li><li>Palombo, F., Madami, M., Stone, N., Fioretto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+mapping+with+chemical+specificity+by+confocal+Brillouin+and+Raman+microscopy.">Mechanical mapping with chemical specificity by confocal Brillouin and Raman microscopy.</a> Analyst. 139 (4), 729-733 (2014).</li><li>Scarcelli, G., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistage+VIPA+etalons+for+high-extinction+parallel+Brillouin+spectroscopy.">Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy.</a> Opt. Express. 19 (11), 10913-10922 (2011).</li><li>Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Measurement+of+Age-Related+Stiffening+in+the+Crystalline+Lens+by+Brillouin+Optical+Microscopy.">In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy.</a> Biophys. J. 101 (6), 1539-1545 (2011).</li><li>Scarcelli, G., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Brillouin+optical+microscopy+of+the+human+eye.">In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye.</a> Opt. Express. 20 (8), 9197-9202 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Brillouin تشتت الطيفي هو أداة فريدة من نوعها التي المكونات الفردية للموتر مرونة من ألياف البروتين يمكن وصفها بالتفصيل لم يسبق له مثيل. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء القياسات على نطاق والمجهرية، وبالتالي سوف توفر لنا رؤى جديدة في آليات الصغيرة الحجم من الهياكل البيولوجية، مما يسمح لنا، للمرة الأولى، لفهم الميكانيكية، وربما وظيفية، وأهمية التعقيدات في الهندسة المعمارية مصفوفة والكيمياء الحيوية والتي تم الكشف عنها في السنوات الأخيرة. يقيس تقنية الخواص الميكانيكية في نطاق تردد غيغاهرتز. لم يتم البحث في هذا المجال قبل لالبوليمرات الحيوية الهيكلية وعلى حد سواء يثير ويوفر وسيلة للإجابة على الأسئلة الأساسية حول الآليات الجزيئية للمرونة. وصفنا الخطوات لاستخراج الكولاجين والإيلاستين الألياف من الأنسجة الحيوانية ولقياس Brillouin scatteriنانوغرام الأطياف باستخدام الركيزة عاكسة لتحقيق صفا كاملا من الميكانيكا الحيوية الألياف. الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي تلك التي تضمن أن يتم الحصول على ألياف النقاء والظروف التجريبية المناسبة في مكانها الصحيح لقياسات متكررة من البروتينات الليفية. ومع ذلك، فإنه يجب أن يوضع في الاعتبار أن إجراءات استخراج قد يغير من الخواص الميكانيكية للألياف. إدخال تعديلات على هذه التقنية تنطوي على اقتران مع المجهر الضوئي لنثر Brillouin microfocused ورسم النهج (13) وتركيبة ممكنة مع التقنيات التكميلية (على سبيل المثال، رامان نثر). وتركز التطبيقات الحالية لهذه التقنية بشكل أساسي على المواد البيولوجية رفعه، ولكن التطورات الهامة، على سبيل المثال، تلك التي تقوم على عدة etalons VIPA 14، تبذل الممكن ترجمة هذه التقنية من الفوق إلى السرير مع مجموعة واسعة من التطبيقات بالفعل شيطانstrated 15،16 بما في ذلك إمكانية في تطبيقات الجسم الحي. النهج VIPA هو بديل لما وصفنا. انها أسرع وقت الشراء ولكن ليس بالضرورة مناسبا في حالة العينات مبهمة مثل تلك تحليلها هنا. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الركيزة عاكسة ليست عملية في مجموعة عمليات التي تستخدم etalons VIPA بسبب التباين من شأنه أن لا يكون كافيا لرفض ضوء شبه مرنة. القيود ذات الصلة لسرعة الحصول على مجموعة البيانات الطيفية وضعيفة بطبيعتها قسم نثر صليب المواد قد يحد من التطبيقات لالنظم البيولوجية الحيوية واكتساب البيانات من أعماق الأنسجة، ولكن التحسينات التقنية قد تحسن في الأداء الحالي. BLS يعد بأن يكون أداة رئيسية في البحوث الفيزيائية الحيوية الأساسية في المصفوفة خارج الخلية، وبالتالي إلى إنتاج رؤى جديدة لتطور الخصائص الميكانيكية خلال النمو مصفوفة وخسارتهم في المرضيةانحطاط. ومع ذلك، من المهم أن نتذكر أن القياسات موسع، وبالتالي يمكن الاضطلاع بها في الجسم الحي. في الواقع، وقد تحقق هذا بالفعل في القرنية 16 وهذا العمل يمكن أن يوفر منصة لتطوير أدوات التشخيص الجديدة لمجموعة واسعة من الاضطرابات التي تصيب النسيج الضام. الموجات فوق الصوتية elastography والقوة الذرية المجهر (AFM) طرق بديلة لقياس الميكرو ميكانيكية، ولكن تقدم تقنية BLS القرار المكانية أفضل (على نطاق والتحت خلوية) من السابق، وعلى عكس AFM، لا يفرض القوى الميكانيكية على عينة ولا يقتصر على تحليل فقط من السمات السطحية. الرجوعية Brillouin من الكولاجين والإيلاستين هي في حدود برنامج العمل العالمي، في حين الرجوعية الشباب من سلالات العيانية هي من ترتيب ميجا باسكال (سيتم الإبلاغ عن مزيد من التفاصيل في مكان آخر). وتشير هذه النتيجة إلى معامل المرونة التفاضلية مع الاعتماد القوي على وتيرة الإثارة، نظرا لالسلوك اللزجة من الألياف. BLS يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من المشاكل ومواد في العلوم الطبية الحيوية. ويمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض والأنسجة البيولوجية، فضلا عن توفير أداة المادية لفهم أساسي من المواد والتفاعلات على المستوى الجزيئي.

تم اكتشاف تأثير الضوء Brillouin نثر (BLS) من قبل ليون برويون في عام 1922. 1 وهو يتألف من نثر غير مرن من الضوء المرئي من قبل الفونونات الصوتية تنشيط حراريا في المواد. في فيزياء الحالة الصلبة، الفونونات الصوتية والاهتزازات متماسكة من كل الذرات في شعرية. سلسلة ذات بعد واحد من نوعين بالتناوب من الذرات في شعرية هي نموذج بسيط يوضح الفرق بين الفونونات الصوتية، التي كشفت عنها BLS، والفونونات البصرية، سبرت عن طريق امتصاص الأشعة تحت الحمراء ورامان نثر (الشكل 1). الفونونات الصوتية والحركات في مرحلة من الذرات في سلسلة مع تشريد على طول اتجاه الانتشار (الفونونات الصوتية طولية) أو عمودي على اتجاه انتشار (عرضية الفونونات الصوتية)، في حين الفونونات البصرية هي حركات الخروج من مرحلة من ذرات إنتاج تتأرجح لحظة ثنائي القطب الكهربائية (طولية أو عرضية وسائط). BLS الطيفوقد استخدم SCOPY في العلم التحليلي منذ 1920s. ومع ذلك، فقط منذ 1980s لها قياسات عالية التباين كانت ممكنة من خلال استخدام جنبا إلى جنب المتعددة الدخول مطياف فابري بيرو. ومنذ ذلك الحين، فإن عددا متزايدا من التقدم في BLS لتطبيقات تحليلية في المادة المكثفة (حيث يتم استغلال تفاعل الفوتون الطاقة الصوتية) 2-4 والمواد المغناطيسية (من خلال تفاعل الفوتون، المجنون) قد عرضت 5 عنه. وقد مهدت أعمال المنوية على التطبيقات الطبية الحيوية 6-8 الطريق إلى وضع نهج مختلف، بما في ذلك واحدة تطبق هنا واحد هو موضح سابقا 9 باستخدام الركيزة عاكسة في تكوين مثل الصفائح الدموية لتحقيق صفا كاملا للموتر مرونة عينة. في العمل الحالي، ونحن نطبق BLS التحليل الطيفي إلى مقومات أساسية لالمصفوفة خارج الخلية في الأنسجة الضامة، والبروتينات الليفية الإيلاستين والكولاجين النوع الأول. تYPE أنا الكولاجين هو جامد، جزيء حلزوني الثلاثي الذي يجمع أفقيا وطوليا مع الصليب ربط واسعة لتشكيل الألياف جامدة أساسا في الأنسجة مثل الأوتار. شبكات الكولاجين غالبا ما تتعايش مع شبكات الإيلاستين، وهو بروتين، على غير العادة، ويولد بعيدة المدى مرونة من خلال مزيج من الكون والتفاعلات الطاردة للماء مع بيئتها وضروري لوظائف الأنسجة مثل الرئة والجلد. وعلى غرار كل من الألياف باستخدام نموذج الكريستال سداسية في البحث الحالي. 9 في الجزء 1، وصفنا بروتوكول لاستخراج الألياف من الأنسجة الحيوانية وإعداد نموذج للقياسات الطيفية. في الجزء 2، يتم تقديم إجراءات إنشاء جهاز Brillouin والحصول على أطياف من الألياف. الجزء 3 يعطي تفاصيل تحليل البيانات تطبيقها على أطياف Brillouin لاستخراج المعلومات الميكانيكية ذات الصلة الواردة فيه. ثم، يتم عرض نتائج ممثل وdiscusseد.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chondroitinase ABC&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2905</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tris Buffer&lt;/strong&gt;</td><td>Fluka</td><td>93358</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sodium Acetate&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S608-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PBS&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sodium Azide&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Streptomyces Hyaluronidase&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1136-1AMP</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sodium Chloride&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Trypsin&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4665</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sodium Phosphate&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sodium Hydroxide&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S320-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pure Water&lt;/strong&gt;</td><td>Millipore</td><td>ZRQS0P3WW</td><td>Produced in-house</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Distilled Water&lt;/strong&gt;</td><td>Bibby Scientific Limited</td><td>D4000</td><td>Produced in-house from water still</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Euthatal&lt;/strong&gt;</td><td>Merial&amp;nbsp;</td><td>J01601A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tandem Interferometer TFP-1&lt;/strong&gt;</td><td>JRS Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Freezer&lt;/strong&gt;</td><td>Lec</td><td>TU55144</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Refrigerator&lt;/strong&gt;</td><td>Zanussi</td><td>ZBA15021SA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Hot Plate&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88857206</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Clamps&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>241-7311 &amp;amp; 241-7201</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Clamp Stand&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>&amp;nbsp;241-0093</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Thermometer&lt;/strong&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-201-401</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cling Film&lt;/strong&gt;</td><td>Sainsbury&#039;s</td><td>7650540</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Parafilm&lt;/strong&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Silicone&lt;/strong&gt;</td><td>IDB Technologies</td><td>N/A</td><td>No catalogue number. Order upon request.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cover Glass&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>631-1571</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Conical Flask&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>214-1175</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Beaker&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>213-0469</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Measuring Cylinder&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>612-3838</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Vial&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>548-0051 &amp;amp; 548-0863</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Petri Dish&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>391-0441</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Scalpel&lt;/strong&gt;</td><td>Swann Morton Ltd</td><td>&amp;nbsp;0914 &amp;amp; 0308</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Diamond Scribe&lt;/strong&gt;</td><td>RS Instruments</td><td>394-217</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Soldering Iron&lt;/strong&gt;</td><td>RS Instruments</td><td>231-5332</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fine Forceps&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>232-0188</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Double Micro-Spatula&lt;/strong&gt;</td><td>VWR</td><td>Various Sizes</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;pH Meter&lt;/strong&gt;</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI-2210-02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Orbital Shaker&lt;/strong&gt;</td><td>IKA</td><td>&amp;nbsp;0002819000</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of extracellular matrix protein fibers for brillouin spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy at JoVE.com

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

إعداد ألياف البروتين خارج الخلية مصفوفة لBrillouin الطيفي

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

preparation-extracellular-matrix-protein-fibers-for-brillouin

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.3K Views.  University of Exeter. We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Video: Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

إعداد مصفوفات شكوى لقياس تقلص الخليوي

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but important bioinstruments capable of testing the force dependence of structural features in proteins. Scale has been a limiting parameter on how accurately researchers can peer into the nanomechanical world of molecules, such as nucleic acids, enzymes, and motor proteins that perform life-sustaining work. Atomic force microscopy (AFM) is well tuned to determine native structures of fibrous proteins with a distance resolution on par with electron microscopy. However, in AFM force studies, the forces are typically much higher than a single molecule might experience 1, 2. Optical traps (OT) are very good at determining the relative distance between the trapped beads and they can impart very small forces 3. However, they do not yield accurate absolute lengths of the molecules under study. Molecular simulations provide supportive information to such experiments, but are limited in the ability to handle the same large molecular sizes, long time frames, and convince some researchers in the absence of other supporting evidence2, 4.
The gravitational force spectrometer (GFS) fills a critical niche in the arsenal of an investigator by providing a unique combination of abilities. This instrument is capable of generating forces typically with 98% or better accuracy from the femtonewton range to the nanonewton range. The distance measurements currently are capable of resolving the absolute molecular length down to five nanometers, and relative bead pair separation distances with a precision similar to an optical trap. Also, the GFS can determine stretching or uncoiling where the force is near equilibrium, or provide a graded force to juxtapose against any measured structural changes. It is even possible to determine how many amino acid residues are involved in uncoiling events under physiological force loads 2. Unlike in other methods where there is extensive force calibration that must precede any assay, the GFS requires no such force calibration 5. By complementing the strengths of other methods, the GFS will bridge gaps in understanding the nanomechanics of vital proteins and other macromolecules.

This is a step-by step guide showing the purpose, operation, and representative results from the novel gravitational force spectrometer.

مما يدل على استخدامات مطياف الرواية قوة الجاذبية على التمدد وقياس البروتينات الليفية

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but ...

Writing Bragg Gratings in Multicore Fibers

Fiber Bragg gratings in multicore fibers can be used as compact and robust filters in astronomical and other research and commercial applications. Strong suppression at a single wavelength requires that all cores have matching transmission profiles. These gratings cannot be inscribed using the same method as for single-core fibers because the curved surface of the cladding acts as a lens, focusing the incoming UV laser beam and causing variations in exposure between cores. Therefore we use an additional optical element to ensure that the beam shape does not change while passing through the cross-section of the multicore fiber. This consists of a glass capillary tube which has been polished flat on one side, which is then placed over the section of the fiber to be inscribed. The laser beam enters the fiber through the flat surface of the capillary tube and hence maintains its original dimensions. This paper demonstrates the improvements in core-to-core uniformity for a 7-core fiber using this method. The technique can be generalized to larger multicore fibers.

We describe a technique for inscribing identical fiber Bragg gratings into each core of a multicore fiber. This is achieved by introducing an additional surface into the optical path to mitigate lensing by the curved surface of the fiber cladding.

كتابة براج حواجز شبكية في ألياف متعددة النواة

Fiber Bragg gratings in multicore fibers can be used as compact and robust filters in astronomical and other research and commercial applications. Strong ...

Engineering

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global reorganization and realignment of the gel microstructure. This process proceeds in a complex manner that is dependent in part on the interplay between the location of the cells, the geometry of the gel, and the mechanical constraints on the gel. To better understand how these variables produce global fiber alignment patterns, we use time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy coupled with an environmentally controlled bioreactor to observe the compaction process between geometrically spaced explants (clusters of fibroblasts). The images are then analyzed with a custom image processing algorithm to obtain maps of the strain. The information obtained from this technique can be used to probe the mechanobiology of various cell-matrix interactions, which has important implications for understanding processes in wound healing, disease development, and tissue engineering applications.

Time-lapse microscopy and image processing techniques were used to observe and analyze fibroblast-mediated gel compaction and fibrin fiber realignment in an environmentally controlled bioreactor over a 48 hr&#160;period.

مراقبة وقياس حجم فيبرين جل ضغط الخلايا الليفية بوساطة

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim to use these principles to create tissues with predefined collagen architectures. A full understanding of the exact underlying processes of collagen remodeling to control the final tissue architecture, however, is lacking. In particular, little is known about the (re)orientation of collagen fibers in response to changes in tissue mechanical loading conditions. We developed an in&#160;vitro model system, consisting of biaxially-constrained myofibroblast-seeded fibrin constructs, to further elucidate collagen (re)orientation in response to i) reverting biaxial to uniaxial static loading conditions and ii) cyclic uniaxial loading of the biaxially-constrained constructs before and after a change in loading direction, with use of the Flexcell FX4000T loading device. Time-lapse confocal imaging is used to visualize collagen (re)orientation in a nondestructive manner.
Cell and collagen organization in the constructs can be visualized in real-time, and an internal reference system allows us to relocate cells and collagen structures for time-lapse analysis. Various aspects of the model system can be adjusted, like cell source or use of healthy and diseased cells. Additives can be used to further elucidate mechanisms underlying collagen remodeling, by for example adding MMPs or blocking integrins. Shape and size of the construct can be easily adapted to specific needs, resulting in a highly tunable model system to study cell and collagen (re)organization.

This model system starts from a myofibroblast-populated fibrin gel that can be used to study endogenous collagen (re)organization real-time in a nondestructive manner. The model system is very tunable, as it can be used with different cell sources, medium additives, and can be adapted easily to specific needs.

هندسة المستندة إلى الليفين يبني الأنسجة من Myofibroblasts وتطبيق القيود والضغط للحث على تنظيم الخلايا والكولاجين (إعادة)

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

High-speed Continuous-wave Stimulated Brillouin Scattering Spectrometer for Material Analysis

Recent years have witnessed a significant increase in the use of spontaneous Brillouin spectrometers for non-contact analysis of soft matter, such as aqueous solutions and biomaterials, with fast acquisition times. Here, we discuss the assembly and operation of a Brillouin spectrometer that uses stimulated Brillouin scattering (SBS) to measure stimulated Brillouin gain (SBG) spectra of water and lipid emulsion-based tissue-like samples in transmission mode with &lt;10 MHz spectral-resolution and &lt;35 MHz Brillouin-shift measurement precision at &lt;100 ms. The spectrometer consists of two nearly counter-propagating continuous-wave (CW) narrow-linewidth lasers at 780 nm whose frequency detuning is scanned through the material Brillouin shift. By using an ultra-narrowband hot rubidium-85 vapor notch filter and a phase-sensitive detector, the signal-to-noise-ratio of the SBG signal is significantly enhanced compared to that obtained with existing CW-SBS spectrometers. This improvement enables measurement of SBG spectra with up to 100-fold faster acquisition times, thereby facilitating high spectral-resolution and high-precision Brillouin analysis of soft materials at high speed.

We describe the construction of a rapid continuous-wave-stimulated-Brillouin-scattering (CW-SBS) spectrometer. The spectrometer employs single-frequency diode-lasers and an atomic vapor notch-filter to acquire transmission spectra of turbid/non-turbid samples with high spectral-resolution at speeds up to 100-fold faster than those of existing CW-SBS spectrometers. This improvement enables high-speed Brillouin material analysis.

عالية السرعة كونتينووسوافي برلين حفز نثر مطياف لتحليل المواد

Recent years have witnessed a significant increase in the use of spontaneous Brillouin spectrometers for non-contact analysis of soft matter, such as ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled protein polymerization process is always a challenge. Here, we have developed an enzymatic methodology for constructing polymerized protein step by step in a rationally-controlled sequence. In this method, the C-terminus of a protein monomer is NGL for protein conjugation using OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) while the N-terminus was a cleavable TEV (tobacco etch virus) cleavage site plus an L (ENLYFQ/GL) for temporary N-terminal protecting. Consequently, OaAEP1 was able to add only one protein monomer at a time, and then the TEV protease cleaved the N-terminus between Q and G to expose the NH2-Gly-Leu. Then the unit is ready for next OaAEP1 ligation. The engineered polyprotein is examined by unfolding individual protein domain using atomic force microscopy-based single-molecule force spectroscopy (AFM-SMFS). Therefore, this study provides a useful strategy for polyprotein engineering and immobilization.

Here, we present a protocol to conjugate protein monomer by enzymes forming protein polymer with a controlled sequence and immobilize it on the surface for single-molecule force spectroscopy studies.

OaAEP1 بوساطة التوليف الأنزيمي وتجميد البروتين المبلمر للمطاطي للقوة أحادية الجزيء

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Biochemistry

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

التوليف من ألياف نانوية أساس كيراتين للهندسة الطبية الحيوية

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a non-contact measurement method that can be used to obtain direct readouts of viscoelastic material properties. It has been a useful tool in material characterization, structural monitoring and environmental sensing. In the past, Brillouin spectroscopy has usually employed scanning Fabry-Perot etalons to perform spectral analysis. This process requires high illumination power and long acquisition times, making the technique unsuitable for biomedical applications. A recently introduced novel spectrometer overcomes this challenge by employing two VIPAs in a cross-axis configuration. This innovation enables sub-Gigahertz (GHz) resolution spectral analysis with sub-second acquisition time and illumination power within the safety limits of biological tissue. The multiple new applications facilitated by this improvement are currently being explored in biological research and clinical application.

Here we present a protocol to build a rapid Brillouin spectrometer. Cascading virtually imaged phase array (VIPA) etalons achieve a measurement speed more than 1,000 times faster than traditional scanning Fabry-Perot spectrometers. This improvement provides the means for Brillouin analysis of tissue and biomaterials at low power levels in vivo.

عالية السرعة غيغاهرتز الفرعي مطياف لتحليل Brillouin نثر

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure and healing. Extraction of extracellular matrix from fibrogenic cell cultures in vitro has potential for generation of ECM from human- and potentially patient-specific cell lines, minimizing the presence of xenogeneic epitopes which has hindered the clinical success of some existing ECM products. A significant challenge in in vitro production of ECM suitable for implantation is that ECM production by cell culture is typically of relatively low yield. In this work, protocols are described for the production of ECM by cells cultured within sacrificial hollow fiber membrane scaffolds. Hollow fiber membranes are cultured with fibroblast cell lines in a conventional cell medium and dissolved after cell culture to yield continuous threads of ECM. The resulting ECM fibers produced by this method can be decellularized and lyophilized, rendering it suitable for storage and implantation.

The goal of this protocol is production of whole extracellular matrix fibers targeted for wound repair which are suitable for preclinical evaluation as part of a regenerative scaffold implant. These fibers are produced by the culture of fibroblasts on hollow fiber membranes and extracted by dissolution of the membranes.

إنتاج ألياف المصفوفة خارج الخلية عبر الألياف المجوفة الذبيحة غشاء الخلية والثقافة

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...