אנו מודים לד&quot;ר קלאודיה Cremers עבור עצתה המועילה על מבחני מלווה. קן וואן הוא הודה לקבלת הסיוע הטכני שלו טיהור HdeB. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הרפואי של הווארד יוז (כדי JCAB) לבין המכון הלאומי לבריאות מענק RO1 GM102829 כדי JCAB ו UJJ-UD הוא נתמך על ידי מענק מחקר בתר-דוקטוריאלי מסופק על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG).

ביטוי טיהור 1. של periplasmic HdeB הערה: HdeB התבטאה E. קולי תאים מחסה פלסמיד pTrc- hdeB 10, וטיהר מן periplasm על תמוגה polymyxin. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרבות לילה של E. קולי תאים מחסה פלסמיד pTrc- hdeB 10 ב 30 מ&quot;ל LB המכיל 200 מיקרוגרם / מ&quot;ל אמפיצילין (AMP LB). לחסן ארבעה 1 תרבויות L של LB Amp לגדל אותם על 37 מעלות צלזיוס ו 200 סל&quot;ד עד OD 600nm של 0.7 הוא הגיע. לאחר מכן, להוסיף 300 מיקרומטר IPTG להשרות את הביטוי של HdeB ולהפחית את הטמפרטורה הצמיחה עד 30 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 5 שעות של ביטוי חלבון ב 30 מעלות צלזיוס, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 8000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את תא גלולה עם 100 מ&quot;ל חיץ (50 מ&quot;מ טריס / HCl, 50 mM NaCl, pH 7.5) ו צנטריפוגות שוב התאים ב 8000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C A. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לכך, גלולהתא גלול ב 80 מיליליטר הצפה, המכילה 1 מ&quot;ג / סולפט polymyxin מיליליטר. עבור שיבוש יעיל של הממברנה החיצונית, בעדינות מערבבים את ההשעיה עבור שעה 1 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את חלק cytoplasmic ופסולת תאית, צנטריפוגה ההשעיה עבור 20 דקות ב 15,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. התוצאה היא ~ 60 מיליליטר supernatant המכיל את HdeB המסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze את supernatant המכיל את תמצית periplasmic לילה נגד נפח 150x של חיץ B (20 מ&quot;מ טריס / HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.0) באמצעות קרום דיאליזה עם 6 kDa MW חתוכים. לרכז את החלבונים עד 15 מ&quot;ל באמצעות יחידות צנטריפוגלי מסנן עם משקל מולקולרי חתוכים של 3 kDa. סנן את פתרון החלבון באמצעות מסנן נקבובי 0.2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את החלבון על טור כרומטוגרפיה אניוני (נפח עמודה 5 מ&quot;ל) כי כבר equilibrated עם B חיץ 5 כרכים עמודה עם קצב הזרימה של 2.5 mL / min. לאחר החלבון נטען על הטור, לשטוף את העמודה עם החיץ B במשך 10 דקות בשיעור תזרים של 2.5 מ&quot;ל / דקה. Elute HdeB עם שיפוע ליניארי 0 כדי 0.5 M NaCl חיץ B על פני פרק זמן של 50 דקות עם קצב הזרימה של 2.5 mL / min 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות שברים המכילים HdeB באמצעות SDS-PAGE 15%. מערבבים 20 מדגם μl עם 5 μl 5x חיץ טעינת מופחת SDS. טען 10 μl על ג&#39;ל ולהפעיל חיץ טריס-גליצין (גליצין 14.4 גר &#39;/ ל, 2.9 גר&#39; / ל טריס, 1 גר &#39;/ ל סולפט dodecyl נתרן, pH 8.3). הפעל את הג&#39;ל על 150 V עד להקת bromophenol העבירה קרובה לתחתית הג&#39;ל (~ 45 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת כל שברים HdeB המכילים, דיאליזה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה נגד 4 למאגר אחסון L HdeB (50 מ&quot;מ טריס / HCl, 200 מ&quot;מ NaCl, pH 8.0), ולהתרכז החלבון לכ 300 מיקרומטר באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי חתוכים של 3 kDa. קבע את הריכוז של HdeB ב 280 ננומטר באמצעות 280nm ε מקדם הכחדה = 15,595 M -1 cm -1. כן 100 aliquots μl ופלאש ללאZE את aliquots בחנקן נוזלי. הערה: HdeB ניתן לאחסן ב -70 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 חודשים. </li></ol> 2. Assay פעילות הורה מלווה שימוש תרמית התגלגלות dehydrogenase Malate (MDH) הערה: השפעת HdeB מטוהר על צבירת תרמית התגלגלות dehydrogenase malate המיטוכונדריה החזירית (MDH) בערכי pH שונים הייתה פיקוח כמפורט להלן. כל ריכוזי חלבון המפורטים מתייחסים ריכוז מונומר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין MDH, dialyze MDH ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה נגד 4 C חיץ L (פוספט אשלגן 50 מ&quot;מ, 50 מ&quot;מ NaCl, pH 7.5) ולרכז את חלבון כ 100 מיקרומטר באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי חתוכים 30 kDa. הערה: דיאליזה זהירות של MDH נדרשת MDH מועבר כפתרון אמוניום סולפט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר אגרגטים, בצנטריפוגה חלבון במשך 20 דקות ב 20,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. קביעת ריכוז MDH ידי ספיגה ב 280 ננומטר (ε &lt;sub&gt; 280 ננומטר = 7,950 M -1 cm -1). הכן 50 aliquots μl של MDH ופלאש להקפיא את aliquots לאחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים קובט קוורץ 1 מ&quot;ל לתוך ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי מצויד מחזיקי מדגם מבוקר טמפרטורה בוחש. הגדר לשעבר λ / em ל -350 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כרכים המתאים של טרום התחמם (43 ° C) חיץ D (150 פוספט אשלגן מ&quot;מ, 150 מ&quot;מ NaCl) על ערכי pH הרצוי (כאן: pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0, ו- pH 5.0) כדי קובט וערכת הטמפרטורה של בעל קובט ל -43 מעלות צלזיוס. ההיקף הכולל הוא 1,000 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 12.5 מיקרומטר HdeB (או לחילופין באותו נפח של למאגר אחסון HdeB על בקרת חיץ) למאגר, ואחריו תוספת של MDH 0.5 מיקרומטר. מתחיל בבקרת פיזור אור. דגירת התגובה עבור 360 שניות כדי לאפשר מספיק התגלגלות של MDH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את pH עד 7 על ידי הוספת נפח 0.16-0.34 מ -2 K unbuffered M 2 HPO 4 ולהמשיך מחדשcording פיזור אור עבור 440 אחר שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מידת הצטברות MDH כי נרשמה בהעדר המלווה בנקודת זמן מוגדרת לאחר הנטרול (כאן אחרי 500 שניות, כאשר פיזור אור המקסימאלי של MDH נצפה) ל -100%. לנרמל פעילות HdeB לאות פיזור אור של MDH בהעדר HdeB בכל ערך pH מצוין. </li></ol> 3. איתור של גיבוש קומפלקס HdeB-LDH ידי אנליטית ultracentrifugation (AUC) הערה: ניסויים מהירות שקיעה של HdeB לבד או בקומפלקס עם תרמית התגלגלות לקטט דהידרוגנאז (LDH) בוצעו באמצעות ultracentrifuge אנליטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין LDH, dialyze LDH ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה נגד 4 L חיץ C (50 פוספט אשלגן מ&quot;מ, 50 מ&quot;מ NaCl, pH 7.5) ולרכז את חלבון כ -200 מיקרומטר באמצעות יחידות מסנן צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי חתוכים 30 kDa. הערה: דיאליזה זהירות של LDH נדרשת LDH מועבר כפתרון אמוניום סולפט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר אגרגטים, LDH צנטריפוגות במשך 20 דקות ב 20,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. קביעת ריכוז LDH ידי ספיגה ב 280 ננומטר (ננומטר = ε 280 43,680 M -1 cm -1). הכן 50 aliquots μl של LDH ופלאש להקפיא את aliquots לאחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 3 LDH מיקרומטר בנוכחות והיעדר HdeB 30 מיקרומטר במאגר D (pH 4 ו -7, בהתאמה) במשך 15 דקות ב 41 מעלות צלזיוס. הערה: דגירה של LDH לתוצאות טמפרטורות גבוהות ב הצבירה המוחלטת שלה, ואין שפעה מלווה של HdeB ניתן לצפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנו דגימות להתקרר לטמפרטורת החדר. ואז, דגימות עומס לתוך התאים המכילים במגזר סטנדרטי בצורת 2 ערוצים מסידורי עם 1.2 ס&quot;מ אורך הדרך. טען את התאים לתוך ultracentrifuge לאזן ל -22 מעלות צלזיוס למשך לפני 1 שעה לפחות כדי שקיעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין דגימות ב 22 ° C ו- 167,000 XG ב הרוטור בהתאמה במשך 12 שעות, ולנטר את sedimentation של חלבון ברציפות ב 280 ננומטר. כפי שתואר קודם לכן, יחס האות לרעש הוא השתפר כאשר עוצמת האור המועברת של כל ערוץ נמדדת ולא ספיג. זה גם משפר את איכות הולם נתונים עקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח נתונים עם SEDFIT (15.01b גרסה, דצמבר 2015), באמצעות ג הרציף מודל ההפצה (הים) 17. הדרכה המתאר כיצד להשתמש SEDFIT ניתן למצוא התייחסות 18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את רמת הביטחון להסדרת ME (מקסימום אנטרופיה) 0.7. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב צפיפות חיץ וכן צמיגות באמצעות SEDNTERP 19. כדי לאמוד את כמות חלבון הלקוח מצטבר, השווה את אינטגרלים של LDH משקע ב pH 4 ל- pH 7 כהפניה. הערה: שילוב של מגרשי הפצת השקיעה יכול להיעשות ישירות SEDFIT. תוכנות חלופיות כדי לנתח נתונים מהירים שקיעה ניתן למצוא בביקורתם אחרונה 20. &lt;/ Li&gt; </ol> 4. ניטור MDH איון והפעלה מחדש בנוכחות HdeB הערה: השפעת HdeB מטוהר על refolding של pH-פרש MDH נקבעה על ידי ניטור פעילות MDH על הניטרול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 1 MDH מיקרומטר במאגר D על ערכי pH הרצוי (כאן: pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0, ו- pH 5.0) במשך שעה 1 ב 37 ° C בהעדר או בנוכחות HdeB 25 מיקרומטר. לאחר מכן, להעביר את הטמפרטורה ל 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הערה: אין refolding MDH נצפתה אפילו בנוכחות של HdeB כאשר MDH הודגר בטמפרטורות גבוהות מ -37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליזום refolding של MDH מפוגל חומצה, לנטרל את דגימות ה- pH 7 על ידי תוספת של נפח 0.13-0.42 של 0.5 M פוספט נתרן, pH 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה עבור שעה 2 ב 20 מעלות צלזיוס, לקבוע פעילות MDH על ידי ניטור ירידה של NADH ב 340 9 ננומטר. הערה: MDH מזרז את הירידה תלויה-NADH של oxaloacetate לתוך L-Malate. <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 50 μl של התגובה הדגירה עם 950 μl של חיץ assay (פוספט נתרן 50 מ&quot;מ, pH 8.0, 1 מ&quot;מ oxaloacetate, ו -150 מיקרומטר NADH). הערה: הריכוז הסופי של MDH למאגר assay צריך להיות 44 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על השינוי ספיג באמצעות ספקטרופוטומטר, מצויד בלוק בקרת טמפרטורת פלטייה מוגדר 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דווח על יחסי פעילות MDH ל -44 ננומטר יליד MDH כי נשמר ב- pH 7.0. </li></ol></li></ol> 5. השפעת HdeB התבטאות יתר על E. coli הישרדות תחת מתח חומצה הערה: E. coli MG1655 הדנ&quot;א הגנומי היה מבודד באמצעות פרוטוקול שפורסם 21. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר hdeB מ E. MG1655 coli על ידי PCR באמצעות hdeB פריימרים - BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT GTC CAA ATT CGG ו hdeB - Ecor I-FW GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תגובת PCR ב 50 μl כדלקמן: 10 μl חיץ פולימראז 5x, 200 מיקרומטר dNTPs, 0.5 מיקרומטר פריימר JUD2, 0.5 מיקרומטר פריימר JUD5, 150 ng MG1655 הדנ&quot;א הגנומי, 0.5 DNA פולימרז μl, להוסיף DDH 2 O עד 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הגברה של hdeB כדלקמן: שלב 1: 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, 1 מחזור; צעד 2: 30 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 55 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 72 מעלות צלזיוס, 40 מחזורים; שלב 3: 10 דק &#39;ב 72 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Clone וכתוצאה מכך שבר PCR לתוך האתרים Ecor אני BamH לי של פלסמיד pBAD18 באמצעות שיטות סטנדרטיות עבור שיבוט אתר הגבלה. לטהר את הפלסמיד באמצעות ערכת טיהור פלסמיד פי הוראות היצרן. בדוק את הפלסמיד שהתקבל על ידי רצף 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את הפלסמיד להביע HdeB או pBAD18 בקרת וקטור ריק לתוך BB7224 זן (Δ rpoH) (גנוטיפ: F -, λ -, E14 -, [araD139] B / [r6; (argF-לאק) 169 flhD5301 Δ (fruK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: Tn 10 (Tc S) suhX401 deoC1 ארד + rpoH :: kan +; 16) באמצעות תאים מוסמכים כימי. הערה: זן זה הוא רגיש לטמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 45 שניות-הלם חום על 42 מעלות צלזיוס ולפני הציפוי, דגירת תאים ב 30 מעלות צלזיוס, 200 סל&quot;ד. בצע פס-outs מושבה אחת של שיבוטים חיובי דגירה לילה בשעה 30 ° C. הכן תרבות הלילה ב 50 מ&quot;ל LB Amp ולטפח את התאים ב 200 סל&quot;ד ו -30 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרבויות לילה פי 40 ל -25 מ&quot;ל LB Amp ולגדול החיידקים בנוכחות 0.5% arabinose (Ara) על 30 מעלות צלזיוס ו 200 סל&quot;ד ל 600nm OD = 1.0 להשרות ביטוי חלבון HdeB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ניסויי משמרת pH, השתמש LBAmp + ערה לדלל את התאים OD 600nm של 0.5 ולהתאים לערכי pH בהתאמה (כאן: pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0) על ידי הוספת כמויות מתאימות של 5 M HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהוחלט על נקודות זמן המצוינות (pH 2, 1 דקות; pH 3, 2.5 דקות, pH 4, 30 דק &#39;), לנטרל את התרבויות על ידי תוספת של הכרכים המתאימים של 5 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על הצמיחה של התרבויות לנטרל בתרבות הנוזלית במשך 12 שעות ב 30 ° C באמצעות מדידות OD. </li></ol>

<ol>
	<li>Smith, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Gastric+Acid+in+Preventing+Foodborne+Disease+and+How+Bacteria+Overcome+Acid+Conditions.">The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions.</a> J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).</li><li>Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-dependent+mechanisms+for+acid+resistance+in+enteric+bacteria.">Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria.</a> Trends Microbiol. 20 (7), 328-335 (2012).</li><li>Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+bacterial+outer+membrane+proteins:+barrels+in+a+nutshell.">Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell.</a> Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).</li><li>Reichmann, D., Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Order+out+of+Disorder:+Working+Cycle+of+an+Intrinsically+Unfolded+Chaperone.">Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone.</a> Cell. 148 (5), 947-957 (2012).</li><li>Bardwell, J. C. A., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+disorder+in+chaperone+action.">Conditional disorder in chaperone action.</a> Trends Biochem Sci. 37 (12), 517-525 (2012).</li><li>Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+an+acid-activated+chaperone+allows+promiscuous+substrate+binding.">Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5557-5562 (2009).</li><li>Hong, W., Jiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+Protein+HdeA+Exhibits+Chaperone-like+Activity+Exclusively+within+Stomach+pH+Range+by+Transforming+into+Disordered+Conformation.">Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation.</a> J Biol Chem. 280 (29), 27029-27034 (2005).</li><li>Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+pH-Dependent+Dissociation+of+HdeA+Dimers.">Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers.</a> J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).</li><li>Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+refolding+by+pH-triggered+chaperone+binding+and+release.">Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 1071-1076 (2010).</li><li>Dahl, J. -. U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HdeB+Functions+as+an+Acid-protective+Chaperone+in+Bacteria.">HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria.</a> J Biol Chem. 290 (1), 65-75 (2015).</li><li>Waterman, S. R., Small, P. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+sigmas-dependent+genes+associated+with+the+stationary-phase+acid-resistance+phenotype+of+Shigella+flexneri.">Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri.</a> Mol Microbiol. 21 (5), 925-940 (1996).</li><li>Mucacic, M., Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+Hsp31+Contributes+to+Acid+Resistance+in+Stationary-Phase+Escherichia+coli.">Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (3), 1014-1018 (2007).</li><li>Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+Chaperone-assisted+Refolding+of+Citrate+Synthase.">Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase.</a> J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).</li><li>Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+Activity+with+a+Redox+Switch.">Chaperone Activity with a Redox Switch.</a> Cell. 96 (3), 341-352 (1999).</li><li>Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+Molecular,+Modeling,+and+Systems+Approaches+for+an+Understanding+of+the+Escherichia+coli+Heat+Shock+Response.">Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 72 (3), 545-554 (2008).</li><li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol.">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Mol Microbiol. 40 (2), 397-413 (2001).</li><li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-Distribution+Analysis+of+Macromolecules+by+Sedimentation+Velocity+Ultracentrifugation+and+Lamm+Equation+Modeling.">Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling.</a> Biophys J. 78 (3), 1606-1619 (2000).</li><li>Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation:+A+versatile+tool+for+the+characterisation+of+macromolecular+complexes+in+solution.">Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution.</a> Methods. 95, 55-61 (2016).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Nucleic+Acids+by+Extraction+with+Phenol:Chloroform.">Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).</li><li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. i. n. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+activation+by+unfolding.">Chaperone activation by unfolding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).</li><li>Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+the+isolation+and+characterization+of+molecular+chaperones.">Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones.</a> Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).</li><li>Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Heat-shock+Protein+70+Reaction+Cycle+by+the+Mammalian+DnaJ+Homolog,+Hsp40.">Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40.</a> J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).</li><li>Quan, S., Koldewey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+selection+designed+to+stabilize+proteins+uncovers+a+chaperone+called+Spy.">Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).</li><li>Gray, M. J., Wholey, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+Is+a+Primordial+Chaperone.">Polyphosphate Is a Primordial Chaperone.</a> Mol Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

<html> על מנת ללמוד את המנגנון של הפעלה מלווה פונקציה של HdeB, כמויות גדולות של HdeB צריכים לבוא לידי ביטוי ו מטוהר. מספר מערכות וקטור ביטוי זמינים לייצור רמות גבוהות של חלבון המטרה, כולל וקטורים pTrc או pBAD, אשר שניהם שימשו במחקר זה. היזמים נגישים בקלות עבור E. RNA פולימראז c...

סביבה טבעית משותפת שבה פתוגנים חיידקים לחוות תנאי התגלגלות חלבון חומצה הנגרמת היא בבטן היונקת (טווח pH 1-4), אשר pH חומצי משמש מחסום יעיל נגד פתוגנים שמקורן במזון 1. חלבון התגלגלות ומקבצים, אשר נגרם על ידי protonation שרשרת הצד של חומצות אמיניות, משפיעים תהליכים ביולוגיים, מבנים הסלולר ניזקים ולבסוף גורם מוות של תאי 1,2. מאז ה- pH של periplasm חיידקי equilibrates כמעט מיידי עם pH הסביבתי עקב דיפוזיה החופשית של פרוטונים דרך הממברנה החיצונית הנקבובית, חלבונים בממברנה periplasmic והפנימיים של חיידקי גרם שליליים הם מרכיבים התאיים הפגיעים ביותר בתנאי חומצה-מתח 3. כדי להגן proteome שלהם periplasmic מפני נזק חומצה בתיווך מהירה, חיידקים גראם שליליים לנצל את המלוות periplasmic המופעל חומצה HdeA ו HdeB. HdeA הוא מלווה מופרע על תנאים <sup&gt; 4,5: ב- pH נייטרלי, HdeA קיים בתור דימר מקופל, המלווה-פעיל. עם שינוי pH מתחת pH 3, הפונקציה המלווה של HdeA מופעלת במהירות 6,7. הפעלת HdeA דורש שינויים מבניים עמוקים, כולל ניתוק שלה לתוך מונומרים, ואת חלקי התגלגלות של מונומרים 6-8. הופעל פעם אחת, HdeA נקשר לחלבונים הנפרשות בתנאים חומציים. זה מונע ביעילות הצבירה שלהם הוא במהלך הדגירה ב- pH הנמוך, כמו גם על נטרול pH. עם שובו ל- pH 7.0, HdeA מקל על refolding של חלבוני הלקוח שלו בצורה ATP-עצמאית וממיר בחזרה לתוך קונפורמציה שלה dimeric, בת הלוויה-פעיל 9. באופן דומה, HdeB המלווה ההומולוגי הוא גם לוויה-פעיל ב- pH 7.0. בניגוד HdeA, לעומת זאת, פעילות המלווה של HdeB מגיע המקסימלית שלה לכאורה ברמה של 4.0 pH, התנאים שבהם HdeB עדיין מקופלת ברובו dimeric 10. יתר על כן, עוד הורדת קאוס pHes איון של HdeB. תוצאות מראות כי למרות ההומולוגיה הנרחבת שלהם, HdeA ו HdeB שונים במצב שלהם הפעלה פונקציונלית ומאפשרת להם מכסי מגוון רחב pH עם פונקצית המלווה המגנה שלהם. מלווה אחר אחת כי היה מעורב התנגדות החומצה של E. coli הוא Hsp31 cytoplasmic, המופיע לייצב חלבוני הלקוח פרש עד משוחזרים תנאי נייטרלי. המצב המדויק של הפעולה של Hsp31, לעומת זאת, נותר 12 חידתי. בהתחשב בכך חיידקים וחיידק אחרים כגון סלמונלה חסרים את אופרון hdeAB, סביר מאוד כי מלוות periplasmic בלתי מזוהים אחרים אבל בכל זאת עלולים להתקיים כי הם מעורבים התנגדות חומצה של חיידקים אלה 11. הפרוטוקולים שהוצגו כאן מאפשרים לפקח על הפעילות המלווה תלוי pH של HdeB במבחנה ובחי 10 וניתן להחיל לחקור מלווים אחריםכגון Hsp31. לחלופין, הרשת המורכבת של גורמי שעתוק השולטות ביטוי hdeAB יכולה להיחקר באופן פוטנציאלי על ידי assay מתח vivo. כדי לאפיין את תפקודם של חלבונים המלווים in vivo, setups הניסיוני השונה ניתן ליישם. מסלול אחד הוא ליישם בתנאי עקה התגלגלות חלבון phenotypically לאפיין זנים מוטנטים כי גם ביטוי יתר של הגן של עניין או לבצע מחיקה של הגן. ניתן לבצע מחקרי proteomic לזהות אילו חלבונים כבר לא המצרפי בתנאי קיצון כאשר המלווה הוא הווה, או את ההשפעה של מלווה על אנזים מסוים יכולה להיקבע במהלך בתנאי עקה באמצעות מבחני האנזימטית 14-16. במחקר זה, בחרנו overexpress HdeB ב זן מחיקת rpoH, אשר חסר את גורם סיגמא הלם חום 32. RpoH שולט הביטוי של כל א הגדולה מלווה coli והמחיקה שלו ידועה להגדיל sensitivity לתנאי עקה סביבתיים הגורמים חלבון התגלגלות 15. פעילות המלווה vivo של HdeB נקבע על ידי ניטור יכולתה לדכא את רגישות ה- pH של זן Δ rpoH. בסך הכל, הפרוטוקולים שהוצגו כאן לספק גישה מהירה וישירה לאפיין את הפעילות של מלווה חומצה מופעלת במבחנה וכן בהקשר vivo.

<table><tbody><tr><td>NEB10-beta &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; cells</td><td>New England Biolabs</td><td>C3019I</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-3</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth mix, Lennox</td><td>LAB Express</td><td>3003</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826-5kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Polymyxin B sulfate&amp;nbsp;</td><td>ICN Biomedicals Inc.</td><td>100565</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m pore sterile Syringe Filter</td><td>Corning</td><td>431218</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q HP (CV 5 ml)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1153-01</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX, 15%</td><td>Bio-Rad</td><td>4561046</td><td></td></tr><tr><td>Malate dehydrogenase (MDH)</td><td>Roche</td><td>10127914001</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate (Monobasic)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate (Dibasic)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>F-4500 fluorescence spectrophotometer</td><td>Hitachi</td><td>FL25</td><td></td></tr><tr><td>Oxaloacetate</td><td>Sigma</td><td>O4126-5G</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>N8129-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S9390-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S397-500</td><td></td></tr><tr><td>Lactate dehydrogenase (LDH)</td><td>Roche</td><td>10127230001</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>&lt;a href=&#039;https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&amp;amp;_windowLabel=UCM_RENDERER&amp;amp;_urlType=render&amp;amp;wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/&#039;&gt;392764&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled</td><td>Beckman Coulter</td><td>306493</td><td></td></tr><tr><td>AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place</td><td>Beckman Coulter</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus Miniprep Kit</td><td>Promega</td><td>A1470</td><td>used for plasmid purification (Protocol 5.1)</td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-300-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>DOT Scientific Inc</td><td>DSG36050-1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Cell cuvette</td><td>Hellma Analytics</td><td>119004F-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP set</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Avanti J-26XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>Varian Cary 50 spectrophotometer</td><td>Agilent Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132650</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp166-500</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-Well Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher</td><td>4375786</td><td></td></tr></tbody></table>

detection of the ph-dependent activity of escherichia coli chaperone hdeb in vitro and in vivo

חיידקים נחשפים לעתים קרובות לשינויים סביבתיים, כגון שינויים ב- pH, טמפרטורה, מצב חיזור, חשיפה לאור או כוח מכני. הרבה מהמקרים האלה לגרום חלבון התגלגלות בתא ויש להם השפעה מזיקה על ההישרדות של האורגניזם. קבוצת מלווים שאינם קשורים, מולקולריים ספציפי לחץ הוכחה לשחק תפקידים חיוניים להישרדותה של תנאי הלחץ הללו. בעוד מקופל מלא מלווה-פעיל לפני לחץ, החלבונים האלה להתפתח במהירות ולהיות מלווה-פעיל בתנאי קיצון ספציפי. הופעל פעם אחת, מלווה סדר המותנה אלה נקלטות על ידי מספר רב של חלבוני צבירה נוטה שונים, למנוע הצבירה שלהם במישרין או בעקיפין להקל חלבון refolding עם שיבת תנאים שאינם מתח. הגישה העיקרית להשגת הבנה מפורטת יותר על המנגנון של הכרת הפעלת הלקוח שלהם כרוכה הטיהור subsequenאפיון t של חלבונים אלו באמצעות מבחני מלווה במבחנה. מעקב מבחני לחץ vivo חיוני לחלוטין כדי לאשר את שהושג באופן עצמאי בתוצאות חוץ גופייה. פרוטוקול זה מתאר במבחנה שיטות vivo לאפיין את הפעילות המלווה של E. coli HdeB, גידול מלווה חומצה מופעלת. מדידות פיזור אור שמשו לקריאה מתוך נוח הקיבולת של HdeB למנוע צבירה הנגרמת חומצה של חלבון לקוח המודל הוקם, MDH, במבחנה. ניסויי ultracentrifugation אנליטית יושמו לחשוף היווצרות מורכבת בין HdeB ו LDH חלבון הלקוח שלה, כדי לשפוך אור לתוך גורל חלבוני לקוח עם שובי תנאים שאינם מתח. מבחני הפעילות האנזימטית של חלבוני הלקוח נערכו במטרה לפקח על תופעות של HdeB על איון הלקוח הנגרמת pH ו מחדש. לבסוף, מחקרים הישרדות שימשו Monitor השפעת פונקצית in vivo המלווה של HdeB.

HdeA ו HdeB הם הומולוגיים E. חלבונים coli, ידוע להגן חלבונים periplasmic נגד בתנאי עקה חומצה 10. העבודה שלנו גילתה כי בדומה HdeA, HdeB מתפקד גם בתור חומצה מופעלת מלווה מולקולרי. עם זאת, בניגוד HdeA, פונקציות HdeB ב- pH כי הוא עדיין פוטנציאל bactericidal, אך גבוה משמע...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

מחקר זה מתאר טכניקות biophysical, ביוכימיים ומולקולריים לאפיין את הפעילות המלווה של Escherichia coli HdeB בתנאי pH חומצי. שיטות אלו יושמו בהצלחה עבור מלוות חומצה-מגן אחרות כגון HdeA והוא יכול להיות שונה כדי לעבוד עבור מלווים אחרים בתנאי עקה.

איתור של הפעילות תלויה pH של<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

detection-ph-dependent-activity-escherichia-coli-chaperone-hdeb-vitro

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

10.3K Views.  University of Michigan.  מחקר זה מתאר טכניקות biophysical, ביוכימיים ומולקולריים לאפיין את הפעילות המלווה של Escherichia coli HdeB בתנאי pH חומצי. שיטות אלו יושמו בהצלחה עבור מלוות חומצה-מגן אחרות כגון HdeA והוא יכול להיות שונה כדי לעבוד עבור מלווים אחרים בתנאי עקה. 

Video: Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt;: עיצוב, ייצור טיהור

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

הגדרת פעילות מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33 ומיפוי השינויים הסתגלותי על Hsp33 באמצעות ספקטרומטר מסה של המרת מימן-דאוטריום

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting of two copies of the core histones H2A, H2B, H3, and H4, wrapped around by the DNA. The octamer is composed of two copies of an H2A/H2B dimer and a single copy of an H3/H4 tetramer. The highly charged core histones are prone to non-specific interactions with several proteins in the cellular cytoplasm and the nucleus. Histone chaperones form a diverse class of proteins that shuttle histones from the cytoplasm into the nucleus and aid their deposition onto the DNA, thus assisting the nucleosome assembly process. Some histone chaperones are specific for either H2A/H2B or H3/H4, and some function as chaperones for both. This protocol describes how in vitro laboratory techniques such as pull-down assays, analytical size-exclusion chromatography, analytical ultra-centrifugation, and histone chaperoning assay could be used in tandem to confirm whether a given protein is functional as a histone chaperone.

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

This protocol describes a battery of methods that includes analytical size-exclusion chromatography to study histone chaperone oligomerization and stability, pull-down assay to unravel histone chaperone-histone interactions, AUC to analyze the stoichiometry of the protein complexes, and histone chaperoning assay to functionally characterize a putative histone chaperone in vitro.

במבחנה אפיון מלווי היסטון באמצעות מבחני אנליטיקה, משיכה וליווי

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. Biomolecules such as proteins, carbohydrates, vitamins, fatty acids, nucleic acids, and enzymes are fundamental building blocks of living beings; they assemble into complex networks in biosystems to synchronize a myriad of life events. Proteins typically utilize complex interactome networks to carry out their functions; hence it is mandatory to evaluate such interactions to unravel their importance in cells at both cellular and organism levels. Toward this goal, we introduce a rapidly emerging technology, field-effect biosensing (FEB), to determine specific biomolecular interactions. FEB is a benchtop, label-free, and reliable biomolecular detection technique to determine specific interactions and uses high-quality electronic-based biosensors. The FEB technology can monitor interactions in the nanomolar range due to the biocompatible nanomaterials used on its biosensor surface. As a proof of concept, the protein-protein interaction (PPI) between heat shock protein 90 (Hsp90) and cell division cycle 37 (Cdc37) was elucidated. Hsp90 is an ATP-dependent molecular chaperone that plays an essential role in the folding, stability, maturation, and quality control of many proteins, thereby regulating multiple vital cellular functions. Cdc37 is regarded as a protein kinase-specific molecular chaperone, as it specifically recognizes and recruits protein kinases to Hsp90 to regulate their downstream signal transduction pathways. As such, Cdc37 is considered a co-chaperone of Hsp90. The chaperone-kinase pathway (Hsp90/Cdc37 complex) is hyper-activated in multiple malignancies promoting cellular growth; therefore, it is a potential target for cancer therapy. The present study demonstrates the efficiency of FEB technology using the Hsp90/Cdc37 model system. FEB detected a strong PPI between the two proteins (KD values of 0.014 &#181;M, 0.053 &#181;M, and 0.072 &#181;M in three independent experiments). In summary, FEB is a label-free and cost-effective PPI detection platform, which offers fast and accurate measurements.

Field-effect biosensing (FEB) is a label-free technique for detecting biomolecular interactions. It measures the electric current through the graphene biosensor to which the binding targets are immobilized. The FEB technology was used to evaluate biomolecular interactions between Hsp90 and Cdc37 and a strong interaction between the two proteins was detected.

חקר האינטראקציה הביומולקולרית בין המלווה המולקולרי Hsp90 לבין חלבון הלקוח שלו Kinase Cdc37 באמצעות טכנולוגיית ביוסנסינג בעלת אפקט שדה

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

הערכת פעילות מלווה Hsp70 באמצעות תאי Escherichia coli dnaK756

Escherichia coli -Based Complementation Assay to Study the Chaperone Function of Heat Shock Protein 70

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. While Hsp70 is not essential for E. coli cells growing under normal conditions, this chaperone becomes indispensable for growth at elevated temperatures. Since Hsp70 is highly conserved, one way to study the chaperone function of Hsp70&#160;genes from various species is to heterologously express them in E. coli strains that are either deficient in Hsp70 or express a native Hsp70 that is functionally compromised. E. coli dnaK756&#160;cells are unable to support &#955; bacteriophage DNA. Furthermore, their native Hsp70 (DnaK) exhibits elevated ATPase activity while demonstrating reduced affinity for GrpE (Hsp70 nucleotide exchange factor). As a result, E. coli dnaK756&#160;cells grow adequately at temperatures ranging from 30 &#176;C to 37 &#176;C, but they die at elevated temperatures (&#62;40 &#176;C). For this reason, these cells serve as a model for studying the chaperone activity of Hsp70. Here, we describe a detailed protocol for the application of these cells to conduct a complementation assay, enabling the study of the in cellulo chaperone function of Hsp70.

מחבר זרקור: חקר חלבוני הלם חום בזיהומים במלריה ושחפת

This protocol demonstrates the chaperone activity of heat shock protein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756 cells serve as a model for the assay as they harbor a native, functionally impaired Hsp70, making them susceptible to heat stress. The heterologous introduction of functional Hsp70 rescues the growth deficiency of the cells.

Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. ...

Intracellular Refolding Assay

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds with inhibitory/stimulating activity. Molecular chaperones are proteins involved in regulation of protein folding1 and have a crucial role in promoting cell survival upon stress insults like heat shock2, nutrient starvation and exposure to chemicals/poisons3. For this reason chaperones are found to be involved in events like tumor development, chemioresistance of cancer cells4 as well as neurodegeneration5. Design of small molecules able to inhibit or stimulate the activity of these enzymes is therefore one of the most studied strategies for cancer therapy7 and neurodegenerative disorders9. The assay here described offers the possibility to measure the refolding activity of a particular molecular chaperone and to study the effect of compounds on its activity. In this method the gene of the molecular chaperone investigated is transfected together with an expression vector encoding for the firefly luciferase gene. It has been already described that denaturated firefly luciferase can be refolded by molecular chaperones10,11. As normalizing transfection control, a vector encoding for the renilla luciferase gene is transfected. All transfections described in this protocol are performed with X-treme Gene 11 (Roche) in HEK-293 cells. In the first step, protein synthesis is inhibited by treating the cells with cycloheximide. Thereafter protein unfolding is induced by heat shock at 45&deg;C for 30 minutes. Upon recovery at 37&deg;C, proteins are re-folded into their active conformation and the activity of the firefly luciferase is used as read-out: the more light will be produced, the more protein will have re-gained the original conformation. Non-heat shocked cells are set as reference (100% of refolded luciferase).

In this protocol a method to measure intracellular protein refolding after heat shock is described. This method can be used to study foldases like molecular chaperones and their co-factors or compounds able to influence their activity. Firefly luciferase activity is used as reporter to measure chaperone refolding activity.

שב וקיפל תאיים Assay

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

איתור של הפעילות תלויה pH של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית מ

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום

הגדרת פעילות מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33 ומיפוי השינויים הסתגלותי על Hsp33 באמצעות ספקטרומטר מסה של המרת מימן-דאוטריום

במבחנה אפיון מלווי היסטון באמצעות מבחני אנליטיקה, משיכה וליווי

חקר האינטראקציה הביומולקולרית בין המלווה המולקולרי Hsp90 לבין חלבון הלקוח שלו Kinase Cdc37 באמצעות טכנולוגיית ביוסנסינג בעלת אפקט שדה

Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70

Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70

Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70

שב וקיפל תאיים Assay

איתור של הפעילות תלויה pH של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום

הגדרת פעילות מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33 ומיפוי השינויים הסתגלותי על Hsp33 באמצעות ספקטרומטר מסה של המרת מימן-דאוטריום

במבחנה אפיון מלווי היסטון באמצעות מבחני אנליטיקה, משיכה וליווי

חקר האינטראקציה הביומולקולרית בין המלווה המולקולרי Hsp90 לבין חלבון הלקוח שלו Kinase Cdc37 באמצעות טכנולוגיית ביוסנסינג בעלת אפקט שדה

Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70

Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70

Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70

שב וקיפל תאיים Assay

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית מ