העבודה המוצגת כאן נתמכה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) (מעניק DCB-120,266, PPP-133,377 ו HBF-348,967 ל AG).

1. תאי transfections <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאי HEK 293T במדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין. כן השעית 2 x 10 5 תאים / מיליליטר במדיום תרבית תאים. הוספת 500, 100 ו -1,000 μl של השעיה התא היטב כל 24 גם, 96-היטב צלחות 12-היטב, לייצור ויראלי, כדאיות התא מבחני ההפעלה החיסונית, בהתאמה (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת בעדינות את הצלחות דגירה אותם O / N ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. לגדל תאים כדי 50-70% confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על פי תוכנית transfection, להכין דילולים של RNAs מבחן ובקרות שלהם ב 1.5 צינורות מיקרו מ&quot;ל (דוגמה, איור 2B). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור assay הייצור ויראלי, להכין 10 ng / דילול μl של פלסמיד ביטוי HIV-1 ולהוסיף 10 μl על צינור אחד. הבא להכין 5 מיקרומטר דילולים של RNAs הניסיוני RN בקרה שליליא להוסיף 2.5 או 10 μl של כל RNA מבחן ודילול בקרה שלילי על הצינורות המקביל עבור 25 או 100 ריכוזים סופיים ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור assay כדאיות התא, להכין 5 מיקרומטר דילולים של RNAs הבדיקה דילול 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של RNA בקרה חיובית, משקל מולקולרי נמוך אני פוליפוני: C. הוסף 2 μl של רנ&quot;א בדיקה או דילולי RNA הבקרה חיוביים על הצינורות המתאימים עבור 100 ננומטר או 200 ריכוזים סופיים מיקרוגרם / מיליליטר, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור assay ההפעלה החיסוני, להוסיף 20 μl של רנ&quot;א בדיקה או דילולי RNA בקרה חיוביים מוכנים בשלב 1.3.2. אל הצינורות המתאימים עבור 100 ננומטר או 200 מיקרוגרם / ריכוזיים סופי מיליליטר, בהתאמה. הערה: פלסמידים ביטוי RNA בדיקות, להכין 10 ng / דילולים μl במקום של 5 מיקרומטר דילולים של RNAs הבדיקה, מתן הסכומים הסופיים של 25 ו -100 ng עבור צעד 1.3.1. ו -100 ng לצעדים 1.3.2. ו 1.3.3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50, 25 או 75 μl של DMEM על צינור אחד transfection למוצרים ויראליuction, כדאיות התא מבחני ההפעלה החיסונית, בהתאמה. מבחני ההפקה ויראלי, להביא תאים וצינורות transfection מוכן מעבדה ביו בטיחות ברמה 3 (BSL3) לפני השלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של ברצף מגיב transfection אל צינורות transfection דגירה 15 עד 20 דקות, כדי לאפשר מתחמי הטופס. ראה הטבלה של חומרים עבור מגיב transfection הספציפי כדי לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תערובת transfection כולו מהצינור כל מיקרו-חכם ירידה לעמדות המקביל צלחות תרבית תאים. מערבולת בעדינות דגירה הצלחות במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ייצור HIV-1 (סעיף 2), כדאיות התא (סעיף 3) והפעלה החיסונית (סעיף 4) ב צלחות תרבית תאים (איור 2 ג). </li></ol> 2. Assay הפקה ויראלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחות תרבית תאי 24 גם מן החממה בעדינות מערבולת הצלחות בתוך תרבית תאי BSL3מכסה מנוע. עבר 150 μl של supernatant מכל טוב על תואמים היטב צלחת תחתית שטוחה 96-היטב, אשר תשמש לכמת ייצור HIV-1. הערה: מבחני כימות ויראלי נפוצות כוללות מדידת ביטוי של חלבון קפסיד HIV-1 (p24) על ידי assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) 20, לכימות רנ&quot;א נגיפי על ידי RT-PCR (RT-PCR) 21 ומדידת פעילות של האנזים RT HIV-1. צעדים 2.2 ל 2.5 להסביר שיטות לכמת HIV-1 RT פעילות 13,15,16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 5 μl של supernatant כדי מקביל בארות בצלחת 96-היטב, המכיל 25 μl של קוקטייל שיבוש ויראלי 15 (טבלה 1). דגירה את התערובת במשך 5 דקות ב RT ולהעביר את הצלחת לתחנת עבודת רדיואקטיביות. הערה: שלב 2.2. יש צורך רק אם לא זמינה עבודת רדיואקטיביות היא במעבדת BSL3. אם הצלחות לא צריכות תיוסרנהמעבדת BSL3, המשך לשלב 2.3. ולהוסיף 50 μl של קוקטייל שיבוש רדיואקטיביים / ויראלי (טבלה 1) במקום 25 μl של קוקטייל רדיואקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן רדיואקטיבי קוקטייל 15 (1 טבלה), ולהוסיף 25 μl היטב כל supernatant ויראלי קוקטייל הפרעה. דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט 5 μl של תערובת התגובה על ריבועים מקבילים סיבי זכוכית Di אתיל אמינו אתיל (DEAE) נייר filtermat ולאפשר הכתמים להתייבש במשך 10 דקות. ספוט את תערובת התגובה על כל ריבוע אחר כך ששתי אין דגימות ישירות דייר אחד אחרת. זה עוזר למנוע מעל הכלאה בין דגימות בעת קביעת ספירת לדקה (CPM) בשלב 2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את העיתונים 5x במשך 5 דקות עם חיץ נתרן ציטרט מלוחים 2x (SSC) (טבלה 1), ואחריו שני שוטף 1 דקות עם אתנול 95%. אפשר בעיתונים להתייבש ולאטום אותם בשקיות מדגמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף שקיות מדגם קליפntaining נייר filtermat לתוך קלטת והכניס את הקלטת לתוך מונה נצנץ microplate. הגדר הדלפק לקרוא לדקה עבור 32 P עם התאריכים להשוואה סיפק עבור אצוות של [32 P] dTTP השתמשו בניסוי. בחר בו שימוש בדגימות לקרוא באמצעות מפת צלחת ולהתחיל הדלפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל שיטת כימות ויראלי, לחלק את הערכים שהתקבלו עבור כל RNA בדיקה על ידי הביקורת השלילית הסמוכה להכפיל ערך זה על ידי 100 כדי לקבל את עיכוב אחוז הייצור HIV-1 עבור כל לשכפל של RNAs הבדיקה. דוגמה לתוצאות השוואת RNAs מבדקים שונים בריכוזים שונים מסופק באיור 3. </li></ol> Assay כדאיות התא 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את 96-גם הצלחות מן החממה ולהוסיף 20 μl של 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​MTT (3- [4.5-דימתיל-2-thiazolyl] -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium ברומיד) מדולל בופר פוספט של Dulbecco ( DPBS) זה טוב. דגירת צלחות fאו 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 150 μl של isopropanol acidified עם חומר ניקוי (1% NP-40, 4 מ&quot;מ HCl ב isopropanol) זה טוב דגירה צלחות במשך שעה 2 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הספיגה ב 570 ננומטר ב ספקטרופוטומטר microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את חילוף חומרי MTT ביחס לכל RNA מלא בדיקה חיובי על ידי חלוקת הערך המתקבל עבור כל דגימה על ידי שליטת transfection הסמוכה לה. דוגמא לתוצאות השוואת RNAs מבחן שונה כביקורת חיובית מסופקת באיור 4. </li></ol> 4. Assay ההפעלה החיסונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את 12 גם הצלחות מן החממה לשאוב את התקשורת והתרבות. לשטוף בעדינות את התאים פעמיים עם DPBS ולהוסיף 70 μl של חיץ תמוגה קר 22 (כולל מעכבי פרוטאז ו phosphatase, טבלה 1) זה טוב. דגירת הצלחות עבור 10 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבר lysates תא צינורות המייקר ומהר להקפיא אותם על ידי טבילהצינורות בחנקן נוזלי. אפשר הדגימות להפשיר וחזרו על 2 יותר מחזור הפשרת הקפאה עבור סכום כולל של 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysates במשך 15 דקות ב 4 ° C, 15,700 XG, כדי גלולה פסולת התא. מעבירים את supernatant צינורות מיקרו חדש ולקבוע את ריכוז החלבון באמצעות כחול Coomassie (ברדפורד) שיטה 23,24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתור 75 מיקרוגרם של חלבון מכל מדגם ב ג&#39;ל polyacrylamide denaturing 10% ולהעביר אל קרום nitrocellulose כפי שתואר לעיל 25,26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות אלקטרופורזה ולהעביר קרום, לחשוף להקות חלבון על ידי דוגרי קרום Ponceau S (לוח 1) 1 דקות ואחריו כביסה במים מזוקקים פעמים. השתמש להקות סולם חלבון כמדריך לחתוך את הממברנה 80 ו -55 kDa. הערה: בשלב 4.4 דגימות ניתן להריץ על 16 x 18 ס&quot;מ 2 ג&#39;לים עד 34 kDa, כך שזה קל לחתוך את הקרום על העמדות שצוינו ולא לחתוך דרךלהקות של עניין. לחלופין, כמה ג&#39;לים ניתן להפיק דגימות אותו כדי למנוע חיתוך הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף היטב את מכתים Ponceau S עם מי מלח שנאגרו טריס המכיל 0.05% Tween 20 (TBST, טבלה 1). להוסיף TBST עם 5% חלב דל שומן על מנת לכסות את הקרום לחלוטין. דגירה ממברנות ב RT עם תסיסה במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ממברנות O / N ב TBST עם אלבומין בסרום שור 3% (BSA) ונוגדנים מדולל ל -1 מכל 1,000 נגד ADAR1 (110 ו -150 KDA), phospho-PKR (62 KDA), ו phospho-IRF3 (47 KDA), עבור החלקים העליונים, אמצעיים ותחתונים של הממברנה, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את ממברנות 5x במשך 5 דקות עם TBST ו דגירה ב TBST עם חלב 5% דל שומן ו נוגדנים משני נגד ארנב עז שכותרתו peroxidase (מדולל ל 1 ב 5000) במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את 5x ממברנות במשך 5 דקות עם TBST ולהחיל electrochemiluminescence פתרון (ECL) כדי להמחיש את הלהקות על סרטים על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לדמיין את להקות חלבון על סרטים, לשטוף את החלקים באמצע ההר ובתחתית הממברנה במשך 10 דקות עם פתרון הפשטת נוגדן. הדגירה ממברנות O / N ב TBST עם 3% BSA ונוגדנים נגד PKR הכולל (ב 1 ב 500) ו IRF3 (ב -1 מכל 1,000), עבור באמצע והחתיכות תחתונות, בהתאמה. חזור על שלבים 4.8. ו -4.9. באמצעות העכבר אנטי-עז שכותרתו peroxidase במקום של נוגדנים משני נגד ארנב עבור קרום PKR (באמצע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הפיסה התחתונה של 5x הקרום למשך 5 דקות עם TBST ו דגירת הממברנה ב TBST עם BSA 3% במשך שעה 1 עם נוגדן נגד אקטין (מדולל ל 1 ב 5000). חזור על שלבים 4.8. ו -4.9. באמצעות עכבר אנטי-עז שכותרתו peroxidase במקום של נוגדנים משני נגד הארנב. דוגמא לתוצאות השוואת RNAs מבחן שונה כביקורת חיובית מסופקת באיור 5. ראה הטבלה של חומרים עבור הנוגדנים הספציפיים כדי לשמש. </li></ol>

<ol>
	<li>Hoxie, J. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+and+gene+therapies+for+HIV.">Novel cell and gene therapies for HIV.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179 (2012).</li><li>Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+approaches+for+treatment+of+HIV-1+infection.">RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection.</a> Genome Med. 7, 50 (2015).</li><li>Allers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+cure+of+HIV+infection+by+CCR5Delta32/Delta32+stem+cell+transplantation.">Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation.</a> Blood. 117, 2791-2799 (2011).</li><li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+hematopoietic+stem+cell+based+gene+therapy+for+HIV-1+infection:+considerations+for+proof+of+concept+studies+and+translation+to+standard+medical+practice.">Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice.</a> Viruses. 5, 2898-2919 (2013).</li><li>Burke, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Cellular+Resistance+to+HIV-1+Infection+In+Vivo+Using+a+Dual+Therapeutic+Lentiviral+Vector.">Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236 (2015).</li><li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-based+gene+therapy+for+HIV+with+lentiviral+vector-modified+CD34(+)+cells+in+patients+undergoing+transplantation+for+AIDS-related+lymphoma.">RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma.</a> Sci Transl Med. 2, 36ra43 (2010).</li><li>Scarborough, R. J., Gatignol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+Ribozymes.">HIV and Ribozymes.</a> Adv Exp Med Biol. 848, 97-116 (2015).</li><li>Eekels, J. J., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+durable+treatment+of+HIV-1+infection+using+RNA+interference.">Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).</li><li>Blazquez, L., Fortes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+interference+(U1i)+for+Antiviral+Approaches.">U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches.</a> Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).</li><li>McIntyre, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=96+shRNAs+designed+for+maximal+coverage+of+HIV-1+variants.">96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants.</a> Retrovirology. 6, 55 (2009).</li><li>Sajic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+modified+U1+snRNAs+to+inhibit+HIV-1+replication.">Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication.</a> Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).</li><li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHAPE-directed+discovery+of+potent+shRNA+inhibitors+of+HIV-1.">SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1.</a> Mol Ther. 20, 820-828 (2012).</li><li>Scarborough, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Conserved+Target+Site+in+HIV-1+Gag+RNA+is+Accessible+to+Inhibition+by+Both+an+HDV+Ribozyme+and+a+Short+Hairpin+RNA.">A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178 (2014).</li><li>Lain&#233;, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+cleavage+of+HIV-1+RNA+by+new+SOFA-HDV+ribozymes+and+their+potential+to+inhibit+viral+replication.">In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication.</a> RNA Biol. 8, 343-353 (2011).</li><li>Scarborough, R. J., L&#233;vesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Evaluation+of+Clinically+Relevant+SOFA-HDV+Ribozymes+Targeting+HIV+RNA.">Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA.</a> Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).</li><li>Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+Inhibition+of+HIV-1+Production+by+Short+Hairpin+RNAs+and+Small+Interfering+RNAs+Targeting+a+Highly+Conserved+Site+in+HIV-1+Gag+RNA+Is+Optimized+by+Evaluating+Alternative+Length+Formats.">Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).</li><li>Sarzotti-Kelsoe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+validation+of+the+TZM-bl+assay+for+standardized+assessments+of+neutralizing+antibodies+against+HIV-1.">Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1.</a> J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).</li><li>Campos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+lasting+control+of+viral+rebound+with+a+new+drug+ABX464+targeting+Rev+-+mediated+viral+RNA+biogenesis.">Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev - mediated viral RNA biogenesis.</a> Retrovirology. 12, 1-15 (2015).</li><li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas9+system+inactivates+latent+HIV-1+proviral+DNA.">The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA.</a> Retrovirology. 12, 22 (2015).</li><li>Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+host+ICAM-1+in+laboratory+and+clinical+strains+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+increases+virus+infectivity+and+CD4(+)-T-cell+depletion+in+human+lymphoid+tissue,+a+major+site+of+replication+in+vivo.">Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo.</a> J Virol. 76, 1004-1014 (2002).</li><li>Shan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+PCR+assay+for+quantification+of+HIV-1+RNA.">A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA.</a> J Virol. 87, 6521-6525 (2013).</li><li>Clerzius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PKR+activator,+PACT,+becomes+a+PKR+inhibitor+during+HIV-1+replication.">The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication.</a> Retrovirology. 10, 96 (2013).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein.">Quantitation of protein.</a> Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li><li>Battisti, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additive+activity+between+the+trans-activation+response+RNA-binding+protein,+TRBP2,+and+cyclin+T1+on+HIV+type+1+expression+and+viral+production+in+murine+cells.">Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).</li><li>Bannwarth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+regulation+of+TRBP1+promoter+by+NF-Y+transcription+factor+in+lymphocytes+and+astrocytes.">Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes.</a> J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).</li><li>Clerzius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+interacts+with+PKR+during+human+immunodeficiency+virus+infection+of+lymphocytes+and+contributes+to+viral+replication.">ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication.</a> J Virol. 83, 10119-10128 (2009).</li><li>Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+translation+and+its+regulation+by+cellular+factors+PKR+and+PACT.">HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT.</a> Virus Res. 193, 65-77 (2014).</li><li>ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+HIV-1+with+RNA+interference:+a+multiple+shRNA+approach.">Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach.</a> Mol Ther. 14, 883-892 (2006).</li><li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+design+and+validation+of+antiviral+siRNA+for+targeting+HIV-1.">Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 80 (2007).</li><li>Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+RNA+splicing+and+inhibition+of+HIV-1+replication+induced+by+modified+U1+small+nuclear+RNAs.">Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs.</a> J Virol. 84, 12790-12800 (2010).</li><li>Chang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+expression+and+HIV-1+inhibition+of+chimeric+tRNA(Lys3)-ribozymes+under+dual+U6+snRNA+and+tRNA+promoters.">Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters.</a> Mol Ther. 6, 481-489 (2002).</li><li>Chang, L. J., Liu, X., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+siRNAs+targeting+multiple+highly+conserved+RNA+sequences+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1.</a> Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).</li><li>Daniels, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+RRE+RNA+acts+as+an+RNA+silencing+suppressor+by+competing+with+TRBP-bound+siRNAs.">HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs.</a> RNA Biol. 12, 123-135 (2015).</li><li>Castanotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+delivery+of+small+interfering+RNAs+reduces+RNAi+efficacy+by+selective+incorporation+into+RISC.">Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC.</a> Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).</li><li>Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+adaptors+result+in+reduction+of+multiple+pre-mRNA+species+principally+by+sequestering+U1snRNP.">U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP.</a> Nucleic Acids Res. 39, e71 (2011).</li><li>Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Viral+Entry+Assays+for+the+Identification+and+Evaluation+of+Antiviral+Compounds.">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Riss, T. L., et al., Sittampalam, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Guidance Manual. , (2004).</li><li>Reynolds, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+interferon+response+by+siRNA+is+cell+type-+and+duplex+length-dependent.">Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent.</a> Rna. 12, 988-993 (2006).</li><li>Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+or+stimulation?+siRNA+delivery+and+the+immune+system.">Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system.</a> Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

את assay ייצור HIV-1 תיאר בוצעה באמצעות תאים HEK293T (איור 2), והוא דומה מבחני לשמש מסך HIV-1 RNA עבור ribozyme שנכנס לתוקף ב -13, shRNA 10,29, siRNA 30, ו U1i RNA 11,31 אתרי היעד. באמצעות שיטות שונות כדי לכמת ייצור HIV-1, רוב המחקרים מדדו ייצור ויראלי 48 שעות לאחר שיתוף transfecti...

הגבלה של טיפולי HIV-1 הנוכחיים היא שהם צריכים להתנהל באופן כרוני כדי למנוע התקדמות מחלה. להשתלות של HIV-1 עמיד לימפוציטים T, או תאי גזע hematopoietic, יש את הפוטנציאל לספק בקרה לטווח ארוך של שכפול HIV-1 בהעדר טיפול תרופתי 1,2 ויכול גם להיות גישה יעילה להשיג תרופה HIV-1 3. דרך אחת להפוך תאים עמידים שכפול HIV-1 היא להכניס גנים אחד או יותר קידוד עבור אנטי HIV-1 RNAs או פפטידים לתוך התאים של אדם שנדבק במהלך השתלה עצמית 4. כמה המועמד גנים אנטי HIV-1 עוצבו עם כמה ניסויים קליניים נכנסים שילובים של שני 5 או שלוש 6, כדי למנוע התפתחות של עמידות HIV-1 לכל גן יחיד. RNAs-1 נגד HIV הוא בין המועמדים הבולטים עבור ריפוי גנטי שילוב בשל הפוטנציאל הנמוך שלהם לעורר תגובה חיסונית ובגלל שהםמשועתק מתוך רצפי גנים מאוד קצרים. חלק RNAs נגד HIV-1 עוצב למקד כניסה ושילוב ויראלי. עם זאת, רוב RNAs נגד HIV-1 למקד צעדים שלאחר אינטגרציה במחזור החיים של הנגיף (איור 1). מעכבי פוסט אינטגרציה כוללים RNAs דמה, מיקוד חלבונים רגולטוריים HIV-1 טאט או Rev 1, ו RNAs מבוססי antisense, מיקוד אתרים שונים HIV-1 RNA, כגון ribozymes 7, shRNAs 8 ו U1i 9 RNAs. שיטות שנוצלו כדי להשוות את היעילות של RNAs נגד HIV-1 כוללות ניטור שכפולה נגיפית בתאי transduced עם גני מקודדי RNAs מועמד למדידת ייצור נגיפי בתאי transfected זמני עם פלסמידים להביע RNAs מועמד פלסמיד ביטוי HIV-1 10 -13. השתמשנו בעבר assay ייצור HIV-1 להקרין HIV-1 RNA עבור אתרי היעד ribozyme חדש 13-15. שיטות אלה שוכללו מאז כדי לייעל את הפורמט של RNAמולקולת פרעות הביעה מ- DNA פלסמיד כקובץ shRNA או נמסרה בתור siRNA סינטטי 16. את assay מודד את הייצור של וירוסים בוגרים מן הכליות עובריות אנושיים (HEK) תאי 293T, וניתן להשתמש בו כדי להשוות את ההשפעות של מעכבים כי למקד צעדים שלאחר אינטגרציה במחזור שהכפול HIV-1 (איור 1). עבור מעכבים כי למקד צעדים מראש אינטגרציה, מבחנים חלופיים כגון assay infectivity תא TZM-bl 17 נדרשים להעריך יעילות אנטי. חששות בטיחות סרן עבור המשלוח של אנטי HIV-1 RNAs במרפאת כוללים השפעות חוץ-היעד פוטנציאליות על RNAs אדם או חלבונים, והפעלה של חיישני חיסון מולדים. כדי להעריך את הרעילות של siRNAs נגד HIV-1, השתמשנו assay כדאיות התא שורות תאים שונות 16. כמו כן, אנו נמדדים הפעלה של החיישנים החיסוניים גדילי RNA הכפולים, R פרוטאין קינאז מופעל RNA (PKR) ו אגרה כמו 3 קולטן (TLR3), כמו גם לשעברpression של אינטרפרון מגורה גן, p150 ADAR1. מבחנים אלה יכולים לשמש כדי לאשר את היעילות של RNAs נגד HIV-1 הוא לא בשל השפעות עקיפות על כדאיויות תא או הפעלת חיישן חיסונית. הם גם שימושי למעט RNAs מועמד עם רעילות פוטנציאל להתפתח הלאה. ב הפרוטוקולים הבאים, נהלים לזהות RNAs הטיפולית חדשות ולבצע אופטימיזציה של הפורמט של התנחלויות קיימות מתואר. השיטות שימושיות מעכבי אינטגרציה שלאחר מבוסס RNA הקרנת שכפול HIV-1 יכולות להיות מותאמות למסך מעכבים שלאחר אינטגרציה אחרות, כגון מולקולות קטנות מיקוד יצוא Rev בתיווך של רנ&quot;א הנגיפי 18 או CRISPR / מערכות קאש שנועדו למקד משולבות HIV-1 DNA 19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM HyClone</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS HyClone</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin Gibco</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well.</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353075, 353047, 353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes Axygen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>311-08-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low molecular weight Poly I:C</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>3182-29-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DharmaFECT-1</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>T-2001-01</td>
			<td>transfection reagent for synthetic RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-LT1</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td>transfection reagent for RNA expression plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 (NP-40)</td>
			<td>USB</td>
			<td>19628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[32P]dTTP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>BLU505H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(A) RNA template&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10108626001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo(dT)12-18 DNA primer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>18418-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEAE filtermat paper&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1450-522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate scintillation counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1450-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS HyClone</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate spectrophotometer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1706930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001, 4906837001</td>
			<td>protease and phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel running chamber</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-dry transfer cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein ladder EZ-Run</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP3603-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>162-0094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody stripping solution</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL - Pierce</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>PI32106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADAR1 antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from Dr. B.L. Bass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phospho-T446-PKR antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phospho-S396-IRF3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKR antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from Dr. A. Hovanessian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRF3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>11904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-labeled goat anti-rabbit</td>
			<td>KPL</td>
			<td>474-1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-labeled goat anti-mouse</td>
			<td>KPL</td>
			<td>474-1806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6226-79-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the efficacy and toxicity of rnas targeting hiv-1 production for use in gene or drug therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

סכימטי הכללי של הנהלים מוצג באיור 2 עם תכנית transfection לדוגמה עבור שלושה RNAs ניסיוניים RNA מלא מסופק באיור 2B. עבור מבחני כדאיות התא ייצור ויראליות, מחוץ לקרוא לכל מבנה המבחן מנורמל כביקורת שלילית. משכפל הם transfected בסטים, כך שכל RNA המבחן מנו...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy at JoVE.com

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

evaluation-efficacy-toxicity-rnas-targeting-hiv-1-production-for-use

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.8K Views.  Lady Davis Institute for Medical Research. Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones. 

Video: Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

הגברה וכימות HIV-1 RNA אצל אנשים שנדבקו ב-HIV עם המון ויראלי מתחת לגבול של זיהוי על ידי מבחני קלינית רגילה

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

ב Uncoating במבחנה של HIV-1 ליבות

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

הערכת קונפורמציה של HIV-1 trimeric מעטפת גליקופרוטאינים שימוש ELISA Assay מבוסס Cell

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

בידוד של Exosomes מהפלזמה של HIV-1 אנשים חיוביים

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות האינטגרציה של HIV-1 Preintegration מכלולים

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response without any interference such as low protein expression, enzyme inactivity, or structural changes. This makes APN an attractive candidate in the development of vaccines that selectively target the mucosal epithelium. Previous studies have shown that APN is a receptor protein for both enterotoxigenic Escherichia coli (E. coli) F4 and transmissible gastroenteritis virus. Thus, APN shows promise in the development of antibody-drug conjugates or novel vaccines based on APN-specific antibodies. In this study, we compared production of APN-specific monoclonal antibodies (mAbs) using traditional hybridoma technology and recombinant antibody expression method. We also established a stably transfected Chinese hamster ovary (CHO) cell line using pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN and an E. coli expression BL21(DE3) strain harboring the pET28a (+)-rAbs-APN vector. The results show that antibodies expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and mAbs produced using hybridomas could recognize and bind to the APN protein. This provides the basis for further elucidation of the APN receptor function for the development of therapeutics targeting different APN-specific epitopes.

The recombinant antibody protein expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and monoclonal antibodies produced using traditional hybridoma technology can recognize and bind to the porcine aminopeptidase N (APN) protein.

ייצור נוגדנים חד-שבטיים המכוונים לאמינופפטידאז N באפיתל רירית המעי החזירי

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג'ין או טיפול תרופתי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video