This research was supported by a team grant from Movember/Prostate Cancer Canada to JMSB, DMB, PCP, and JL, and by the Ontario Institute of Cancer Research (JMSB, DMB, and PCP) and Motorcycle Ride for Dad Kingston/University Hospitals Kingston Foundation/Kingston General Hospital (DMB, PCP).

1. רקמות חציבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את השקופית מיקרוסקופ ולהתוות את האזור (ים) של עניין באמצעות סמן קבע קנס נקודות. לגזור קטע סרט פרפין גדול מספיק כדי לכסות את האזור של עניין בשקופית מיקרוסקופ. מניחים סרט בתקיפות בשקופית ועוטפים הסרט מעל לקצוות כדי לשמור את הסרט מפני החלקה. באמצעות סמן קבע קנס נקודות, להתוות את הרקמה כולה ובאזור (ים) של עניין בתוך הרקמה, שמירה על הנגיעה המתארת ​​- אבל מחוץ - באזור (הים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסרט ולהעביר אותו לבלוק רקמות המקביל. אוריינט סרטם של מרפרף או סיבובו כך את קווי המתאר של הרקמה כולה תואם את הצורה הנצפית של הרקמה בבלוק (איור 1). לחץ על קטע סרט בתקיפות אל פני השטח של הבלוק כדי למנוע החלקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משתמש הקצה של בטוש בלתי מחיק, להפוך רדודים אך גלויים (~ 0.2 מ&quot;מ) חריצים לאורך הקו המתאר של האזור (ים) של בterest, ולאחר מכן הסר את הסרט. טען 1 מ&quot;ל של אקונומיקה, 70% אתנול, ומים לתוך צינורות מ&quot;ל microcentrifuge 1.5 או 2.0 נפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את אגרוף קולטן (אדום) מן האגרוף 0.6 מ&quot;מ שקבע החלקת האגרוף מעלה ומטה מספר פעמים בעוד טיפ הוא שקוע לתוך האקונומיקה המכיל צינור. חזור על השלב מעל עם 70% אתנול ואז מים (קריטי כדי להבטיח אקונומיקה כי מוסר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצו על אגרוף לתוך הרקמה, בתוך אזור של אינטרס עד לעומק של 3 מ&quot;מ ו למשוך את האגרוף. שחרר את הליבה לתוך נמוך מחייב צינור מיליליטר 1.5 או 2 על ידי דחיפתו אל מחוץ האגרוף עם העט. אחסן את הליבות ב -20 ° C (לטווח ארוך) או 4 ° C לשימוש לטווח קצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את האגרוף על פי צעד 1.4 ולהמשיך עם האזורים או המדגם הבאים. </li></ol> 2. Deparaffinize ליבות רקמות FFPE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Carryout deparaffinization ב 1.5 או 2 צינורות מ&quot;ל ידי הוספת קסילן 1 מ&quot;ל עד היסוד רקמות vortexing במרץ למשך 10 שניות. heat 3 דקות ב 50 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ומהירות מרבית (21,130 XG) צינור ומניחים על קרח למשך 5 דקות (מאפשר משקע שעוותי לגבש על החלק העליון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות פרפין שנצברו סביב המניסקוס עם supernatant באמצעות קצה פיפטה וחזור טיפול קסילן (שלבים 2.1-2.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של אתנול (100%) ו מערבולת במרץ למשך 10 שניות. צנטריפוגות במשך 2 דקות ב RT (מהירות מרבית), ובזהירות להתעלמות אתנול. חזור על השלב הנ&quot;ל פעם. </li></ol> 3. המגון של ליבות Deparaffinized <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ליבות 700 μl של אתנול (100%) לפני המגון. באמצעות homogenizer רקמות ממונע, לטחון את הליבות לחלקיקי רקמות קנס (~ 1 דק &#39;על הגדרה בינונית). נקו את החללית homogenizer בין כל דגימה כדי למזער לשאת על זיהום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו 15 מ&quot;ל צינורות עם ~ 10 מ&quot;ל של אקונומיקה, פתרון נטרול RNase ואתנול 70%. לאחר הומו המדגםgenization, לשטוף את החללית homogenizer בכל אחד הפתרונות ניקוי בסדר כאמור לעיל. הפעל את homogenizer על המהירות הגבוהה ביותר בשלב הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את החללית עם רקמה ולאפשר בדיקה להתייבש לחלוטין לפני שמאחד את המדגם הבא. ראייה לבדוק את להבי בדיקה עבור פיסות רקמה שיורית. אם נמצא, לנקות את החללית שוב. שנה את פתרונות ניקוי (אקונומיקה, אתנול, והפתרון מנטרל RNase) יומי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות המגון, להביא את נפח דגימה עד 1 מ&quot;ל על ידי הוספת אתנול 100% יותר (~ 300 μl). צנטריפוגה במהירות המרבית למשך 15 דקות, בזהירות לשאוב אתנול גלולה אוויר יבש למשך כ 15-20 דקות לפני שאתה ממשיך עם מיצוי RNA. </li></ol> 4. עיכול עם proteinase K <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 150 μl proteinase K עיכול הצפת צינור קפיצי לשחרר את הכדור. הוסף 10 μl של K proteinase טמפרטורה יציבה ומערבבים ידי מצליף (לאמערבולת הצינור). דגירת התוכן בצינור ב 56 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר צינור כדי לדגור על קרח למשך 3 דקות. קירור שלם חשוב ממטרים יעילים בשלב הבא. צנטריפוגה במשך 15 דקות במהירות מרבית. </li></ol> 5. RNA נפרד מ- DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את supernatant, מבלי להפריע גלולה, על 1.5 מ&quot;ל חדש לטיהור RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור גלולה עבור טיהור DNA (גלולה יכול להיות מאוחסן במשך שעה 2 ב RT, עד 1 יום ב 2-8 מעלות צלזיוס, או לפרקי זמן ארוכים יותר ב -20 ° C). </li></ol> 6. RNA טיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת supernatant המכיל RNA על 80 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות (לא תעלה הפעם). לאחר מכן, בקצרה צנטריפוגות צינור לאסוף טיפות מן הפנימי של המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 320 μl הצפת RLT להתאים תנאים מחייבים, ומערבבים על ידי pipetting. לאחר מכן, להוסיף 720 אתנול μl (100%), ו מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 600 μl של המדגם, לרבות כל משקע שאולי נוצר, לעמודת ספין RNA (מסופקת בערכה) להציב צינור איסוף 2 מיליליטר ומניח בצד התוכן הנותר. צנטריפוגה במשך 15 שניות ≥8,000 XG, להשליך את הזרימה דרך שימוש חוזר צינור איסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת יתרת מדגם על טור, כולל טיפות שעשויות צברו במכסה של הצינור, צנטריפוגות במשך 15 שניות ≥8,000 XG, וזורקת את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 350 μl הצפת FRN לעמודה ספין צנטריפוגות במשך 15 שניות ב ≥8,000 XG, להשליך את הזרימה דרך ושימוש חוזר צינור איסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות מערבבים 10 μl DNase אני פתרון מניות עם 70 μl הצפת RDD, להוסיף ישירות הממברנה טור ספין, לדגור על RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl מאגר FRN לעמודה ספין, צנטריפוגות במשך 15 שניות ≥8,000 XG ולשמור את הזרימה דרך לשימוש בשלב הבא. כדי לשפר את ההתאוששות של RNA הקטן, מניח את טור הספין בתוך<html> 2 מ&quot;ל חדש צינור איסוף ולהחיל את הזרימה דרך מהשלב הקודם לעמודה ספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 15 שניות ≥8,000 XG, להשליך את הזרימה דרך שימוש חוזר צינור איסוף בשלב הבא. הוסף 500 μl הצפת הרשתית לעמודה ספין צנטריפוגות במשך 15 שניות ב ≥8,000 XG, להשליך את הזרימה דרך שימוש חוזר צינור איסוף בשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl הצפת רשתית לעמודת הספין צנטריפוגות במשך 15 שניות ב ≥8,000 XG וזורק את צינור האיסוף עם זרימת הדרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את טור ספין צינור איסוף חדש 2 מיליליטר, פותח את המכסה צנטריפוגות במהירות מרבית למשך 5 דקות. מחק את צינור האיסוף עם זרימת הדרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הטור ספין אוסף חדש 1.5 מ&quot;ל, להוסיף 20 μl של RNase ללא מים ישירות על גבי הממברנה טור ספין, דגירה הצינור דקות 1 ב RT. צנטריפוגה במהירות המרבית למשך 1 דקות כדי elute רנ&quot;א. חנות מדגם RNA eluted ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol>ילדה = &quot;jove_title&quot;&gt; 7. טיהור DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה שהושגו במהלך החילוץ RNA על ידי תוספת בשלבים של 45 μl של חיץ proteinase K (400 מ&quot;מ טריס 7.5, 400 מ&quot;מ NaCl, 3 מ&quot;מ MgCl 2, 4% SDS); 45 μl H 2 O; ו -400 מיקרוגרם של עוצמה גבוהה proteinase ק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הפתרון הנ&quot;ל ב 56 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות (מומלץ) או הלילה. Performincubation ב 90 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ללא תסיסה בקצרה צנטריפוגות צינור microcentrifuge לאסוף טיפות מן הפנימי של המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר המדגם להתקרר RT ואז להוסיף 4 μl RNase A (100 מ&quot;ג / מ&quot;ל). דגירה המדגם למשך 2 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl מאגר AL המדגם, ומערבבים היטב על ידי vortexing. לאחר מכן, הוסף 200 μl של 100% אתנול, ומערבבים היטב על ידי vortexing. מעבירים את המדגם לעמודה ספין סיפק, מקום בצינור אוסף 2 מ&quot;ל, ו צנטריפוגות דקות 1 ב x ז ≥8,000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את צינור האיסוף עםהזרימה דרך למקם את טור ספין צינור איסוף חדש 2 מיליליטר. הוסף 700 μl מאגר AW1 לעמודה ספין, צנטריפוגות במשך 15 שניות ≥8,000 XG, להשליך את הזרימה דרך שימוש חוזר צינור איסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 700 μl מאגר AW2 לעמודה ספין, צנטריפוגות במשך 15 שניות ≥8,000 XG, להשליך את הזרימה דרך שימוש חוזר צינור איסוף. לאחר מכן, הוסף 700 μl של אתנול 100% לעמודת הספין, צנטריפוגות במשך 15 שניות ≥8,000 XG וזורק את צינור האיסוף עם זרימת הדרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את טור ספין צינור איסוף חדש 2 מיליליטר, פתח את המכסה של טור הספין, צנטריפוגות במלוא מהירות במשך 5 דקות. מחק את צינור האיסוף עם זרימת הדרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את טור ספין צינור 1.5 מיליליטר אוסף חדש ולהוסיף 25 μl מי nuclease חינם מחוממים (50 מעלות צלזיוס). דגירת עמודת צינור ב 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צנטריפוגה 1 דקות במהירות מרבית, להוסיף 25 μl מי nuclease חינם (RT) לעמודת דגירה1 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 1 דקות במהירות המרבית (21,130 XG) וקציר הזרימה דרך המכילים DNA הגנומי (כ 50 μl של ה- DNA בסך הכל). אחסן את הטור ב -20 ° C (במקרה elution אחר נדרש בהמשך). </li></ol>

<ol>
	<li>Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+your+new+cancer+biomarker+may+never+work:+recurrent+patterns+and+remarkable+diversity+in+biomarker+failures.">Why your new cancer biomarker may never work: recurrent patterns and remarkable diversity in biomarker failures.</a> Cancer Res. 72 (23), 6097-6101 (2012).</li><li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T. A., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excavation+of+a+buried+treasure--DNA,+mRNA,+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed,+paraffin+embedded+tissues.">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26 (6), 797-810 (2011).</li><li>Beltran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Next-generation+Sequencing+of+Advanced+Prostate+Cancer+Identifies+Potential+Therapeutic+Targets+and+Disease+Heterogeneity.">Targeted Next-generation Sequencing of Advanced Prostate Cancer Identifies Potential Therapeutic Targets and Disease Heterogeneity.</a> Eur. Urol. 63 (5), 920-926 (2013).</li><li>Hoppin, J. A., Tolbert, P. E., Taylor, J. A., Schroeder, J. C., Holly, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+selection+bias+with+tumor+tissue+retrieval+in+molecular+epidemiology+studies.">Potential for selection bias with tumor tissue retrieval in molecular epidemiology studies.</a> Ann. Epidemiol. 12 (1), 1-6 (2002).</li><li>von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+quality+from+FFPE+samples.">Determinants of RNA quality from FFPE samples.</a> PLOS ONE. 2 (12), e1261 (2007).</li><li>Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chemical+modification+of+RNA+from+formalin-fixed+samples+and+optimization+of+molecular+biology+applications+for+such+samples.">Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples.</a> Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).</li><li>Pikor, L. A., Enfield, K. S. S., Cameron, H., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+paraffin+embedded+material+for+genetic+and+epigenetic+analyses.">DNA extraction from paraffin embedded material for genetic and epigenetic analyses.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li><li>Turashvili, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+quantity+and+quality+from+paraffin+blocks:+defining+optimal+fixation,+processing+and+DNA/RNA+extraction+techniques.">Nucleic acid quantity and quality from paraffin blocks: defining optimal fixation, processing and DNA/RNA extraction techniques.</a> Exp. Mol. Pathol. 92 (1), 33-43 (2012).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nat. Protoc. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+laser+capture+microdissection+for+analysis+of+retinal+mRNA/miRNA+expression+and+DNA+methylation.">Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation.</a> Methods Mol. Biol. 884, 289-304 (2012).</li><li>Bonin, S., Stanta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+extraction+methods+from+fixed+and+paraffin-embedded+tissues+in+cancer+diagnostics.">Nucleic acid extraction methods from fixed and paraffin-embedded tissues in cancer diagnostics.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 13 (3), 271-282 (2013).</li><li>Bonin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicentre+validation+study+of+nucleic+acids+extraction+from+FFPE+tissues.">Multicentre validation study of nucleic acids extraction from FFPE tissues.</a> Virchows Archiv. 457 (3), 309-317 (2010).</li><li>Montaser-Kouhsari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided+Coring+for+Large-scale+Studies+in+Molecular+Pathology.">Image-guided Coring for Large-scale Studies in Molecular Pathology.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. , (2015).</li><li>van Eijk, R., Stevens, L., Morreau, H., van Wezel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+a+fully+automated+high-throughput+DNA+extraction+method+from+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue+for+KRAS,+and+BRAF+somatic+mutation+analysis.">Assessment of a fully automated high-throughput DNA extraction method from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue for KRAS, and BRAF somatic mutation analysis.</a> Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 121-125 (2013).</li><li>Ghatak, S., Sanga, Z., Pautu, J. L., Kumar, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coextraction+and+PCR+Based+Analysis+of+Nucleic+Acids+From+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Specimens.">Coextraction and PCR Based Analysis of Nucleic Acids From Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Specimens.</a> J. Clin. Lab. Anal. , (2014).</li><li>Hennig, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+extraction+of+DNA+and+RNA+from+a+single+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+section+for+analysis+of+both+single-nucleotide+polymorphisms+and+mRNA+expression.">Automated extraction of DNA and RNA from a single formalin-fixed paraffin-embedded tissue section for analysis of both single-nucleotide polymorphisms and mRNA expression.</a> Clin. Chem. 56 (12), 1845-1853 (2010).</li><li>Snow, A. N., Stence, A. A., Pruessner, J. A., Bossler, A. D., Ma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+cost-effective+method+of+DNA+extraction+from+small+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+molecular+oncologic+testing.">A simple and cost-effective method of DNA extraction from small formalin-fixed paraffin-embedded tissue for molecular oncologic testing.</a> BMC Clin. Pathol. 14 (1), 30 (2014).</li><li>Torrente, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+formalin-fixed+laryngeal+biopsies:+Comparison+of+techniques.">DNA extraction from formalin-fixed laryngeal biopsies: Comparison of techniques.</a> Acta Otolaryngol. 131 (3), 330-333 (2011).</li><li>Okello, J. B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+in+the+recovery+of+nucleic+acids+from+archival+formalin-fixed+paraffin-embedded+autopsy+tissues.">Comparison of methods in the recovery of nucleic acids from archival formalin-fixed paraffin-embedded autopsy tissues.</a> Anal. Bochem. 400 (1), 110-117 (2010).</li><li>Abramovitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+RNA+extraction+from+FFPE+tissues+for+expression+profiling+in+the+DASL+assay.">Optimization of RNA extraction from FFPE tissues for expression profiling in the DASL assay.</a> BioTechniques. 44 (3), 417-423 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook. , (2012).</li><li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meeting+report:+discussions+and+preliminary+findings+on+extracellular+RNA+measurement+methods+from+laboratories+in+the+NIH+Extracellular+RNA+Communication+Consortium.">Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium.</a> Journal of Extracell. Vesicles. 4, (2015).</li><li>. Methods of RNA Quality Assessment Available from: <a target="_blank" href="https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment">https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment</a> (2012)</li><li>Herman, J. G., Graff, J. R., Myohanen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation-specific+PCR:+a+novel+PCR+assay+for+methylation+status+of+CpG+islands.">Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (18), 9821-9826 (1996).</li><li>Weisenberger, D. J., Campan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+repetitive+element+DNA+methylation+by+MethyLight.">Analysis of repetitive element DNA methylation by MethyLight.</a> Nucleic acids research. 33 (21), 6823-6836 (2005).</li><li>Yegnasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypermethylation+of+CpG+Islands+in+Primary+and+Metastatic+Human+Prostate+Cancer.">Hypermethylation of CpG Islands in Primary and Metastatic Human Prostate Cancer.</a> Cancer Res. 64 (6), 1975-1986 (2004).</li><li>Parsons, M., Grabsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+tissue+microarrays.">How to make tissue microarrays.</a> Diagn. Histopathol. 15 (3), 142-150 (2009).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

עבור חילוץ מוצלח של DNA ו- RNA מאזורים רקמה של עניין, coring המדויק הוא קריטי. פרוטוקול זה מתאר את השימוש של אגרוף רקמות לבודד 0.6 מ&quot;מ ליבות בקוטר מתאר את התהליך להעברת סימונים מן מיקרוסקופ שקופיות המקביל בלוקים FFPET. עשיית שינויי הפרוטוקול של היצרן נדרשו לחלץ חומצות גרעין ביעילות ליבות, שהן כ 50 פעמים עבות יותר בסעיפי microtome עבורו הפרוטוקול נועד. מאז הליבות עשויות להכיל ביחס שעווה פרפין יותר סעיפי רקמות, deparaffinization היעיל של ליבות באמצעות צעדי טיפול קסילן ואתנול חזרו נדרשו. הצלחת השלבים שלאחר deparaffinization תלוי המגון ליבות רקמה מכנית מתאימה ועיכול K proteinase ביותר. אופטימיזציה נוספת של דרכי העיכול proteinase K יכול להתבצע. ראוי להזכיר כי זיהו שיטה זובאזורי fies עניין על פני השטח של הבלוק, כפי שהוגדרו מקביל שקופיות histopathology. כמו רקמת יבולי ליבה שעשויה להיות 3 או 4 מ&quot;מ עמוק, משתמשים של פרוטוקול זה יכול להיות מודאגים לגבי מה תאים או רקמות הנח מתחת לפני שטח הבלוק. אמנם זה דאגה מוצדקת, מחקרים רבים (הנסקרת תוך התייחסות 27) הוכיחו כי ליבות רקמות מייצגים נאמנה את היסטולוגית ותכונות המולקולרי של גושי רקמה פתולוגית, במיוחד כאשר ליבות כפולות או בשלושה עותקים נדגמים מאזור עניין. כמו ערכת החילוץ המסחרית השונה אמצה בפרוטוקול זה מאפשרת מיצוי במקביל של שני ה- DNA ו- RNA מאותו הרקמות, הפרוטוקול חוסך חומר ביולוגי יקר ומאפשר השוואה ישירה בין שתי חומצות גרעין נובע המדגם הזהה. מיצוי במקביל של רנ&quot;א ודנ&quot;א יצמצם דלדול עבודה ורקמות בחצי, ומאפשר ניתוח משולב מדויק של הגן expression, כמו גם תכונות אפיגנטיים וגנטיות מצויים בדנ&quot;א. מאז התשואות של שניהם RNA ו- DNA מן ליבות רקמות נציגים אלה בדרך כלל יעלו על 600 ו -300 ng, בהתאמה, ומכיוון שרוב רצף הדור הנוכחי PCR וליד יישומים בדרך כלל דורשים 10-100 ng, רוב הדגימות המטוהרות על ידי פרוטוקול זה אמור לספק מספיק חומר במשך כמה מבחנים במורד זרם. פרוטוקול זה הוכח להיות לשחזור פני מעבדות עצמאיות (Selvarajah et al., הכנה.). RNA מן בפרוטוקול זה היה באיכות מספקת עבור ניתוח ביטוי גנים או באמצעות RT-PCR או פלטפורמה multianalyte פופולרי, ו- DNA ביצע היטב מבחני PCR ספציפיים מתילציה. מחקרים עתידיים שמטרתם להעריך את התועלת של חומצות גרעין התאוששו רצף הדור הבא הם מוצדקים. לפיכך, מספר שינויים נעשו פרוטוקול זמין מסחרי, המיועד סעיפי FFPET דקים, טיוח זה מתאים FOr שיתוף החילוץ של RNA ו- DNA מ -0.6 מ&quot;מ ליבות FFPET. הפרוטוקול הפגין תשואות גבוהות באופן עקבי במדגם גדול של דגימות סרטן ערמונית במספר מוגבל של דגימות סרטן השד, המוח ושלפוחית ​​השתן. באופן כללי, הפרוטוקול אמור לאפשר למשתמשים לבצע ניתוחים ממוקדים מבוסס גנים של אוספים גדולים של רקמה היטב מבוארים. חשוב לציין כי הפרוטוקול מאפשר דגימה ממוקדת ויעילה של אזורים של עניין FFPET, ידות על מעט יחסית זמן, תשואות גבוהות מספיק עבור מרבית היישומים במורד הזרם.

מחקר ביו-מרקר הגנום מבקש לזהות וקושרת מולקולריים בצורה מדויקת ואמין לשקף מצב מחלה, ולעשות זאת בצורה שימושית קליני. 1 פיתוח ביומרקר מסתמך על ניתוח רטרוספקטיבי של דגימות רקמה היטב מבוארות. דגימות רקמה חולות ונורמליות מאוחסנות או כמו רקמה טריה קפוא ב biobanks המיוחד או כרקמת פרפין מוטבע פורמלין-קבוע (FFPET) בלוקים בארכיונים קליניים. רקמה טריה מוקפאת מאפשרת המיצוי של חומצות גרעין איכותית כבר בשימוש נרחב במחקרי גילוי סמן ביולוגי הגנומי. 2,3 עם זאת, פחות דגימות רקמה זמינות biobanks ולומדים רקמות כגון משלבת הטיה לכיוון של מדגמים גדולים, קטגוריות חריגות של מחלה, וחולים לראות במרכזים העוסקים עם יכולות יותר לרקמות בנק. 4 FFPET, לעומת זאת, היא שיטת אחסון ברירת המחדל עבור ברקמות אדם וחי חולות. בעוד בלוקים FFPET לשמור מ הסלולרorphology, מרכיבים סלולריים אחרים צולבים קישורי תהליך הקיבוע כדי חומצות גרעין. צולבי רנ&quot;א ודנ&quot;א הם השבה, אך רק מושפל, מאוד צורות מקוטעות. 5,6 עם זאת, אלה שברי ה- DNA ו- RNA ניתנים לניתוח על ידי מערך הולך וגדל של מבחנים, כוללים ביטוי mRNA, היפר-מתילציה DNA, וממוקדות רצף. 7,8 כדי לנצל הזדמנות זו בכמות הגדולה והמגוונת של FFPET הזמין עבור מחקר, יש צורך בפרוטוקול מיצוי יעיל ואמין. חלק גדול של מחקר סמן בתוך רקמות מתמקד סרטן. כמו סוגים אחרים של רקמה חולה, רקמת הסרטן לעתים קרובות מראה ההטרוגניות אזורים משמעותית בשימור תא סוג התא. מאז המחקר סמן ביולוגי מסתמך על היכולת לתאם מרכיבים של רקמה חולה עם תכונות מולקולריות, שלב קריטי של תהליך זה הוא הקצירה המדויקת של רקמות כי נשמרה היטב מועשרת עבור דisease נחקרת. בשנת FFPET, שתי טכניקות העשרה לעתים קרובות מנוצלים: microdissection ללכוד לייזר (LCM), חתך microtome. LCM מאפשר מאוד ממוקד קציר רקמות והוא יכול לשמש כדי לבודד ספציפי, סוגי תאים השתמרו היטב ברקמות הטרוגנית. 9,10 עם זאת, LCM דורש ציוד יקר זמן להחריד רב עבור מספר גדול של דגימות. חתך Microtome הוא תהליך בשימוש נרחב יותר שבו חלקים דקים נחתכים מבלוקים FFPET. 11,12 סעיפים Microtome לחתוך לעיתים קרובות כוללים רקמה הטרוגנית בשימור התא (למשל, לעומת נמקי השתמרו היטב) והרכב (למשל, סרטן לעומת parenchyma שפיר), ומכאן עלול להוביל המגון של תכונות מולקולריות נחקרו טוב בנפרד. לפיכך, יש צורך שיטת תפוקה גבוהה המעשיר עבור תאים של עניין. שיטה שלישית, בידוד של חומצות גרעין מ ליבות FFPET, מספקת העשרה זו, הוא מתאים throug הגבוההhput פרוטוקולים, ויש בו נעשה שימוש על ידי אחרים כדי לבודד RNA או DNA מן ליבות רקמות נפרדות. 7,13,14 מספר הפרוטוקולים שפורסמו לציין שיטות חילוץ חומצות גרעין מ FFPET (טבלה 1). עם זאת, פרוטוקולים בם רנ&quot;א ודנ&quot;א מופקים מאותו הרקמות ממוטבים עבור סעיפי רקמות microtome, אבל לא עבור ליבות רקמות. 15,16 באופן דומה, פרוטוקולים שפורסמו אשר מאפשרים להגדיל את סגוליות רקמה, בין אם באמצעות ליבות רקמות או microdissections שקופיות, נהלים להפקת DNA, אך לא RNA. 7,17 כאן, פרוטוקול אופטימיזציה עבור חילוץ כפול של שני ה- DNA ו- RNA מאותו ליבת הרקמות מודגמת. ליבות רקמות נקצרות על ידי החדרת microarray רקמות (TMA) אגרופים לתוך האזורים של עניין ממופה בלוקי FFPET. המיפוי מבוצע באמצעות סימון המיקרוסקופ שקופית עם עט סימון והעברת ביאור אל פני השטח של המקבילה FFPEבלוק T (איור 1). עבודה לפני שהובילה להתפתחות של פרוטוקול זה נערכה השוואה של מערכות שאיבת חומצה כמה זמינות גרעין מסחרי. לשם השוואה זו, שינויי פרוטוקולים מסחריים, כמפורט להלן ספקו את היבול ואיכות DNA ו- RNA הגבוהים ביותר (Selvarajah et al., הכנה). ליבות רקמות עבות יותר בסעיפי מיקרון 5-10 מיקרומטר משמשים בדרך כלל פרוטוקולי מיצוי FFPET 11,12,14,18 - 20, ועשוי להכיל כמויות משתנות יותר של פרפין. כדי לפצות על זה, deparaffinization הועצם על ידי חזרה על טיפולים קסילן ו אתנול על ידי החדרת צעד המגון ממונע (איור 1). יתר על כן, פעמים עיכול K proteinase היו התארך כדי להגדיל את התשואה DNA. בסך הכל, פרוטוקול זה הוא חסכוני ומאפשר הקמת קשרים בין תכונות מולקולריות histopathologic של מחל large, אוכלוסיות מאופיינות היטב. הפרוטוקול בשלמותו יכול להתבצע באופן מהימן בתוך 2 ימים, כולל 3 שעות של הידיים על הזמן, ללא צורך גדול עבור ציוד מיוחד או יקר. הצעד אחר צעד הפרוטוקול הוא להלן כגרסה שונה של הפרוטוקול של היצרן. 21 נא ראו טבלה של חומרים / ציוד עבור ריאגנטים ספציפיים, ציוד, ויצרנים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Plastic paraffin film, &#34;Parafilm &#39;M&#39;&#34;</td>
			<td style="width:217px;">Bemis&#160;</td>
			<td style="width:119px;">RK-06720-40</td>
			<td style="width:167px;">Any generic paraffin film will work as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Sodium Hypochlorite, &#34;Ultra Bleach&#34;</td>
			<td style="width:217px;">Likewise</td>
			<td style="width:119px;">53-2879-2</td>
			<td>Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Molecular biology grade absolute ethanol</td>
			<td style="width:217px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">BP2818-500</td>
			<td>Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Molecular Grade H2O</td>
			<td style="width:217px;">G-Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">786-293</td>
			<td>Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">0.6mm Punch Set for Beecher Instruments&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Estigen</td>
			<td style="width:119px;">MPO6[Yellow]</td>
			<td>Make sure to use the red receiver punch from the set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Fine point permanent marker</td>
			<td style="width:217px;">Sharpie</td>
			<td style="width:119px;">10365796S</td>
			<td>Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">FFPE tissue block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Stained tissue slide corresponding to FFPE block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">1.5 mL Micro-Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:217px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">05-408-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">2.0 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes)</td>
			<td style="width:217px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">1.5 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes)</td>
			<td style="width:217px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Histology Xylene</td>
			<td style="width:217px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">CA 95057-822</td>
			<td>Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Molecular Biology Grade 2-Propanol</td>
			<td style="width:217px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:283px;">AllPrep FFPE DNA/RNA Kit&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">80234</td>
			<td>Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">80234</td>
			<td>Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Temperature stable proteinase K</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">High potency proteinase K</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25530-049</td>
			<td>Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY)</td>
			<td style="width:217px;">Molecular BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">RNaseA 100mg/mL</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">19101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">BD Integra Syringe 3mL 21G x 1/2</td>
			<td style="width:217px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">305274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor)</td>
			<td style="width:217px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">9001271</td>
			<td>Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">-20&#176;C and -80&#176;C Laboratory Freezer &#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Micro-Centrifuge with rotor for 2mL tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Digital Vortex Mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Pipettes and filter tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Heating blocks or water baths</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Tris Hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Anhydrous Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:217px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:217px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Acrodisc 25mm syring filters with 0.45 um Supor membrane</td>
			<td style="width:217px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">PN 4614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3mL</td>
			<td style="width:217px;">BD Integra</td>
			<td style="width:119px;">305274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:217px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">3026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:283px;">Multianalyte gene expression platfrom (nCounter &#174; CAE codeset and Nanostring nCounter platform)</td>
			<td style="width:217px;">Nanostring nCounter platform, Nanostring</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:283px;">Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit&#174; RNA BR Assay Kit)</td>
			<td style="width:217px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue cores for both rna and dna extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

פרוטוקול זה מהווה שיטת אופטימיזציה עבור מחל DNA ו- RNA ליבות רקמות, באמצעות שינויים של מערכת הפקה מסחרית מיועדת סעיפי רקמות. אופטימיזציה כללה את כניסתה של הומוגניזציה רקמות, ניצול של K proteinase חזק יותר להפקת DNA, והארכת זמן עיכול רקמות. גרפי ניתוחים סטטיסטיים כלולים 2-way ANOVA, רגרסיה ליניארית וקורלציה. אופטימיזציות של עיכול proteinase ההערכה המסחרית כללה פתרון K proteinase היציב בטמפרטורת חדר אשר הוחלף עם K proteinase החזק יותר, וכתוצאה מכך תשואת DNA גבוהה יותר (איור 2 א). כדי להגביר עוד יותר את תשואות DNA, עיכול הוארך מעת 2 כדי 24 שעות. לא נמצא הבדלים משמעותיים נראו בין שתי נקודות הזמן, אבל לעיכול 24 השעות הופיע לספק תשואות עקביות יותר samples. עם זאת, דגירה נוספת ל -48 שעות לא לשפר עוד יותר את התאוששות DNA (איור 2B; p = 0.74). שחזור DNA אופייני של דגימות רקמת סרטן ערמונית FFPE באמצעות פרוטוקול מותאם, רנ&quot;א ודנ&quot;א היו שיתוף שחולצו מן דגימות FFPET סרטן הערמונית 333 הנעים בין 3 ל -14 שנות גיל מדגם. מכל מדגם, 3 ליבות רקמות (נפח רקמה כולל ממוצע של 0.95 ± 0.13 מ&quot;מ 3) שמשו כקלט. אמנם יש שיטות ג&#39;ל אלקטרופורזה אחרות המבוססות microfluidic שיכול להעריך ריכוזים ולספק הערכות של התפלגות הגודל של מולקולות חומצות גרעין, שיטות כאלה אינן מספקים כימות חומצות גרעין לשחזור, ולא ניתן להבחין בין רנ&quot;א ודנ&quot;א כמו לעשות מבחנים מבוססים flourometrically. 22 ו, כי תוצאות ג&#39;ל אלקטרופורזה מבוסס microfluidic אינן אמינות מקוטעחומצות גרעין נגזרות FFPET, 23 תשואות חומצות גרעין נמדדו fluorometrically (ראה רשימה מגיב לפרטים נוספים). התשואה הממוצעת היתה 2,270 ננוגרם של רנ&quot;א 820 ng של DNA (איור 3 א). כ 90% מכלל הדגימות FFPET ניתח במחקר זה הניב ≥100 ng של DNA ו- ≥ 500 ננוגרם של רנ&quot;א. מעניין לציין, כי לא נמצא קשר משמעותי בין גיל מדגם FFPET והתאוששות חומצות גרעין (איור 3 ב). בסך הכל, תשואות RNA ו- DNA היו בקורלציה ברחבי דגימות (R 2 = 0.39, p &lt;0.0001), אם כי יותר מכפליים RNA בהרבה DNA נמצא מכל מדגם (איור 3 ג). כאשר עבודת הטייס ואופטימיזציה בוצעה על רקמות ערמונית, הצעד הבא היה לבדוק את הביצועים של פרוטוקול זה על כמה סוגים נוספים של רקמת ארכיונים. החל הוסר בניתוח דגימות FFPET נתיחה מייצגת להיותכבד nign (1 מדגם מ -1 במקרה), סרטן המוח (8 דגימות מ -1 במקרה), שלפוחית ​​שתן (2 דגימות 2 מקרים), וסרטן השד (3 דגימות 3 מקרים), פרוטוקול ניב&gt; 100 ng של DNA ו- RNA 90% מהדגימות (איור 3D). בעוד תשואות חומצות גרעין היו נמוכות ברקמות נתיחה מאשר ברקמות כירורגית, תוצאות נציג עולות כי בפרוטוקול מייצר תשואות דומות ברחבי הסרטן נגזר מאתרים שונים. הערכת רנ&quot;א ודנ&quot;א Integrity וביצועים לנציגם ב ניתוח Downstream ניתוח ביטוי RNA של 47 גנים ב -8 דגימות סרטן ערמונית FFPET נבחרות מדגם שורת תאי סרטן ערמונית PC-3 טרי (כביקורת חיובית) בוצע באמצעות פלטפורמת ביטוי מסחרית multianalyte הגן כי הוא מותאם במיוחד FFPET. ספירת mRNA ב PC3 הייתה בדרך כלל גבוהה יותר מאשר אלו של FFPET samples (איור 4 א). עם זאת, השוואת הביטוי היחסי של כל הגנים, דגימות סרטן הערמונית FFPET הראה פרופילים ביטוי דומה RNA PC-3, בה צוין כי שני מקורות RNA מתאימים פרופיל ביטוי RNA. כדי להפגין ביצועים של הדנ&quot;א הגנומי חילוץ עם פרוטוקול זה, תמציות DNA-המרה bisulfite ממדגמים FFPET היו מוגבר על ידי מתילציה ספציפי PCR (MSP). 24 ניתוח MSP של אלמנטים חוזרים ALU, מפוגל מאוד אזורים הנוכחי במיליוני עותקים בגנום האנושי, 25 שמשו כביקורת מתילציה גנומית, וצפויים להראות וריאציות מינימאליות בין דגימות. כפי שניתן לראות בתרשים 4 ב &#39;, שם היה לא מעט על מנת וריאציה לראות בין מדגמים שונים ברמות מתילציה ALU MSP. יתר על כן, מבחני MSP מבוסס על GSTP1, בגן הידוע להיות hypermethylated בסרטן הערמונית אך לא בדגימות שפירות, 26 הראה שום ומחזקים לזיהויications ב דנ&quot;א מדגימות שפיר. כצפוי, ערכי סף מחזור qPCR נמוכים אותרו DNA מרקמות הסרטן, המציין העשרה של עותקי GSTP1 מפוגלים. השירות של חומצות גרעין התאוששו על ידי פרוטוקול זה נבדק נוסף מבחנים במורד זרם טיפוסיים, באמצעות חומצות גרעין התאוששו מכבד שפירים מתוך מוח (פוסט-מורטם) וממנה שתי דגימות בניתוח סרטן השד. שני מבחני RT-qPCR מבוסס הביטוי MSP בצורה טובה על סרטן השד והכבד FFPET, אך assay RT-PCR לא להגביר mRNA מבוטא בכמות גבוהה מן המדגם גידול במוח שלאחר המוות (4C איור), דבר המצביע על כך RNA צנחה, הנראה בשל קיבעון רקמות מתעכב. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54299/54299fig1.jpg" /> איור 1:. סקירה כללית של הליך ההפקה עבור דוגמאות FFPET הדמות מדגימה כיצד שטח של ענייןלחסום רקמות ממופות מבוסס על מבחר histopathologic של שקופית מיקרוסקופ. שלוש 0.6 ליבות רקמות מ&quot;מ מתקבלות ומכל אחד באזור רקמות באמצעות אגרופי ביופסיה, הומוגני יחד ולאחר מכן נתון חילוץ הן של RNA ו- DNA. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54299/54299fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54299/54299fig2.jpg" /> איור 2: חומצות גרעין (DNA ו- RNA) תשואות ng / מ&quot;מ 3 של FFPET משני proteinase K (טמפרטורה יציבה אנזימי עצמה גבוהות), ונבדק על פני טווח של דגירת טיימס עבור האחרית (א) ביצועים של proteinase K. בין ספקים שונים. עקירות DNA בוצעו על מדגם FFPET נציג באמצעות אנזים יציב בטמפרטורה שמצורף kזה לעומת אנזים חזק יותר מיצרן אחר. (ב) קביעת זמן דגירה אופטימלי proteinase K על מנת למקסם את התשואה ה- DNA. ביצועים של ריכוז גבוה עיכול proteinase K הוערכו בשלוש תקופות דגירה שונות באמצעות 3 דגימות FFPET. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן של ממוצע (SEM). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54299/54299fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54299/54299fig3.jpg" /> איור 3:. חומצות גרעין (DNA ו- RNA) תשואות ng / מ&quot;מ 3 של FFPET בסך הכל, על פני שנים לדוגמא סוגי רקמות נציג (א) סך התאושש חומצות גרעין מרקמות פורמלין-קבוע מוטבע פרפין. כמויות חומצות הגרעין שהוצגו מבוססות על העקירות של 333 דגימות FFPET uלשיר את פרוטוקול אופטימיזציה. (ב) העלילה מתאם בין ה- DNA הכולל התאושש RNA והגיל של דגימות FFPET. הדגימות FFPET חילוץ המשמש התקבלו בשנים 2000 עד 2012. (ג) מתאם בין תשואות מן במקביל חילוץ DNA ו- RNA 333 דגימות הערמונית. קיים מתאם חיובי בין תשואות DNA ו- RNA. (ד) הפגנה של הפרוטוקול באמצעות סוגי רקמות ארכיונים נוספים. פרוטוקול אופטימיזציה שמש לחלץ חומצות גרעין מ -14 סרטן (שד, שלפוחית ​​שתן ומוח) ונורמליות דגימות (כבדה). ברי שגיאה מייצגים SEM. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54299/54299fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54299/54299fig4.jpg" /> איור 4: ביצועים של רנ&quot;א ודנ&quot;א Co-מופק TissuCores הדואר ב Downstream יישומים. (א) mRNA נחשב עבור רקמות סרטן ערמונית FFPE ולשליטה PC-3 תאי קו טרי. כל נקודה מייצגת הממוצעת של 3 משכפל טכני חילוץ בנפרד. ערכי RNA תא PC-3 קו טרי מומחשים על ידי פסים צהובים וערכי רקמות FFPET מיוצגים על ידי נקודות צבעוניות. (ב) מבחני PCR ספציפיים מתילציה על DNA של דגימות סרטן הערמונית FFPET. ערכי מחזור סף התקבלו עבור 10 דגימות בצעו כצפוי באמצעות 50 ng / תגובה של DNA מרת bisulfite. מבחני MSP ALU מכל מדגם FFPET היו ערכי סף מחזור דומים (p&gt; 0.67). מבחני GSTP1 MSP הראו מתילציה גבוהה (סף מחזור נמוך) רמות בסרטן הערמונית מאשר ערמונית שפירה. (ג) הערכת איכות DNA ו- RNA סוגי רקמות נוספות. HPRT1 ביטוי גני Alu גן מבחני מתילציה בוצעו על חומצות גרעין (RNA ו- DNA בהתאמה) מופקות ולאmal כבד (נתיחה), והמוח (נתיחה) וסרטן השד (כל FFPET). תוצאות הערמונית מוצגות להשוואה. הערה: תוצאות דומות נצפו מכל סוג רקמה, למעט הגברת mRNA נכשלה ממדגם אחד נתיחה. כל נקודה או עמודה מייצגת דגימה, ברי שגיאה מייצגים SEM. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54299/54299fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="12"> ליבות רקמות </td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> קלט רקמות (mm3) </td><td rowspan="2"> שחולץ חומצות גרעין </td><td colspan="2"> מַתַן תוֹקֵף </td><td colspan="3"> בדיקת איכות: DNA </td><td colspan="4"> בדיקת איכות: RNA </td></tr><tr><td> (# של דגימות) </td><td> גיל של המדגם (שנים) </td><td> תשואה סה&quot;כ (נ&quot;ג) </td><td> גודל שבר (נ&quot;ב) </td><html><td> PCR </td><td> תשואה סה&quot;כ (נ&quot;ג) </td><td> גודל שבר (נ&quot;ב) </td><td> PCR </td><td> NanoString </td></tr><tr><td> Pikor et al. </td><td> 43 - 129 </td><td> DNA </td><td> אין מידע </td><td> אין מידע </td><td> אין מידע </td><td> אין מידע </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Montaser-Kouhsari et al. </td><td> 18 - 29.5 </td><td> RNA </td><td> 763 </td><td> 0-25 </td><td></td><td></td><td></td><td> 843 </td><td> אין מידע </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מאמר זה </td><td> 1.71 </td><td> DNA ו- RNA </td><td> &gt; 350 </td><td> 3-12 </td><td> 820 </td><td> 100 - 500 </td><td><img alt="בדוק מארק" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td> 2270 </td><td> 100-500 </td><td><img alt="בדוק מארק" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td>/ftp_upload/54299/check_mark.jpg &quot;/&gt; </td></tr><tr><td colspan="12"> סעיפי רקמות </td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> קלט רקמות </td><td rowspan="2"> שחולץ חומצות גרעין </td><td colspan="2"> מַתַן תוֹקֵף </td><td colspan="3"> בדיקת איכות: DNA </td><td colspan="4"> בדיקת איכות: RNA </td></tr><tr><td> (# של דגימות) </td><td> גיל של המדגם (שנים) </td><td> תשואה סה&quot;כ (נ&quot;ג) </td><td> גודל שבר (נ&quot;ב) </td><td> PCR </td><td> תשואה סה&quot;כ (נ&quot;ג) </td><td> גודל שבר (נ&quot;ב) </td><td> PCR </td><td> NanoString </td></tr><tr><td> הייכל et al. </td><td> 5 x 5 מיקרומטר </td><td> DNA </td><td> 12 </td><td> 7-22 </td><td> 88-300 </td><td> 103-351 </td><td><img alt="בדוק מארק" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> צ&#39;ונג et al. </td><td> 1 x 20 um </td><td> RNA </td><td> 9 </td><td> &gt; 5 </td><td></td><td></td><td></td><td> 16,000- 23,000 </td><td> 100-200 </td><td><img alt="בדוק מארק" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td></tr><tr><td> Antica et al. </td><td> 2 x 4 מיקרומטר </td><td> RNA </td><td> 18 </td><td> אין מידע </td><td></td><td></td><td></td><td> לא ידוע (621 ng / μl) </td><td> 80-202 + </td><td><img alt="בדוק מארק" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td></tr><tr><td> Ghatak et al. </td><td> 5 x 5 מיקרומטר </td><td> DNA ו- RNA </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> 14 256 </td><td> &lt;1030 </td><td><img alt="בדוק מארק" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td> 16 000 </td><td> 109-400 + </td><td><img alt="בדוק מארק" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td></tr><tr><td> הניג et al. </td><td> 1 x 10 מיקרומטר </td><td> DNA ו- RNA </td><td> 210 </td><td> 1-25 </td><td> אין מידע </td><td> אין מידע </td><td><img alt="בדוק מארק" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td> אין מידע </td><td> אין מידע </td><td><img alt="בדוק מארק" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td></tr><tr><td colspan="12"> Microdissection לכידת לייזר </td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> קלט רקמות (mm2) </td><td rowspan="2"> שחולץ חומצות גרעין </td><td colspan="2"> מַתַן תוֹקֵף </td><td colspan="3"> בדיקת איכות: DNA </td><td colspan="4"> בדיקת איכות: RNA </td></tr><tr><td> (# של דגימות) </td><td> גיל של המדגם (שנים) </td><td> תשואה סה&quot;כ (נ&quot;ג) </td><td> גודל שבר (נ&quot;ב) </td><td> PCR </td><td> תשואה סה&quot;כ (נ&quot;ג) </td><td> גודל שבר (נ&quot;ב) </td><td> PCR </td><td> NanoString </td></tr&gt; <tr><td> שלג et al. </td><td> 1-2 </td><td> DNA </td><td> 110 </td><td> 0-2 </td><td> 430 </td><td> אין מידע </td><td><img alt="בדוק מארק" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> הטבלה 1:. מהשוואת פרוטוקולי מיצוי RNA DNA ופורסמו עבור ליבות רקמות, מדורי ליזר ללכוד microdissections כללה גם כמה הערכת נקודות קצה המולקולרית של שיטות אלה תוך שימוש ב- PCR Nanostring מבחנים.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction at JoVE.com

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

פרוטוקול חילוץ שונה זה משפר תשואות רנ&quot;א ודנ&quot;א מאזורים ממוקדים באופן מדויק יותר של עניין גושי רקמת histopathologic.

הכין ליבות רקמות פרפין מוטבע פורמלין-קבועות הוא רנ&quot;א הפקת DNA

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

preparation-formalin-fixed-paraffin-embedded-tissue-cores-for-both

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

50.7K Views.  Queen's University.  פרוטוקול חילוץ שונה זה משפר תשואות רנ"א ודנ"א מאזורים ממוקדים באופן מדויק יותר של עניין גושי רקמת histopathologic. 

Video: Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

הפקת RNA מן התאים Neuroprecursor שימוש Bio-Rad סך RNA Kit

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune diseases and cancer2. Our aim is to investigate the antigens recognized by human T cells in the autoimmune disease type 1 diabetes 1,3,4,5. To analyze human T-cell responses against tissue where the antigens recognized by T cells are not identified we developed a method to extract protein antigens from human tissue in a format that is compatible with functional assays 6. Previously, T-cell responses to unpurified tissue extracts could not be measured because the extraction methods yield a lysate that contained detergents that were toxic to human peripheral blood mononuclear cells. Here we describe a protocol for extracting proteins from human tissues in a format that is not toxic to human T cells. The tissue is homogenized in a mixture of butan-1-ol, acetonitrile and water (BAW). The protein concentration in the tissue extract is measured and a known mass of protein is aliquoted into tubes. After extraction, the organic solvents are removed by lyophilization. Lyophilized tissue extracts can be stored until required. For use in assays of immune function, a suspension of immune cells, in appropriate culture media, can be added directly to the lyophilized extract. Cytokine production and proliferation by PBMC, in response to extracts prepared using this method, were readily measured. Hence, our method allows the rapid preparation of human tissue lysates that can be used as a source of antigens in the analysis of T-cell responses. We suggest that this method will facilitate the analysis of adaptive immune responses to tissues in transplantation, cancer and autoimmunity.

A simple protocol for preparing extracts of human tissue to be used as a source of antigens in functional T-cell assays is described. This method allows T-cell responses to tissue-derived antigens to be measured in vitro.

הפקת אנטיגנים רקמות למבחנים פונקציונליים

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

לדוגמא הכנת proteomic מפורמלין קבועה ורקמות פרפין Embedded

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה לרקמות כליה פורמלין קבועה

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR הוא שיטה רגישה ומהירה לאיתור של Cytomegaloviral DNA בקבועה פורמלין, רקמות ביופסיה מוטבעות פרפין

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

The goal of this video is to demonstrate how to perform&#160;automated DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) reference standard cell lines and digital droplet PCR&#160;(ddPCR) analysis to detect rare mutations in a clinical setting. Detecting mutations in FFPE samples demonstrates the clinical utility of ddPCR in FFPE samples.

העסקת דיגיטלי אגל PCR לזיהוי מוטציות V600E BRAF בשורות תאי ההפניה תקן קבוע פורמלין מוטבע-פרפין

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

הכין ליבות רקמות פרפין מוטבע פורמלין-קבועות הוא רנ"א הפקת DNA

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video