This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke's Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.

הצהרה אתיקה: דגימות דם כולו נעשה שימוש במחקר זה אינם נחשבים מחקר מעורבים בבני אדם. הדגימות התקבלו למטרות אבחון קליניות, אשר היו מרוצות, ואת החלק הנותר של דגימות אלה סופק עבור assay מחקר FINA. הדגימות קודדו כך שהחוקרים לא הצליחו לברר את זהות אנשים בקלות. 1. הכנת מודול הכנת דוגמאות FINA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן סופג כרית על ידי חיתוך 35 x 35 מ&quot;מ 2 של צמר גפן 2.6 מ&quot;מ עובי 100%. חותכי כרית אחת לכל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן סרט פרפין פלסטיק עם קלטת גיבוי נייר ידי פיסת חנית של סרט פרפין (25 מ&quot;מ (ח) ב -50 מ&quot;מ (w)) ולאחר מכן ניקוב חור בקוטר 7.14 מ&quot;מ במרכז את הקלטת באמצעות אגרוף חור מונע פטיש. כן קלטת אחת לכל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין קרום מפריד זכוכית דם כבול (קרום לכיד) דיסק ידי ניקוב עיגול בקוטר 8.35 מ&quot;מבאמצעות אגרוף חור מונע פטיש. פונץ &#39;דיסק אחד לכל דגימה. הדיסק יש יכולת כושר סינון של 2.3 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכיבו את מודול הכנת המדגם FINA ידי הצבת את הדיסק ללכוד במרכז הנייר הסופג באמצעות מלקחיים. מניח את קלטת סרט פרפין על דיסק צילום, כך החור של קלטת פרפין עוזב את המרכז של הדיסק ללכוד חשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבטיח מגע מרבי בין דיסק הנייר הסופג על ידי מתיחת קלטת פרפין מעט כדי לכסות את הנייר הסופג ולחיצה על קלטת פרפין בתקיפות לתקוע אותו אל הנייר הסופג סביב כל הקצוות של הדיסק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות כמה מודולים כנדרש לצורך הניסוי או לאגור לשימוש עתידי. </li></ol> 2. הכנת Tube qPCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דיסק הקלטת 5.1 מ&quot;מ אשר לעגן את קרום ללכוד תאים אל הצד של הצינור qPCR כדי למנוע קרום לחסום את גילוי הקרינה על ידי ניקוב מעגל של polye פעמיים מצופהSter סרט אבחון עם אגרוף מונע פטיש מסדין של הקלטת. הכין דיסק קלטת אחת לכל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צד אחד של אוניית המדבקה של הקלטת. מניחים את קלטת לתוך צינור PCR 200 μl, דבק בו על צד אחד ו לכיוון החלק התחתון של הצינור. הסר את האונייה מדבקה השנייה. הצינור מוכן כעת לקבל דיסק מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר כמה צינורות כנדרש לצורך הניסוי או לאגור לשימוש עתידי. </li></ol> 3. להמציא דם דגימה הערה: אם דגימה במבחן אמיתית שמכינה, המשך לשלב 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי 8e5-LAV הפשרה 15 מחסה עותק יחיד של provirus HIV-1 המתקבל מעבדת אבטחת האיכות וירולוגיה (VQA; Rush Presbyterian / הסנאט במרכז הרפואי של לוק, שיקגו, אילינוי.). הערה: הם מאוחסנים כדורי תא קפוא בריכוז של 4,000 תאים / μl. ספירת תאים אומתה כפי שתואר לעיל 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן serדילול ial מקפיא בינוני (בסרום שור עוברי 90%, sulfoxide דימתיל 10%) לריכוזים בטווח שבין 1 ל 400 תאים / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 10 תאי μl מכל אחד הדילולים סדרו לתוך צינור microcentrifuge. הוספת 100 μl של כל דגימת דם מטופלי EDTA השלילית HIV-1 טריה על צינור אחד כדי ליצור עקומת סטנדרט של מספרי עותק 8e5-LAV 10-4,000. מערבבים על ידי מצליף התחתון בעדינות של הצינור 5 פעמים. </li></ol> 4. בצע הפקת FINA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse דם התאים על ידי הוספת טריטון-X100) לריכוז סופי של 1% (11 μl 10% טריטון-X100 110 μl כולו דם ותאי משלב 3.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים על ידי מצליף התחתון בעדינות של הצינור 5 פעמים. הדם צריך להאדים שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet כל דגימת דם על הדיסק ללכוד. הערה: חותמת מים חזקה בין קלטת פרפין הממברנה ללכוד מבטיחה כי הדם זורם דרך הממברנה, וקשר טוב בין ללכוד מ &#39;embrane והרכבת נייר סופג מבטיחים פתילת מדגם מהירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר מדגם לספוג דרך המסנן. הערה: פתילות דם lysate לתוך הנייר הסופג בשל פעולה נימי, ללכוד את הדנ&quot;א הגנומי על פני השטח של הדיסק ללכוד. את lysate שספג לתוך הדיסק כאשר הוא מופיע מט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 600-1,000 μl 10 מ&quot;מ NaOH ירידה מבחינת על הדיסק ללכוד. הערה: חיץ לשטוף ניתן להוסיף גם כתוספת עיקר 600 μl. המאגר יהווה אגל בקלטת פרפין הידרופובי פתיל דרך החור אל הדיסק ב כ 20 שניות. המסנן ישתנה מאדום אישור מציין לבן של המוגלובין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הדיסק מן הנייר הסופג עם מלקחיים ולהחיל את הדיסק לקלטת בצינור PCR המוכן. אם יש צבע אדום נשאר על המסנן להוסיף 50-100 μl של חיץ לשטוף כדי להסיר את המסנן לפני הצבת בצינור. הערה: לעתים רחוקות, לחץ עודף מיושם במהלך הכנתמודולי FINA תוצאות החלוקות של השכבות הממברנה במהלך ההיפרדות מן הנייר הסופג. בטל הדיסקים האלה ולהכין מדגם טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסינון ממוקם בצינור PCR, לנתח דגימות מיד. לחלופין, לילה יבש בתוך יבוש סידן גופרתי המכיל תיבת, ולאחר מכן מכסה ומכניסים שקיק רדיד עם יבוש סיליקה ולאחסן עד מוכן לניתוח. </li></ol> 5. התגובה qPCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 100 μl תערובת אמן qPCR לכל תגובה באמצעות HIV פריימרים ו בדיקות ספציפיים כפי שתואר לעיל 9,11. כלול פקד הגברה פנימי כדי לפקח על הנוכחות של מעכבי הגברה כדי לוודא מדגם שלילי הוא שלילי נכון. הקפד כי מסנן מכוסה כולו תערובת אמן וכי מסנן נשאר קבוע לצד של צינור לאורך כל התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הגברה באמצעות מכשיר PCR בזמן אמת כפי שתואר לעיל 9. </li></ol>

<ol>
	<li>Byrnes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+and+concentration+of+DNA+in+porous+membranes+for+point-of-care+applications.">One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications.</a> Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).</li><li>Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Paper+Machine"+for+Molecular+Diagnostics.">"Paper Machine" for Molecular Diagnostics.</a> Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).</li><li>Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+cost+point-of-care+viscous+sample+preparation+device+for+molecular+diagnosis+in+the+developing+world;+an+example+of+microfluidic+origami.">A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami.</a> Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).</li><li>Linnes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+molecular+diagnostic+for.">Paper-based molecular diagnostic for.</a> RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).</li><li>Rodriguez, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-Based+RNA+Extraction,+in+Situ+Isothermal+Amplification,+and+Lateral+Flow+Detection+for+Low-Cost,+Rapid+Diagnosis+of+Influenza+A+(H1N1)+from+Clinical+Specimens.">Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens.</a> Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).</li><li>Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+tests+for+sexually+transmitted+infections+(STIs):+the+way+forward.">Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward.</a> Sex Transm Infect. 82, 1-6 (2006).</li><li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostics+for+the+developing+world.">Diagnostics for the developing world.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).</li><li>Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point-of-care+PCR+test+for+HIV-1+detection+in+resource-limited+settings.">A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings.</a> Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).</li><li>Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+point-of-care+extraction+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+proviral+DNA+from+whole+blood+for+detection+by+real-time+PCR.">Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR.</a> J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).</li><li>Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Google Patents. , (2012).</li><li>McFall, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Rapid+DNA+Extraction+Method+from+Whole+Blood+for+Highly+Sensitive+Detection+and+Quantitation+of+HIV-1+Proviral+DNA+by+Real-Time+PCR.">A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-PCR+processing:+strategies+to+generate+PCR-compatible+samples.">Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples.</a> Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).</li><li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+inhibitors+-+occurrence,+properties+and+removal.">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li><li>Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Google Patents. , (1991).</li><li>Violari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Antiretroviral+Therapy+and+Mortality+among+HIV-Infected+Infants.">Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants.</a> N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization. , (2010).</li><li>Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dried+blood+spots--preparing+and+processing+for+use+in+immunoassays+and+in+molecular+techniques.">Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Maiers, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+fingerstick+blood+collection+for+point-of-care+HIV-1+viral+load+monitoring+in+South+Africa.">An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa.</a> S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

עיד צמוד גישת טיפול מהירה הודגם להפחית תמותת תינוקות עקב זיהום HIV 16. בגלל ההתמדה של נוגדנים אימהיים בתוך הדם של תינוק, בדיקות נוגדנים מהירות HIV יש שימושיות מוגבלת בקביעת מעמדם של תינוקות שנחשפו HIV. ארגון הבריאות העולמי ממליצה כי כל התינוקות שנולדו ל- HIV-1 אמהות חיו...

מספר דיווחים דנו בפיתוח שיטות חילוץ נייר או מבוסס קרום לשימוש Point-of-care (POC) התקנים 1-5 במטרה עושה את הרגישות וסגולית המעודנות של אבחון מולקולרי זמינה לכל. ארגון הבריאות העולמי (WHO) מחלות המועברות במגע מיני יוזמת אבחון טבע את מונח בטיח (משתלמים, רגישים, ספציפית, ידידותי למשתמש, ראפיד וחזק, ציוד ללא ונמסר מי צריכים את זה) כדי לתאר את המאפיינים האידיאליים של POC מבחן 6. הנחיות אלה, המאפיין ללא ציוד מאתגר במיוחד להשגה לאבחון מולקולרי. עם זאת, כל חידוש בתחום יקדם את המטרה להגיע אלה ברוב הצורך, ויש תקווה לשיפורים לטווח קרוב בביצועי בדיקה על ידי התאמת טכנולוגית 7 קיימים. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לחילוץ דנ&quot;א מהדם כולושאינו דורש מכשור כימיה או מעבדה מורכבת. FINA (בידוד סינון של חומצות גרעין) שיטת הכנת המדגם פותחה במקור כדי לחלץ DNA לויקוציטים מהדם כולו כדי לזהות את provirus HIV-1 כחלק מדגם עד למענה Point-of-care (POC) PCR כמותי (qPCR) מוקדם התינוק אבחון (עיד) פלטפורמה לשימוש הגדרות משאב מוגבל 8-11. מיצוי FINA נבדל שיטות טיהור קונבנציונליות המשתמשות ממברנות סיליקה או חלקיקים פאראמגנטיים מצופית סיליקה לאגד DNA הפיך בנוכחות סוכני chaotropic 12. במקום זאת, FINA משתמש סינון אנכי דרך קרום הפרדה לחלץ DNA התאי מהדם כולו ישירות. קרום המכיל את DNA בפח יכול להיות ממוקם ישירות בתוך שפופרת PCR ואו מיד בשימוש תגובת PCR או מיובש באוויר הגברה מאוחר יותר 9. אין סביבות chaotropic, פנול, או כהלים משמשים החילוץ המדגם, eliminaטינג שלבי הכביסה הנרחבים צורך להסיר מעכבי qPCR חזקים נגזרו תהליך החילוץ 13,14. קרום FINA יכול ללכוד או תאים 9 או הדנ&quot;א הגנומי ששוחררו על ידי תמוגה תא 11 לפני הדגימה מתווספת הממברנה. עבור ללכוד תאים, דם מלא מתווסף ישירות הממברנה. התאים לאחר מכן הם lysed בקרום ידי הוספת 10 מ&quot;מ NaOH. היתרון בשיטה זו הוא שהיא כוללת רק 3 שלבים: 1) בנוסף מדגם; 2) תמוגה תא / לשטוף 3) מיקום הדיסק מסנן בצינור qPCR. החיסרון בשיטה זו הוא כי קרום יכול להכיל רק מספר מוגדר של תאים ביחס ישר לקוטר של הדיסק הממברנה. כדי להגיע לגבול של זיהוי הנדרש עיד, 100 μl של דם מלא נדרש קלט מדגם הכרוך מסנן כי הוא גדול מדי כדי להיות ממוקם בתוך צינור qPCR. Lysing בתאי הדם עם חומר ניקוי לפני הוספת מדגם לאיסוףקרום מוסיף צעד עיבוד, אך מאפשר שימוש במסנן קטן מאותן גודל המדגם. הצלחנו להוכיח שחזור גבוה, זיהוי עותק יחיד, וכימות קטנה כמו 10 עותקים של דנ&quot;א proviral HIV-1 מ 100 μl של דם באמצעות בדיקה זו תצורה 11. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים את פרוטוקול FINA כפי שפותח במקור לשימוש במעבדה. הקרום / מסנן הכריך המכונה מודול הכנת מדגם FINA אפשר להכין סדרות המוניות שנאגר לשימוש מאוחר יותר. כאשר דגימות הן להיעקר תהליך זה לוקח 2 דקות והוא יכול להתבצע משתנה קבוצות גודל. QPCR ניתן להפעיל באופן מיידי או מסננים המכילים את ה- DNA מוטבע ניתן לאחסן עד שהוא נוח לבצע qPCR. שיטה זו נוחה מאוד עבור ניתוח שיגרתי של דגימות בשתי הגדרות משאב נמוכות וגבוהות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Fusion 5</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:104px;">8151-9915</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">707 blotting pad</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>28298-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PARAFILM M</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape&#160;</td>
			<td>3M Medical Specialties</td>
			<td>9965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 &#181;l qPCR strip tubes</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">optical strip caps</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mx3005p qPCR System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>A.C.S. Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum, certified, U.S. origin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 3/16&#34; hole diameter (5.1 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 1/4&#34; hole diameter (7.14 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hammer driven small hole punch 5/16&#34; hole diameter (8.35 mm)</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3424A23</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

filtration isolation of nucleic acids:  a simple and rapid dna extraction method

FINA, סינון בידוד של חומצות גרעין, היא שיטת חילוץ רומן אשר מנצלת סינון אנכי דרך קרום פרדת כרית ספיגה לחלץ DNA תאי מדם כולו בתוך פחות מ -2 דקות. דגימת דם מטופל עם חומר ניקוי, בקצרה מעורבים ויישומים ידי pipet קרום ההפרדה. את lysate פתילות לתוך הנייר הסופג בשל פעולה נימי, ללכוד את הדנ&quot;א הגנומי על פני השטח של קרום ההפרדה. ה- DNA החילוץ נשמר על הממברנה במהלך שלב לשטוף פשוט שבו מעכבי PCR הם רשעים לתוך הנייר הסופג הסופג. הקרום המכיל את DNA בפח הוא הוסיף אז אל תגובת PCR ללא טיהור נוספת. שיטה פשוטה זו אינה דורשת ציוד מעבדה והוא יכול להיות מיושם בקלות עם ציוד מעבדה יקר. כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור זיהוי רגיש מאוד לכמת DNA proviral HIV-1 מ 100 μl כולו דם כמודל מוקדםאבחון פאנט של HIV שיכול להתאים בקלות ליעדים גנטיים אחרים.

זרימת העבודה לחילוץ דנ&quot;א proviral מהדם כולו ומשובץ תאים 8e5-LAV מוצג באיור 1. איור 2 מציג את מודול מדגם FINA והכינו צינור qPCR. שיטה זו מאפשרת הגברה יעילה של provirus HIV-1 מתאי 8e5-LAV במספרי עותק שונים, כפי שמוצגת עקומת התקן של דגימות מאולצות (איו...

Watch this Scientific Journal Video about Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method at JoVE.com

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

אנו מתארים כאן שיטה להפקת DNA פשוטה ומהירה מבוססי נייר של HIV proviral דנ&quot;א שלם דם זוהה על ידי PCR כמותי. פרוטוקול זה יכול להתארך לשימוש באיתור סמנים גנטיים אחרים או בשיטות הגברה חלופיות.

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

filtration-isolation-nucleic-acids-simple-rapid-dna-extraction

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K Views.  Northwestern University.  אנו מתארים כאן שיטה להפקת DNA פשוטה ומהירה מבוססי נייר של HIV proviral דנ"א שלם דם זוהה על ידי PCR כמותי. פרוטוקול זה יכול להתארך לשימוש באיתור סמנים גנטיים אחרים או בשיטות הגברה חלופיות. 

Video: Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

קביעת ריכוז חומצות גרעין וחלבונים שימוש Micro בנפח Bio-spec ספקטרופוטומטר Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

חשמל חינם, חומצות גרעין רצופות ובידוד חלבון

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

תיוג רצף ספציפי של חומצות גרעין וחלבונים עם Methyltransferases ואנלוגים כקו-פקטורים

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

שיטה פשוטה DNA הקרינה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה לכרומוזומים &quot;סתמת

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג&#39;ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video