עבודה זו נתמכה על ידי National Research Foundation של קוריאה (NRF) מענקים (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), מענק מטעם R בריאות הטכנולוגיה הקוריאני &amp; D פרויקט, משרד הבריאות והרווחה (A121994) ו IBS-R020-D1 הממומן על ידי ממשלת קוריאה.

הערה: דם נמשך מיחידים בריאים נאסף צינור איסוף דם. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המתנדבים. ייצור 1. של 2 Tio NF Mat <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מבשר פתרון 22 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 1.5 גרם של טיטניום tetraisopropoxide (TTIP) בתערובת של אתנול (99.9%, 3 מ&quot;ל) וחומצה אצטית קרחונית (3 מ&quot;ל) ומערבבים את הפתרון ב RT (25 מעלות צלזיוס) במשך 30 דקות על stirrer מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 11% WT של פוליוויניל pyrrolidone (PVP) ב 3.64 גרם של אתנול (99.9%) ומערבבים הפתרון על 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. באמצעות בוחש מגנטי חם צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים ומערבבים שני הפתרונות על 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות על בוחש מגנטי חם צלחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> electrospinning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טענתי את הפתרון המוכן לתוך מזרק מחובר מחט נירוסטה של ​​200 מיקרומטר diame הפנימיter. יוצקים את הפתרון ישירות לתוך המזרק לאחר הסרת הבוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הציגו את פתרון כל הזמן בקצב זרימה של 0.3 מ&quot;ל / שעה למשך 10 דקות על גבי פרוסות Si (2 ס&quot;מ X 2 ס&quot;מ) שהונחו על מצע מוארק במתח גבוה DC (15 ק). במהלך electrospinning, לקבוע את המרחק בין המחט ואת המצע מקורקע עד 10 ס&quot;מ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Calcination של המזרן NF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מחצלת NF בכבשן ולהגדיל את הטמפרטורה ל 500 מעלות צלזיוס עם שיעור ramping של 3 מעלות צלזיוס / min בתנאי ואקום גבוה (5 x 10 -5 גוה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על טמפרטורה של 500 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. לקרר את הטמפרטורה של דגימות RT (25 מעלות צלזיוס) בכבשן. </li></ol></li></ol> 2. שילוב של Tio 2 NF Mat לתוך דיסק Microfluidic צנטריפוגלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המצאה של דיסק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת עיצוב 3D (למשל, סולidWorks או דומה) לתאר תאים, ערוצים, או שסתומים של כל שכבה של דיסק. המר קבצי תכנון ועד שליטה מספרית מחשב (CNC) קוד באמצעות תוכנת יצירת קוד (למשל, Edgecam או דומה). השתמש תוכנות בהתאם להוראות במדריך 23,24 הערה:. ממדי הערוץ האופייניים בשימוש במכשיר זה הם 1.0 מ&quot;מ x 0.3 מ&quot;מ (עומק x רוחב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת ההפעלה של מכונת כרסום CNC (למשל., DeskCNC או דומה) ולטעון קוד CNC לתוכנת ההפעלה ולחץ על הבא כדי: &quot;AUTO&quot; -&gt; &quot;OPEN G CODE&quot; -&gt; בחר את קוד CNC שנוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף הצלחת PC על מכונת כרסום CNC: להשתמש 1 צלחות PC מ&quot;מ עבור השכבה העליונה וצלחות PC 5 מ&quot;מ עבור שכבת דיסק. הפעל את מכונת כרסום CNC לחתוך כל שכבה של הדיסק על ידי לחיצה על כפתור &quot;התחל&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מחצלת Tio 2 NF על גבי דיסק<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מצע סיליקון בצלחת פטרי קטן המכיל 40 μL של (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) -1-trichlorosilane בתא ואקום תחת ואקום במשך 30 דקות. Fluorosilane מאדה ומקבלת מצופה על פני המצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים polydimethylsiloxane (PDMS) מראש פולימר עם סוכן ריפוי בתוך 10: יחס 1 דגה בתא ואקום. ספין מעיל PDMS על מצע סיליקון ב 650 סל&quot;ד במשך 60 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרפא את PDMS מצופה על מצע סיליקון בתנור על 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להשיג מדינה חסידה. הערה: זמן אשפרה יכול להיות מגוון בהתאם לתנאי סביבה, וכוח ההדבקה ניתן לבדוק על ידי בדיקת כיוון באמצעות rheometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את מחצלת Tio 2 NF שהכין electrospinning ו calcination על סיליקון PDMS מצופה באמצעות פינצטה. ואז, באופן ידני להחיל לחץ קונפורמי על מזרן Tio 2 NF הועבר באמצעות חפץ שטוח (למשל., שקופיות זכוכית) להסיר את האובייקט. לָשִׂיםמדגם זה בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות או על 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. לרפא שכבת PDMS לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי התגובה מחייב המעיל את הדיסק עם 20 μl תערובת סוכן PDMS / ריפוי (10: 1), אשר משמש שכבת דבק לצרף מחצלת NF Tio 2 על גבי דיסק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 50 μl של אתנול (99.9%) על המזרן NF Tio 2 על שכבת PDMS, לחתוך את מחצלת NF עם חור אגרוף של קוטר 6 מ&quot;מ, ולהעביר את החתך Tio 2 מחצלת NF אל תאי התגובה מחייב מצופה 20 μl של PDMS בשלב הקודם. הערה: בשלב זה, אתנול יהיה מועיל לנתק את החתך Tio 2 NF מחצלת מהמצע Si. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דיסק משולב מחצלת Tio 2 NF בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות או על 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. לרפא את PDMS לחלוטין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי פני שטח של מזרן NF Tio 2 על הדיסק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prepare 1% v / v פתרון של (3-glycidoxypropyl) silane methyldiethoxy (GPDES) באתנול (99.9%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את הדיסק משולב מחצלת Tio 2 NF עם פלזמת חמצן ב 140 W, 50 זרימת חמצן SCCM עבור 180 שניות. לוותר 100 μl של פתרון GPDES על כל מחצלת nanofiber דגירה ב RT (25 מעלות צלזיוס) במשך שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את בקצרה מצעים ידי מחלק אתנול (99.9%) באמצעות בקבוק לשטוף, ואז להסיר את אתנול לחלוטין על ידי היפוך הדיסק סופג אותו כנגד נקו. Cure על 80 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה. פעמים לשטוף עם אתנול (99.9%), באותו אופן כאמור לעיל, כדי להסיר את מולקולות GPDES adsorbed ו מאוגדות הפיסיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכה יבשה עם זרם חנקן, יבש תחת ואקום. הערה: דיסק ניתן לאחסן במיכל אטום ב RT (25 מעלות צלזיוס) עד לשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוע של נוגדנים על פני השטח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון של 200 מיקרוגרם / מיליליטר של נוגדנים לכידים (אנטי עכבר חד שבטיhsCRP אדם או עכבר חד שבטי-cTnI אנטי) על ידי דילול הנוגדנים עם בופר פוספט (PBS) חיץ (pH 7.4). לוותר 5 μl של הפתרון על כל מחצלת NF ב דיסק באמצעות micropipette. ראה רשימת חומרים לקבלת מידע נוסף על הנוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על דיסקים בתא humidified לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. שטפו את הנוגדנים מצופה מחצלת NF עם חיץ 0.1% BSA-PBS. ממלאים את החדר עם 100 μl של חיץ לשטוף באמצעות micropipette, להסיר את החיץ ידי aspirating או decanting. לבסוף, להפוך את הדיסק למחוק את זה נגד נקי לנגב, ולאחר מכן להרכיב את הדיסק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבת דיסק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את העיצוב של הדיסק על נייר דבק דו-לוואי באמצעות תוכנית CAD (למשל, AutoCAD או דומה). טען את עיצוב CAD אל תואי חיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את נייר דבק דו-לוואי באמצעות פלוטר חיתוך. לקלף שכבת מגן אחד של נייר דבק כפול ולצרף it על גבי שכבת דיסק. לקלף את שכבת מגן האחרת ולצרף את השכבה העליונה על שכבת הדיסק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הדיסק התאסף מקדמים במכונת הלחיצה בדיוק ליישר שכבות עליונות / דבק / דיסק באמצעות סימני align בכל שכבה לחיבור כל שסתום, ערוץ, ותאי. החל לחץ קונפורמי באמצעות מכונת הגיהוץ. </li></ol></li></ol> 3. Immunoassay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את התאים עם 1% חיץ BSA-PBS באמצעות micropipette דגירת הדיסק ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הסר את החוצץ על ידי שאיפה באמצעות micropipette. בצע פעולה זו כדי לחסום את האתרים בלתי הגיב להפחית ספיחה הלא ספציפית של חלבון דיסק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם 0.1% BSA-PBS על ידי מילוי aspirating לתאי באמצעות micropipette. הערה: בשלב זה את הדיסק יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 10 μl של דם מלא-ממוסמר אנטיגן או סרום ללא CRP לגילוי CRP על דיסק באמצעות micropipettדואר. להכנת גרפי הכיול, השתמשו ריכוזי CRP מ 1 pg / ml 100 ng / ml; ו cTnI מ -10 pg / ml 100 ng / ml. הערה: בשל הרמות הגבוהות של CRP בדם כולו, שהיא בדרך כלל בטווח מיקרומטר, CRP בסרום ללא שמש כדי להדגים את גבול הגילוי הנמוך של המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסובבים את הדיסק ב -3,600 סל&quot;ד (391 XG) במשך 60 שניות כדי להפריד את תאי הדם האדומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שסתום להרחיב # 1 על ידי הקרנה לייזר, והעברת 4 μl של הפלזמה supernatant לתא המכיל 8 μl של גילוי נוגדנים מצומדות עם HRP על ידי ספינינג דיסק ב- 2400 סל&quot;ד במשך 3 שניות. הערה:. התהליכים הכלליים עבור השסתום actuation וויזואליזציה של מבצע דיסק מתוארים בפירוט בדו&quot;ח קודם 21 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת מצב ערבוב (15 הרץ s -1, 15 °) במשך 5 שניות לכריכה של נוגדנים לחלבון וזיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> # 2 שסתום פתוח, ולהעביר את התערובת מוכנה בשלב 6 לתא התגובה המחייב (סל&quot;ד 2,400, 3 שניות). לאחר מכן, החל מצב ערבוב (60 רץ s -1, 2 מעלות) במשך 20 דקות כדי להשיג immunoreaction בין התערובת לבין הנוגדנים מחייבים על NFS 2 Tio. לאחר התגובה, # שסתום פתוח 3 ולהעביר את התערובת שיורית לתא פסולת (2,400 סל&quot;ד, 10 שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את חיץ כביסה (600 μl) לתא התגובה מחייב ידי פתיחת שסתום # 4 ויסובב את הדיסק (2,400 סל&quot;ד, 4 שניות). ואז להחיל מצב ערבוב (30 הרץ s -1, 30 °) עבור 120 שניות לשטוף את Tio 2 NFS בתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את 2 Tio NFS עוד פעמיים על ידי ביצוע אותו מצב של שלב 3.8, ולהסיר את חיץ כביסה שיורית על ידי ספינינג דיסק לחלוטין ב- 2400 סל&quot;ד במשך 20 שניות. לאחר מכן, סגור את שסתום # 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור התגובה chemiluminescent, להחיל מצב ערבוב (30 הרץ s -1, 2 °) 1 דקות לאחר העברת הפתרון המצע chemiluminescent לתא התגובה מחייב ידי פתיחת שסתום # 6 וספינינגהדיסק ב- 2400 סל&quot;ד במשך 10 שניות לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את פתרון המצע הגיב לתאי זיהוי על ידי פתיחת שסתום # 7 ותסובבו את הדיסק ב- 2400 סל&quot;ד במשך 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד אותות chemiluminescence מפתרון המצע הגיבו באמצעות צינור מכפיל (PMT) מודול מערכת איתור מאובזר. הערה: מערכת זיהוי הוא מכונה שהותקן באמצעות החלקים הבאים: צעד מנוע, רכיבים ומכאניים, בשלבי תרגום, זמינה מסחרי PMT. החלקים והמכאניים ומוטורי צעד מורכבים להחזיק את המכשיר, ואת המנוע יכול לסובב את הדיסק. הגילוי מתבצע על ידי PMT נעוצות חלקים ומכניים, והיא ממוקמת מעל תאי זיהוי של המכשיר. על ידי מניפולציה של מנוע צעד, לתאי זיהוי מיושרים ממש מתחת לאזור זיהוי של PMT. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials+for+Ultrasensitive+Protein+Detection.">Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection.</a> Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).</li><li>Hu, W., Li, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterial-based+advanced+immunoassays.">Nanomaterial-based advanced immunoassays.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).</li><li>Yang-Kyu, C., Chang-Hoon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+Nanowire+Biosensor+for+Cancer+Markers.">Silicon Nanowire Biosensor for Cancer Markers.</a> Biosensors and Cancer. , 164-183 (2012).</li><li>Baltazar, R., Vistas, C. R., Ferreira, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensing+Applications+Using+Nanoparticles.">Biosensing Applications Using Nanoparticles.</a> Nanocomposite Particles for Bio-Applications. , 265-282 (2011).</li><li>Roy, P., Berger, S., Schmuki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TiO2+Nanotubes:+Synthesis+and+Applications.">TiO2 Nanotubes: Synthesis and Applications.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (13), 2904-2939 (2011).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+Nanofibrous+Membranes:+A+Novel+Solid+Substrate+for+Microfluidic+Immunoassays+for+HIV.">Electrospun Nanofibrous Membranes: A Novel Solid Substrate for Microfluidic Immunoassays for HIV.</a> Adv. Mater. 20 (24), 4770-4775 (2008).</li><li>Chantasirichot, S., Ishihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+phospholipid+polymer+substrate+for+enhanced+performance+in+immunoassay+system.">Electrospun phospholipid polymer substrate for enhanced performance in immunoassay system.</a> Biosens. Bioelectron. 38 (1), 209-214 (2012).</li><li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+TiO2+Nanofiber-Based+Cell+Capture+Assay+for+Detecting+Circulating+Tumor+Cells+from+Colorectal+and+Gastric+Cancer+Patients.">Electrospun TiO2 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients.</a> Adv. Mater. 24 (20), 2756-2760 (2012).</li><li>Ali, M. A., Mondal, K., Singh, C., Dhar Malhotra, B., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-epidermal+growth+factor+receptor+conjugated+mesoporous+zinc+oxide+nanofibers+for+breast+cancer+diagnostics.">Anti-epidermal growth factor receptor conjugated mesoporous zinc oxide nanofibers for breast cancer diagnostics.</a> Nanoscale. 7 (16), 7234-7245 (2015).</li><li>Mondal, K., Ali, M. A., Agrawal, V. V., Malhotra, B. D., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+Biofunctionalized+Mesoporous+Electrospun+TiO2+Nanofiber+Based+Interface+for+Biosensing.">Highly Sensitive Biofunctionalized Mesoporous Electrospun TiO2 Nanofiber Based Interface for Biosensing.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (4), 2516-2527 (2014).</li><li>Tu, W., Dong, Y., Lei, J., Ju, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Potential+Photoelectrochemical+Biosensing+Using+Porphyrin-Functionalized+TiO2+Nanoparticles.">Low-Potential Photoelectrochemical Biosensing Using Porphyrin-Functionalized TiO2 Nanoparticles.</a> Anal. Chem. 82 (20), 8711-8716 (2010).</li><li>Liu, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coadsorption+of+Horseradish+Peroxidase+with+Thionine+on+TiO2+Nanotubes+for+Biosensing.">Coadsorption of Horseradish Peroxidase with Thionine on TiO2 Nanotubes for Biosensing.</a> Langmuir. 21 (18), 8409-8413 (2005).</li><li>Portan, D. V., Kroustalli, A. A., Deligianni, D. D., Papanicolaou, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biocompatibility+between+TiO2+nanotubes+layer+and+human+osteoblasts.">On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts.</a> J.Biomed.Mater.Res. Part A. 100 (10), 2546-2553 (2012).</li><li>Dettin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+surface+modification+of+titanium+oxide+with+different+adhesive+peptides:+Surface+characterization+and+osteoblast-like+cell+adhesion.">Covalent surface modification of titanium oxide with different adhesive peptides: Surface characterization and osteoblast-like cell adhesion.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part A. 90 (1), 35-45 (2009).</li><li>Kim, W. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Protein+Immobilization+Efficiency+on+a+TiO2+Surface+Modified+with+a+Hydroxyl+Functional+Group.">Enhanced Protein Immobilization Efficiency on a TiO2 Surface Modified with a Hydroxyl Functional Group.</a> Langmuir. 25 (19), 11692-11697 (2009).</li><li>Son, K. J., Ahn, S. H., Kim, J. H., Koh, W. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft+Copolymer-Templated+Mesoporous+TiO2+Films+Micropatterned+with+Poly(ethylene+glycol)+Hydrogel:+Novel+Platform+for+Highly+Sensitive+Protein+Microarrays.">Graft Copolymer-Templated Mesoporous TiO2 Films Micropatterned with Poly(ethylene glycol) Hydrogel: Novel Platform for Highly Sensitive Protein Microarrays.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 3 (2), 573-581 (2011).</li><li>Kar, P., Pandey, A., Greer, J. J., Shankar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh+sensitivity+assays+for+human+cardiac+troponin+I+using+TiO2+nanotube+arrays.">Ultrahigh sensitivity assays for human cardiac troponin I using TiO2 nanotube arrays.</a> Lab Chip. 12 (4), 821-828 (2012).</li><li>Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electrospinning+technique+for+biomedical+applications.">Use of electrospinning technique for biomedical applications.</a> Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).</li><li>Ding, B., Wang, M., Wang, X., Yu, J., Sun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+nanomaterials+for+ultrasensitive+sensors.">Electrospun nanomaterials for ultrasensitive sensors.</a> Mater. Today. 13 (11), 16-27 (2010).</li><li>Liu, Y., Yang, D., Yu, T., Jiang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+electrospun+nanofibrous+PVDF+membranes+into+a+microfluidic+chip+assembled+by+PDMS+and+scotch+tape+for+immunoassays.">Incorporation of electrospun nanofibrous PVDF membranes into a microfluidic chip assembled by PDMS and scotch tape for immunoassays.</a> ELECTROPHORESIS. 30 (18), 3269-3275 (2009).</li><li>Lee, W. S., Sunkara, V., Han, J. -. R., Park, Y. -. S., Cho, Y. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+TiO2+nanofiber+integrated+lab-on-a-disc+for+ultrasensitive+protein+detection+from+whole+blood.">Electrospun TiO2 nanofiber integrated lab-on-a-disc for ultrasensitive protein detection from whole blood.</a> Lab Chip. 15 (2), 478-485 (2015).</li><li>Li, D., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Titania+Nanofibers+by+Electrospinning.">Fabrication of Titania Nanofibers by Electrospinning.</a> Nano Lett. 3 (4), 555-560 (2003).</li><li>Lombard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SolidWorks 2013 BIBLE. , (2013).</li><li>Tickoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EdgeCAM 11.0 for Manufacturers. , (2007).</li><li>Zhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+adhesion+of+interconnected+TiO2+nanofiber+network+on+conductive+substrate+and+its+application+in+polymer+photovoltaic+devices.">Improved adhesion of interconnected TiO2 nanofiber network on conductive substrate and its application in polymer photovoltaic devices.</a> Appl. Phys. Lett. 93 (1), 013102 (2008).</li><li>Song, M. Y., Ahn, Y. R., Jo, S. M., Kim, D. Y., Ahn, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TiO2+single-crystalline+nanorod+electrode+for+quasi-solid-state+dye-sensitized+solar+cells.">TiO2 single-crystalline nanorod electrode for quasi-solid-state dye-sensitized solar cells.</a> Appl. Phys. Lett. 87 (11), 113113 (2005).</li><li>Katsuhiro, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+processed+nanofibrous+TiO2+membranes+for+photovoltaic+applications.">Electrospinning processed nanofibrous TiO2 membranes for photovoltaic applications.</a> Nanotechnology. 17 (4), 1026-1031 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

את assay על דיסק משולב Tio 2 NF הוא טכניקה מהירה, זולה ונוחה לאיתור הרגיש של חלבונים נמוכים בשפע נוכחים נפח נמוך מאוד של דם. טכניקה זו יש את היתרון של שימוש כרכים מדגם קטן (10 μl) ו ניתנת לניתוח של דגימות מרובות בו זמנית. זה מספק פוטנציאל גדול כהתקן immunoassay ריבוב. המכשיר כול...

מספר פלטפורמות לאבחון המחלה פותחו על בסיס חומרים ננומטריים 1,2 כגון ננו-חוטים, 3 חלקיקים, 4 צינורות, 5 ו nanofibers (NFS) 6-8. ננו אלה מציעים סיכויים מצוינים בעיצוב של טכנולוגיות חדשות עבור bioassays רגיש מאוד בשל המאפיינים physicochemical הייחודיים שלהם. לדוגמא, nanofibers תחמוצת אבץ mesoporous שמש לצורך זיהוי פמטו-הטוחנת הרגיש של סמנים לסרטן השד. 9 לאחרונה, ננו מבוסס על תחמוצת טיטניום (Tio 2) נחקר עבור יישומי bioanalytical 10 בהתחשב היציבות הכימית שלהם, 11 denaturation חלבון זניח , 12 ו biocompatibility. 13 בנוסף, קבוצות הידרוקסיל על פני השטח של Tio 2 להקל שינוי כימי ואת הקובץ המצורף קוולנטי של מולקולות ביולוגיות. 14,15 2 Patterned TIO תיn סרטים 16 או Tio 2 צינורות 17 כבר נוצלו כדי לשפר את רגישות הזיהוי של חלבון המטרה על ידי הגדלת שטח הפנים; עם זאת, תהליך הייצור הוא מורכב למדי ודורש ציוד יקר. מצד השני, NFS electrospun מקבל תשומת לב בגלל שטח הפנים הגבוה שלהם, כמו גם תהליך ייצור פשוט בעלות נמוך; 18,19 עדיין, המאפיין השביר או רופף של מזרן NF electrospun Tio 2 המקשה לטפל לשלב עם מכשירי microfluidic. 6,20 לכן, מחצלות Tio 2 NF נוצלו לעתים רחוקות ביישומי bioanalytical, במיוחד אלה הדורשים תנאי כביסה קשים. במחקר זה, כדי להתגבר על המגבלות האלה, פיתחנו טכנולוגיה חדשה להעברת electrospun NF מחצלות על פני השטח של כל המצע היעד על ידי ניצול שכבת דבק דקה polydimethylsiloxane (PDMS). Furthermore, יש לנו בהצלחה הראה שילוב של טיו electrospun 2 NF מחצלות על גבי מכשיר microfluidic צנטריפוגלי פוליקרבונט (PC). שימוש במכשיר זה, זיהוי גבוה רגיש, אוטומטי לחלוטין, ומשולב של C-reactive protein (CRP) כמו גם טרופונין הלבבי אני (cTnI) הושג תוך 30 דקות מן רק 10 μL של דם מלא. 21 בשל בשילוב יתרונות של המאפיינים של NFS ואת פלטפורמת צנטריפוגלי, assay הציג טווח דינמי רחב של שישה סדרי הגודל מ 1 pg / ml (~ 8 FM) עד 100 ng / ml (~ 0.8 pM) עם גבול תחתון של זיהוי של 0.8 pg / ml (~ 6 FM) עבור CRP ומגוון דינמי מ -10 pg / ml (~ 0.4 pM) עד 100 ng / ml (~ 4 ננומטר) עם גבול הגילוי של 37 pg / ml (~ 1.5 pM) עבור cTnI. מגבלות זיהוי אלה ~ 300 ו ~ 20-לקפל תחתון בהשוואה לתוצאות ELISA הקונבנציונליות המתאימות. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לצורך זיהוי של כל חלבוני יעד, עם נוגדנים מתאימים. בסך הכל, שיתוף המכשיר הזהULD לתרום רבות חוץ גופית אבחון מבחני ביוכימיים כי הוא מסוגל לגלות כמויות נדירות של חלבונים היעד ברגישות רבה גם מכמויות קטנות מאוד של דגימות ביולוגיות, לדוגמה, 10 μl של דם מלא. למרות שאנחנו רק הוכחנו את זיהוי סרום חלבון באמצעות ELISA במחקר זה, טכנולוגית ההעברה והאינטגרציה של electrospun NFS עם מכשירי microfluidic יכולה להיות מיושמת באופן נרחב יותר בתגובות ביוכימיות אחרות הדורשים שטח פנים גדול עבור רגישות זיהוי גבוהה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Si wafer</td>
			<td>LG SILTRON</td>
			<td>Polished Wafer, test grade</td>
			<td>Dia. (mm) = 150, orientation = &#60;100&#62;, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (&#956;m) = 650 - 700</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate (PC)&#160;</td>
			<td>Daedong Plastic</td>
			<td>PCS#6900</td>
			<td>Thickness (mm) = 1 and 5&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium tetraisopropoxide, 98%,</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>205273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>437190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS and curing agent</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPDES</td>
			<td>Gelest Inc</td>
			<td>SIG5832.0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>J T Baker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FE-SEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Nova NanoSEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray photoelectron spectroscopy</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K-alpha</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D modeling machine</td>
			<td>M&#38;I CNC Lab, Korea</td>
			<td></td>
			<td>CNC milling machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax-dispensing machine</td>
			<td>Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea</td>
			<td></td>
			<td>Customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided adhesive tape</td>
			<td>FLEXcon, USA</td>
			<td>DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutting plotter</td>
			<td>Graphtec Corporation, Japan</td>
			<td>Graphtec CE3000-60 MK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>MIDAS</td>
			<td>SPIN-3000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Furnace (calcination)</td>
			<td>R. D. WEBB COMPANY</td>
			<td>WEBB 99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheometer (Tack test)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Haake MARS&#160;III - ORM Package</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma system</td>
			<td>FEMTO</td>
			<td>CUTE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse antihuman hsCRP</td>
			<td>Hytest Ltd., Finland</td>
			<td>4C28</td>
			<td>(clone # C5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-cTnI</td>
			<td>Hytest Ltd., Finland</td>
			<td>4T21</td>
			<td>(clone # 19C7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP</td>
			<td>Abcam plc., MA</td>
			<td>ab19175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI</td>
			<td>Abcam plc., MA</td>
			<td>ab24460</td>
			<td>(clone # 16A11)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsCRP</td>
			<td>Abcam plc., MA</td>
			<td>ab111647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cTnI</td>
			<td>Fitzgerald, MA</td>
			<td>30-AT43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Amresco Inc</td>
			<td>E404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes</td>
			<td>BD vacutainer</td>
			<td>367844</td>
			<td>K2 EDTA 7.2 mg plus blood 
			collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal ELISA femto</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>37074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular multilabel plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Envision 2104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disc operating machine</td>
			<td>Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea</td>
			<td></td>
			<td>Customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier tube (PMT)</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>H1189-210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD</td>
			<td>AutoDesk</td>
			<td>Version 2012</td>
			<td>Design software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks 3D CAD software&#160;</td>
			<td>SOLIDWORKS Corp.</td>
			<td>Version 2013</td>
			<td>3D Design software,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edgecam</td>
			<td>Vero software</td>
			<td>version 2009.01.06928</td>
			<td>Code generating software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeskCNC</td>
			<td>Carken Co.</td>
			<td>version 2.0.2.18</td>
			<td>CNC milling machine software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

שימוש בפרוטוקול זה, מכשיר microfluidic צנטריפוגלי אוטומטי לחלוטין לגילוי חלבון מן הדם כולו עם רגישות גבוהה הוכנה. מחצלות Tio 2 NF הוכנו על ידי תהליכים של electrospinning ו calcination. כדי לפברק את NFS של בקוטר הרצוי, מורפולוגיה, ועובי, electrospinning תנאים כגון קצב הזרימה, ?...

Watch this Scientific Journal Video about Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood at JoVE.com

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

האוטומטי לחלוטין צנטריפוגלי Microfluidic מכשיר לגילוי חלבון רגיש מן הדם מלא

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 &#181;L of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

fully-automated-centrifugal-microfluidic-device-for-ultrasensitive

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.4K Views.  School of Life Sciences, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST), UNIST-gil 50, Ulsan, Republic of Korea. This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Video: Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

מכשיר microfluidic ליצירה מחדש של גידול microenvironment<em&gt; במבחנה</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

מערבלים microfluidic ללימוד קיפול חלבונים

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

מכשיר microfluidic ללימוד זני Distinct מרובים

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

פלטפורמת microfluidic למדידת נויטרופילים Chemotaxis מדם מלא לא מעובד

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

פרוטוקול ליצירת biofilm Streamer במכשיר microfluidic עם מיקרו עמודים

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white blood cells and platelets that are suspended in blood plasma. Due to the abundance of the RBCs (40% to 45% of the blood volume), their behavior dictates the rheological behavior of blood especially in the microcirculation. At very low shear rates, RBCs are seen to assemble and form entities called aggregates, which causes the non-Newtonian behavior of blood. It is important to understand the conditions of the aggregates formation to comprehend the blood rheology in microcirculation. The protocol described here details the experimental procedure to determine quantitatively the RBC aggregates in microcirculation under constant shear rate, based on image processing. For this purpose, RBC-suspensions are tested and analyzed in 120 x 60 &#181;m poly-dimethyl-siloxane (PDMS) microchannels. The RBC-suspensions are entrained using a second fluid in order to obtain a linear velocity profile within the blood layer and thus achieve a wide range of constant shear rates. The shear rate is determined using a micro Particle Image Velocimetry (&#181;PIV) system, while RBC aggregates are visualized using a high speed camera. The videos captured of the RBC aggregates are analyzed using image processing techniques in order to determine the aggregate sizes based on the images intensities.

The protocol described details an experimental procedure to quantify Red Blood Cell (RBC) aggregates under a controlled and constant shear rate, based on image processing techniques. The goal of this protocol is to relate RBC aggregate sizes to the corresponding shear rate in a controlled microfluidic environment.

סביבת Microfluidic מבוקרת לדינמית חקירה של צבירת תאי דם האדום

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

ניתוח inhomogeneity ערבוב במכשיר microfluidic על ידי טכניקת microscale Schlieren

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

פוטו-ליתוגרפיה גובה רב שלבי משתנה עבור Valved רב שכבתי מכשירים microfluidic

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

פלטפורמת microfluidic עם איתור Multiplexed אלקטרוני למערכות מעקב מרחבית של חלקיקים

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...