נתמך בחלקו על ידי מענק המכון הלאומי לסרטן 1R03CA172923.

משפט ואתיקה: השימוש עכברים במחקר מקובל רק במקרים שבהם היא עשויה לקדם את ההבנה האנושית של ביולוגיה בסיסית או כלפי הטיפול הסופי של המחלה. סידור 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקבת רכישת C57BL / 6 עכברים (גיל 6 - 8 שבועות), 5 עכברים בכל קבוצה. אפשר מספר ימים העכברים להתאים. </li></ol> 2. הכנת תאים B16-BL6 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צלחות תרבית תאים מן החממה 37 מעלות ומניחים מכסה המנוע סטרילית. צלחות צריכות להיות כ 70% ומחוברות עם תאים מלנומה בעכברים-BL6 B16. מפגש גדול יותר יכול לשנות את תאי פוטנציאל גרורתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של 0.05% טריפסין- EDTA לכל צלחת, ולתת לשבת במשך 1 דקות, ולאחר מכן לשאוב את הפתרון טריפסין-מדיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של טריפסין לכל צלחת ולחזור צלחות בחממה במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המעבר את הצלחות מן החממה עד למכסה המנוע סטרילית, להוסיף 4 מ&quot;ל של Mediu מכון הזיכרון סרום ללא Rosewell פארקמ &#39;(RPMI) על כל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוספים את התאים עם פיפטה סטרילית, ממונע. הוצא תאים נגד בתחתית הצלחת, עם הקצה לחוץ בזווית מאוד קלה, כדי לשבור את התאים. חזור מספר פעמים על מנת להבטיח הפרדה נאותה של גושי תאים, אשר שאחרת סותמים את מחט הפליטה. לזכור ולהעביר צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש hemocytometer כדי לקבוע את צפיפות התאים. שמירה על המספר הכולל של תאים B16-BL6 מתמיד, לקבוע את עוצמת הקול של RPMI סרום ללא צורך להגיע ריכוזי הסופי של 0, 0.065, 0.015, 0.25, ו -0.5 מיליון תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לא פחות aliquot התקשורת בצינור 50 מ&quot;ל ל 15 מ&quot;ל צינורות חרוטי. בצנטריפוגה צינורות חרוטי 2,250 XG במשך 5 דקות. למזוג התקשורת. להוסיף נפח מתאים של RPMI סרום ללא ולאשר את צפיפות התאים הרצויים באמצעות hemacytometer. התאם densities- ידי הוספת נוספים RPMI או ספינינג resuspending בתוך volume- קטן בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 500 μlכל השעית תא לתוך שכותרתו 1.8 מיליליטר צינורות על קרח. </li></ol> הזרקת 3. זנב וריד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח עכבר, שבידי הזנב, ולהדריך אותו אחורי ואחת לתוך עוצר העכבר. עם פלג הגוף העליון בתא הראשי של העוצר, עם הזנב מחוץ לה, למשוך את העכבר לקראת הסוף העוצר. הכנס את הבוכנה עוצר, ממשיך לדחוף עד שהעכבר מאובטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את העכבר 90 מעלות כזה שאחד הוורידים הזנב לרוחב פונה מעלה. באמצעות כרית אלכוהול, במרץ לנקות את הצד של זנב העכבר, במיוחד כאשר וריד הזנב הוא בולט ביותר. הערה: תאורה טובה חיונית להדמיה וריד הזנב יעיל על עכברים B57BL / 6J. מנורות חימום או רפידות ניתוח מחומם, בעוד אין צורך, גם תעזורנה ידי הגדלת הנפח של וריד הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף תרבות סטרילי, לאסוף 300 μl של התקשורת בתרבות התא מהצינור 2 מיליון תאים / מ&quot;ל. הפוך את המחט, מצליף sIDE ודוחף את הבוכנה, כדי להוציא בועות מן המזרק. הוצא תרבות-RPMI כדי לגרום לנפח סופי של 250 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הארך את זנב העכבר עם היד הלא דומיננטית. החזק את הזנב עם הקצה הפרוקסימלי של הזנב מורם עם האצבע של היד הלא דומיננטית, ואת החלק הדיסטלי של הזנב מדוכא עם האגודל. הערה: בדרך זו, וריד הזנב מוחזק במצב לרוחב, במקביל לפני השטח העוצר, עם כניסה חופפת אפשרית בחלק דיסטלי יותר של הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט לוריד הזנב, לקראת סוף דיסטלי, בזווית כלפי מטה דקות מלכתחילה, ולאחר מכן להתאים את המחט כדי להתאים את הזווית של וריד הזנב עם החדרה נוספת (הורדת בוכנה סוף ביחס מזרק המחט) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט כ 1 ס&quot;מ לתוך וריד הזנב. לאחר החדרה, מתחיל לדחוף את הבוכנה, מחזיק את המחט יציבה. הערה: אם שהמחט נמצאת וריד הזנב ואת הקצה של המחט הוא not חסום התקשורת צריכה לזרום ללא הפרעה לווריד. הזרקה אפקטיבית מאופיינת אישור דם מהעורק. אם יש התנגדות, או בועה מתחילה להיווצר באתר ב ההזרקה, להוציא את המחט ולנסות שוב בבאתר הפרוקסימלי יותר לאורך וריד הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המחט מן הווריד וזורק אותו. החזק גזה נגד אתר הכניסה לעצור דימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבוכנה מן העוצר ומניח את העכבר בכלוב הנמען. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה עבור כל ריכוזי אחרים. הערה:. הקמת מוקדי ריאות לוקח כ 2 - 3 שבועות, עם השתנות בהתאם שורת התאים לגודל הרצוי של מוקדים 9 בינתיים, עכברים צריך להיות פיקוח על סימפטומים שיכלו להצדיק המתת חסד מוקדם, כמו נשימות כבדות. </li></ol> 4. ספירת מוקדי הריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר על ידי צבת בתא CO 2 וחשיפה ל -100% CO 2 </sUB&gt; הציג 10-30% של נפח תא לדקה למשך 5 דקות. עקוב עם נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פשוק את העכבר על קלקר. בעזרת מספריים כירורגיות, ליצור חתך ניתוחי לאורך עצם החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות שני חתכים נוספים, הוא מהחלק העליון של חתך עצם חזה הסתעפות לכיוון הכתפיים של העכבר, חשיפת כלוב הצלעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות שני חתכים, אחד לאורך הצדדים לרוחב החזה, כדי להסיר את כלוב הצלעות מהגוף, חשיפת הריאות והלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את הלב עם פינצטה כירורגית, לחתוך את הוושט ואת קנה הנשימה, לשחרר את הלב והריאות מן העכבר. מניחים מתחת מיקרוסקופ לנתח, בהגדלה 10X, להדמיה טובה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח בלב מהריאות ולהסיר התימוס, עוזב את הריאות רק שתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הריאות מתחת היקף הניתוחים, מתחילים לספור את מוקדי ריאות. כל מוקדים אמורים להופיע בתור obtrusion עגול, חום על פני השטח של הריאות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקביות בין עכברים, לספור את מספר מוקדים על פני השטח של אונה, ולאחר מכן להפוך באונה זה. עושה כל אחד מארבע האונות בנפרד מאפשר ספירה קלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור ולתקן את הריאות אם ביצוע IHC, אחרת, ולזרוק את השאריות. </li></ol>

<ol>
	<li>Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perspective+on+cancer+cell+metastasis.">A perspective on cancer cell metastasis.</a> Science. 331, 1559-1564 (2011).</li><li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition.">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> J Clin Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).</li><li>Stetler-Stevenson, W. G., Aznavoorian, S., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+interactions+with+the+extracellular+matrix+during+invasion+and+metastasis.">Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis.</a> Annu Rev Cell Biol. 9, 541-573 (1993).</li><li>Allard, W. J., Matera, J., Miller, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+disease.">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant disease.</a> Clin Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li><li>Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunoediting:+from+iimmunosurveillance+to+tumor+escape.">Cancer immunoediting: from iimmunosurveillance to tumor escape.</a> Nat Immunol. 3, 991-998 (2002).</li><li>Hugo, H., Ackland, M. L., Blick, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+and+mesenchymal-epithelial+transition+in+carcinoma+progression.">Epithelial-mesenchymal and mesenchymal-epithelial transition in carcinoma progression.</a> J Cell Physiol. 213, 374-383 (2007).</li><li>Kang, Y., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions:+Twist+in+development+and+metastasis.">Epithelial-mesenchymal transitions: Twist in development and metastasis.</a> Cell. 118, 277-279 (2004).</li><li>Hodi, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+with+Ipilimumab+in+patients+with+metastatic+melanoma.">Improved survival with Ipilimumab in patients with metastatic melanoma.</a> NEJM. 363 (13), 711-723 (2002).</li><li>Ekwueme, D. U., Guy, G. P., Li, C., Rim, S. H., Parelkar, P., Chen, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+health+burden+and+economic+costs+of+cutaneous+melanoma+motality+by+race/ethnicity-United+States.">The health burden and economic costs of cutaneous melanoma motality by race/ethnicity-United States.</a> J. Am. Acad. Dermatol. 65, 133-143 (2011).</li><li>Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+review:+from+bench+to+bedside.">Metastasis review: from bench to bedside.</a> Tumor. Bio.Volume. 35, 8483-8523 (2014).</li><li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+metastasis+predetermined.">Is metastasis predetermined.</a> Mol. Oncol. 1 (3), 263-264 (2007).</li><li>Ishiguro, T., Nakajima, M., Naito, M., Muto, T., Tsuruo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+differentially+expressed+in+B16+murine+melanoma+sublines+with+different+metastatic+potentials.">Identification of genes differentially expressed in B16 murine melanoma sublines with different metastatic potentials.</a> Cancer Res. 56 (4), 875-879 (1996).</li><li>Clark, E. A., Todd, R. G., Lander, E. S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+metastasis+reveals+an+essential+role+for+RhoC.">Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC.</a> Nature. 406, 532-535 (2000).</li><li>Terranova, V. P., Hic, S., Diflorio, R. M., Lyall, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+metastasis.">Tumor cell metastasis.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 5 (2), 87-114 (1986).</li><li>Elkin, M., Vlodavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tail+vein+assay+of+cancer+metastasis.">Tail vein assay of cancer metastasis.</a> Curr Protoc in Cell Biol. , (2001).</li><li>Hagedorn, H. G., Bachmeier, B. E., Nerlich, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+degradation+of+basement+membranes+and+extracellular+matrix+and+their+regulation+by+TGF-beta+in+invasive+carcinomas+(Review).">Synthesis and degradation of basement membranes and extracellular matrix and their regulation by TGF-beta in invasive carcinomas (Review).</a> Int. J. Oncol. 18 (4), 669-681 (2001).</li><li>Hart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selection+and+characterization+of+an+invasive+variant+of+the+B16+melanoma.">The selection and characterization of an invasive variant of the B16 melanoma.</a> Am J Pathol. 97 (3), 587-600 (1979).</li><li>Overwijk, W. W., Restifo, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N.P.+B16+as+a+Mouse+Model+for+Human+Melanoma.">N.P. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma.</a> Curr Protoc Immunol. 20 (1), (2001).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תאים סרטניים במחזור מתוך הזרקה לוריד זנב לייצג את הגרורות כי להתחמק אתרים של צמיחה עיקרית ולהעביר דרך נתיבים כמו מחזור הדם או מערכת הלימפה, מדי פעם ומתבסס על המיטות נימי של למקומות מרוחקים. 14 הפרוטוקול המתואר לעיל משמש כמודל עבור משני גרורות. עם מספר אופטימלי של תאי B16-BL6 המוזרק, הנסיינים יכולים לקבוע את ההשפעה היחסית של תרופה מנוהלת או אוכלוסיית תא חיסון, שלאחר ניטרול, על גרורות של תאים סרטניים. פרוטוקול זה יש מגבלות. תאי הגידול במחזור נבחרו על יכולותיהם הגרורות ולכן הם בלתי immunogenic, שיש רמות נמוכות של 1 מולקולות מורכבות המרכזי histocompatibility בכיתה. 12 יתר על כן, את ההקדמה הפתאומית באשכול של מספר רב של גרורות היא בניגוד התרחיש האופייני בחולים שם מספר קטן של תאים סרטניים עם גרורותלהפיג פני תקופה ממושכת של זמן ממיקום הגידול הראשוני. בנוסף, התאים הסרטניים לוריד הציגו הן מתרבות רקמות ולא ממקור גידול ראשוני. לכן, תאים אלה הם בניגוד הגרור מהשניים הנובעים שינויי הידבקות תא, הגירה, הכרה חיסונית ומערכת איבר נמען. 15,16 פרוטוקול חלופי יהיה הזרקה תת עורית של B16 / BL6 עבור הדור של גידולים ראשוניים ועל ניתוח של ריאתי גרורות &quot;ספונטנית&quot; שהתקבל. אלה &quot;ספונטנית&quot; גרורות נמצאו להכיל יותר הטרוגניות מאשר עמיתיהם &quot;ניסיוני&quot; שלהם, יותר שלהן תואמות לאלה של חולים אנושיים. הפרוטוקול הגבלה ביכולתה לקבוע את ההשפעה של תרכובת ניסיוני על גרורות. עם הזרקה לוריד זנב לרוחב, מספר תאים מלנומה מוזרקים לתוך זרם הדם יכול להיות מקורב באמצעות hemocytometer. עם גרורות &quot;ספונטניות&quot;, לעומת זאת, ישן הטרוגניות רבה בין גידולים, הוספת משתנה נוסף למספר וכתוצאה מכך מוקדי ריאות. 16 לסיכום, המודל מלנומה בעכברים B16-BL6 וריד הזנב מהווה מודל פשוט לקביעת ההשפעה של טיפול או טיפול חיסוני על גרורות. על ידי לוריד הזרקת תאים סרטניים במחזור, חוקרים יכולים לשכפל, במידה מסוימת, חולים לאחר גרורות. שוקל את ההשפעות ההרסניות של תאים סרטניים גרורתי בין חולי סרטן, מודל זה הוא כלי רב עוצמה להבנת תהליך רב שלבי של גרורות.

גרורה היא אחד הגורמים העיקריים למוות בקרב חולים עם ממאירויות. תהליך הפצת גרורתי של תאים סרטניים הוא הבין היטב אך נראה לערב כמה צעדים, כולל פלישה של הרקמות הסמוכות, intravasation לתוך lymphatics ואת כלי הדם, הישרדות טרנסלוקציה בתוך מערכת הדם, extravasation מן כלי הדם באתר של גרורות, הסתגלות אל המיקרו-הסביבה החדשה של האתר החדש, וההתנחלות באתר החדש על ידי התפשטות היווצרות של גידולים משניים. 1 כל אחד אירועים ביולוגיים אלה כרוכים תאי טרנספורמציה, ההפצה וההישרדות של גידול גרורתי. לדוגמא, את הטרנספורמציה של פנוטיפ אפיתל של התאים הסרטניים לתוך פנוטיפ mesenchymal, יחד עם האינטראקציה המוצלחת עם מטריקס, לאפשר להם לפלוש לרקמות סמוכות ולשלוח גרורות לחלקים אחרים של הגוף. 2,3 זאת ועוד, גרורתי אלה תאיםחייב לשרוד בתוך הדם במחזור להתחמק מעקב חיסוני מהמארח. 4,5 לבסוף, כאשר מושתלים באתר מרוחק בגוף, תאי הגידול חייבים להסתגל microenvironment שלהם כדי להתרבות וליצור גידולים משניים. 6,7 לכן , אם כי גרורות היא תופעה נפוצה בקרב חולי סרטן, יש תאים סרטניים עם גרורות באזורים מרובים של פגיעות כי ניתנים התערבות טיפולית. בהתחשב באופי של מלנומה immunogenic, ואת הריבית האחרונות immunotherapies, מודלים למלנומה מועילים יותר ויותר. 8 בארצות הברית לבדה, מלנומה הוא הגורם של 9,000 מקרי מוות בשנה. 9 המיקומים הנפוצים של גרורות מלנומה עצמות, מוח , כבד וריאות. רוב גרור לאתרים מרוחקים להתרחש דרך מחזור הדם. תאים סרטניים במחזור בדם חייב להתחמק אישור חיסון, להגיע למיטת נימים של איבר דיסטלילפלוש דרך תאי האנדותל של כלי הדם על מנת לבסס את עצמם בהצלחה. 4-7,10, 11 כדי לחקות את לתופעה שכיחה ארסית של גרורות, שורת תאים בעכברים B16-BL6 נוצר. המנוחה של הקו הסלולרי מלנומה הורית C57BL / 6 B16-F0, B16-BL6 הוא התוצר הסופי של 10 בחירות רצופות עבור גרורות ריאה מן הזרקה תוך ורידית (וכתוצאה מכך B16-F10), ואחריו 6 בחירות רצופות לחדירה קרום השלפוחית. 12 ככזה, הוא קו התא מלנומה אמין להקמת מוקדי גרורתית העכבר, במיוחד כאשר הוא מוזרק לווריד. 13 לאחר הזרקה של כמות מספקת של תאי B16-BL6 לווריד הזנב של העכבר B57BL / 6, ואחריו שבועיים או יותר כדי לאפשר השתלה וצמיחה של תאים B16 / BL6, מוקדים גרורתי יהוו בתוך הריאות. לאחר המתת חסד ובדיקה על ידי מיקרוסקופ לנתח, מספרניתן לכמת כיום מוקדים בודדים. זה, בתורו, יכול לשמש כדי להקים אפקט מנה-גרור, כמו את מספר תאי B16-BL6 מוזרקים בקורלציה עם מספר המוקדים נוצרו על פני השטח של הריאות. מודל זה ידוע בשם &quot;גרורות ניסיון,&quot; שבו תאים-גרורתי ידועה מוצגים ישירות לתוך זרם הדם, להקל על התפשטות מהירה וצפויה והקמה של הריאות, הכבד, או אורגן אחר של חקירה. זאת בניגוד ל &quot;גרורות ספונטניות,&quot; שבו תאים סרטניים מושתלים, לעתים קרובות מתחת לעור, וגרורות מקורן אורגני לשפוך תאים סרטניים. 14,15 חשוב להזריק כמות מתאימה של תאי B16 / BL6 לתוך ורידי הזנב של העכברים. יותר מדי, ואת הריאות תכוסינה עם גרורות ומוקדי שכנות יהיו נבדלים אחד אחרת. מעט מדי, ואת ההשפעה של סוכן טיפולי תהיה סמויה עקב Vari טמוןations בין זריקות. על מנת לקבל מספר אופטימלי של מוקדים על הריאות של C57BL / 6 עכברים, יש צורך לתאם את מספר התאים הוזרקו בכמות מוקדים גרורתי, שהתבססו על משטח של הריאות תוך לקיחה בחשבון את distinguishability של הפרט מוקדים. פרוטוקול זה יהיה להדגים מודל מלנומה בעכברים גרורתי לעכברים C57BL / 6.

<table><tbody><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Corning</td><td>MT15040CM</td><td></td></tr><tr><td>Phase Contraast Hemacytometer</td><td>Hausser</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Fine IV Insulin Syringes</td><td>BD</td><td>14-829-1D</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Alcohol Prep Pads</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Restrainer</td><td>Braintree Scientific</td><td>NC9999969</td><td>Restrainer choice depends on age/size of mice</td></tr><tr><td>Heating Pad</td><td>Harry Schein</td><td>NC0012697</td><td>Optional</td></tr></tbody></table>

injection of syngeneic murine melanoma cells to determine their metastatic potential in the lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

לאחר הבדיקה חזותית, וריאצית מוקדי שטח ניכרת. ספירת מספר הגידולים תחת מיקרוסקופ לנתח אמורה להניב קשר לינארי בין מספר תאים סרטניים מוזרקים והמספר שהתקבל מוקדי ספיר. שימוש המספר האופטימלי של תאים להזרקה, המטרה היא אחד שבו הריאות אינן מכוסות לגמרי, כפי שהם 500,000 תאים / מ&quot;ל באיור 1 א &#39;, ולא מכוסה גם בדלילות, כפי שהם 62,500 תאים / מ&quot;ל ו 125,000 תאים / מ&quot;ל. זהו גם לכימות על ידי קשר לינארי (איור 1B). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54039/54039fig1.jpg" /> איור 1. מוקדי ריאות כתוצאה מן וריד הזנב מוזרק B16 / BL6 תאים. (א) מוקדי ריאות ניתן דמיינו על פני השטח של ריאות מעכברי C57BL / 6 כפי המונים עגולים חומים (מוקדי נציג תחת חיצים). כמו מאורותity של תרבית תאים מוזרק (מעל כל תמונה) גדל, כך גדל גם מספר המקביל וכתוצאה מכך מוקדים ריאות (מתחת לכל תמונה). הריאות מן העכבר עם הצפיפות הגבוהה של תאים מוזרקים יש הסיקור החזותי הגדול של מוקדי ריאות. ברי סולם מייצגים 20 מ&quot;מ. (ב) ספירה יחסית מוקדי ריאות לצפיפות תרבית תאים. קיים יחס לינארי כ מעל 125,000 תאים / מ&quot;ל, כפי שנקבע על ידי hemacytometer. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54039/54039fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs at JoVE.com

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

הזרקה של תאים syngeneic Murine מלנומה מנת לקבוע את פוטנציאל גרורתי שלהם בתוך הריאות

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

injection-syngeneic-murine-melanoma-cells-to-determine-their

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

17.6K Views.  Beth Israel Deaconess Medical Center & Harvard Medical School. Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

Video: Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

גרורה ניסויית Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

שימוש משולב של הזנב וריד גרורה Assays ובזמן אמת ב Vivo הדמיה כדי לכמת מושבת סרטן השד ונטל בריאות

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Cancer Research

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Analysis of Lymph Node Volume by Ultra-High-Frequency Ultrasound Imaging in the Braf/Pten Genetically Engineered Mouse Model of Melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a primary tumor has been induced by tamoxifen treatment, an increase in metastatic burden is observed within 4-6 weeks after induction. This paper shows how Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) imaging can be exploited to monitor the increase in metastatic involvement of the inguinal lymph nodes by measuring the increase in their volume.
The UHFUS system is used to scan anesthetized mice with a UHFUS linear probe (22-55 MHz, axial resolution 40 &#181;m). B-mode images from the inguinal lymph nodes (both left and right sides) are acquired in a short-axis view, positioning the animals in dorsal recumbency. Ultrasound records are acquired using a 44 &#181;m step size on a motorized mechanical arm. Afterward, two-dimensional (2D) B-mode acquisitions are imported into the software platform for ultrasound image post-processing, and inguinal lymph nodes are identified and segmented semi-automatically in the acquired cross-sectional 2D images. Finally, a total reconstruction of the three-dimensional (3D) volume is automatically obtained along with the rendering of the lymph node volume, which is also expressed as an absolute measurement.
This non-invasive in vivo technique is very well tolerated and allows the scheduling of multiple imaging sessions on the same experimental animal over 2 weeks. It is, therefore, ideal to assess the impact of pharmacological treatment on metastatic disease.

Melanoma is a very aggressive disease that quickly spreads to other organs. This protocol describes the application of ultra-high-frequency ultrasound imaging, coupled with 3D rendering, to monitor the volume of the inguinal lymph nodes in the Braf/Pten mouse model of metastatic melanoma.

ניתוח נפח בלוטות הלימפה על ידי הדמיית אולטרסאונד בתדר גבוה במיוחד במודל העכבר המהונדס גנטית Braf /Pten של מלנומה

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

מודל Murine orthotopic של אדם סרטן ערמונית גרורה

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was established using robust, reproducible in vivo models and standardized methods to identify novel players in melanoma metastasis. This approach allows for data inference at specific experimental stages to precisely characterize a gene's role in metastasis. Models are established by introducing genetically modified melanoma cells via intracardiac, intradermal, or subcutaneous injections into mice, followed by monitoring with serial in vivo imaging. Once preestablished endpoints are reached, primary tumors and/or metastases-bearing organs are harvested and processed for various analyses. Tumor cells can be sorted and subjected to any of several 'omics' platforms, including single-cell RNA sequencing. Organs undergo imaging and immunohistopathological analyses to quantify the overall burden of metastases and map their specific anatomic location. This optimized pipeline, including standardized protocols for engraftment, monitoring, tissue harvesting, processing, and analysis, can be adopted for patient-derived, short-term cultures and established human and murine cell lines of various solid cancer types.

This article describes a workflow of techniques employed for testing novel candidate mediators of melanoma metastasis and their mechanism(s) of action.

פלטפורמת גילוי חזקה לזיהוי מתווכים חדשים של גרורות מלנומה

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was ...

In Vivo Imaging to Measure Spontaneous Lung Metastasis of Orthotopically-injected Breast Tumor Cells

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple opportunities for therapeutic intervention, and the ability to accurately model them in mice is critical to evaluate their effects. Here, a step-by-step protocol is presented for the establishment of orthotopic primary breast tumors and the subsequent monitoring of the establishment and growth of metastatic lesions in the lung using in vivo bioluminescence imaging. This methodology allows for the evaluation of treatment or its biological effects along the entire range of metastatic development, from primary tumor escape to outgrowth in the lungs. Breast orthotopic tumors are generated in mice via injection of a luciferase-labeled cell suspension in the 4th mammary gland. Tumors are allowed to grow and disseminate for a specific amount of time and are then surgically resected. Upon resection, spontaneous lung metastasis is detected, and the growth over time is monitored using in vivo bioluminescence imaging. At the desired experimental endpoint, lung tissue can be collected for downstream analysis. The treatment of established, clinically evident metastasis is critical to improve outcomes for stage IV cancer patients, and it can be evaluated through tail vein models of experimental lung metastasis. However, metastatic dissemination occurs early in breast cancer, and many patients have latent, subclinical disseminated disease after surgery. Utilization of spontaneous models such as this one provides the opportunity to study the whole spectrum of the disease, especially the systemic effects driven by treatment of the primary tumor such as pre-metastatic niche priming, and evaluate treatments on dormant and subclinical disease after surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>In Vivo Imaging למדידת גרורות ריאה ספונטניות של תאי גידול שד בהזרקה אורתוטופית

The manuscript describes a methodology for the establishment as well as longitudinal growth monitoring of spontaneous lung metastasis from orthotopically-injected breast tumors, amenable to intervention at all stages of the metastatic cascade.

ב Vivo הדמיה למדידת גרורות ריאה ספונטניות של תאי גידול שד בהזרקה אורתוטופית

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

Ex vivo הדמיה חיה של ריאות גרורה microenvironment שלהם

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

הזרקה של תאים syngeneic Murine מלנומה מנת לקבוע את פוטנציאל גרורתי שלהם בתוך הריאות

Summary

Explore More Videos

גרורה ניסויית Assay

שימוש משולב של הזנב וריד גרורה Assays ובזמן אמת ב Vivo הדמיה כדי לכמת מושבת סרטן השד ונטל בריאות

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

ניתוח נפח בלוטות הלימפה על ידי הדמיית אולטרסאונד בתדר גבוה במיוחד במודל העכבר המהונדס גנטית Braf /Pten של מלנומה

מודל Murine orthotopic של אדם סרטן ערמונית גרורה

פלטפורמת גילוי חזקה לזיהוי מתווכים חדשים של גרורות מלנומה

ב Vivo הדמיה למדידת גרורות ריאה ספונטניות של תאי גידול שד בהזרקה אורתוטופית

ב Vivo הדמיה למדידת גרורות ריאה ספונטניות של תאי גידול שד בהזרקה אורתוטופית

גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה

Ex vivo הדמיה חיה של ריאות גרורה microenvironment שלהם