Name: selective harvesting of marginating-hepatic leukocytes
Uploaded: 2016-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes at JoVE.com

The authors and this work were supported by NIH/NCI grant # R01CA172138 (to SBE).

משפט ואתיקה: הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) באוניברסיטת תל-אביב. 1. חולדות פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכשירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן heparinized PBS (30 יחידות / מ&quot;ל) פתרון לשמש בטמפרטורת החדר (RT) על ידי הוספת 30 יחידות של הפרין בחינם משמר לכל מ&quot;ל של בופר פוספט (PBS) פתרון 1x. חישוב 35 מ&quot;ל לכל חיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור heparinized PBS מבעד לקווי משאבת peristaltic ואת מחטי הפרפר לחסל בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר כלים כירורגיים - 2 זוגות מספריים, מלקחיים קהי פיפיות, 2 hemostats, מלקחי שן-רקמות (חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות על כוח משיכה (יבשה) הגדרה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף של הכבד והגבייה-לויקוציטים MH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדימו ממנת יתר של isoflurane 8%. כאמצעי זהירות, להציב צינור 50 מ&quot;ל המכיל isofluraneכרית -soaked סביב ראש העכברוש עד פתיחת בית החזה שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חללי הצפק וחזה כדי לחשוף את הכבד ואת מורכבות לב-ריאה מייד עם הפסקת הנשימה. למנוע דימום דרך התהליך הזה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ספציפי, להתחיל את החתך בנקודת קו אמצע הבטן התחתונה, ללא איברים פנימיים מזיקים, והתקדמות לשני הצדדים באלכסון לכיוון הצלעות, חיתוך דרך אותם לרמות חזה החלל העליונות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך כ דקות, לאסוף דם רב ככל האפשר (~ 6 מ&quot;ל מבעל חיים 250 גרם) מן החדר הימני לתוך מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את הווריד הנבוב הזנב עם hemostat קרוב ככל האפשר אל הלב, כדי לאפשר גביית perfusate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את המעיים ומקום מחוץ החיה בצד ימין של הנסיין, כדי לחשוף את וריד השער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קטטר G IV 25, מחובר משאבת peristaltic, לתוך וריד השער, כמו זנב ככל האפשר,אבל מקורי וריד הטחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט פרפר 25 G, מחובר מזרק 5 מ&quot;ל, לתוך הווריד הנבוב נחות, הזנב אל hemostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה peristaltic במהירות של כ 3 מ&quot;ל / דקה בעדינות לאסוף את מ&quot;ל הראשון של perfusate כי הם מזוהמים עם דם לתוך המזרק. המשך עד שהצבע perfusate הוא מחוויר אדום (כ 3-5 מ&quot;ל). שימו לב שצבע הכבד משתנה לכיוון חום בהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבלי לעצור את המשאבה peristaltic, להחליף את המזרק קציר 5 מ&quot;ל עם מזרק קציר 20 מ&quot;ל ולאסוף לפחות 20 מ&quot;ל של perfusate הכבד העסקת מהירות גבוהה יותר של זלוף (עד 4 מ&quot;ל / דק &#39;). לפקח באופן רציף את זרימת perfusate לתוך מזרק האיסוף, ולהימנע ואקום כי הוא חזק מדי (אשר עשוי לסתום את המחט דרך קורסת קירות הווריד הנבוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים זלוף כאשר הצבע של הכבד פונה חום בהיר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקה לויקוציטים <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה perfusate במשך 10 דקות ב 400 XG, 24 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל PBS, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10 דקות, ולאחר לשאוב supernatant. בהתבסס על מטרות מחקר, להשתמש בתכשיר כמו שהוא, או לנהל purifications נוסף (למשל, פרידת שיפוע צפיפות). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ספציפי, שכבה 4 מ&quot;ל של perfusate מעל 4 מ&quot;ל של המונית ההפרדה-שיפוע צפיפות בתוך שפופרת צנטריפוגות פוליפרופילן 50 סמ&quot;ק. ספין צינורות ב 754 XG, RT, למשך 30 דקות עם לנתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את שכבות mononuclear בממשק ההפרדה-supernatant צפיפות שיפוע ידי pipetting ידנית, לשטוף ב- PBS, ולהכניס לתוך צינור 5 מ&quot;ל. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. עכבר פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכשירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן heparinized PBS (30 יחידות / מ&quot;ל) פתרון לשמש בטמפרטורת החדר (RT) על ידי הוספת 30 יחידות של הפרין בחינם משמר לכל מ&quot;ל של בופר פוספט (PBS) 1x solution. חישוב 20 מ&quot;ל לכל חיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור heparinized PBS מבעד לקווי משאבת peristaltic ואת מחטי הפרפר לחסל בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר כלים כירורגיים - 2 זוגות מספריים, מלקחיים קהי פיפיות, 2 hemostats, מלקחי שן-רקמות (חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות על כוח משיכה (יבשה) הגדרה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף של הכבד אוסף של MH-Leukocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדימו ממנת יתר של isoflurane 8%. כאמצעי זהירות, להציב צינור 15 מ&quot;ל המכיל כרית ספוג isoflurane סביב הראש העכבר עד פתיחת בית החזה שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הגפיים של העכבר למיטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חללי הצפק וחזה כדי לחשוף את הכבד ואת מורכבות לב-ריאה מייד עם הפסקת הנשימה, שמירה על ההיבט הנמוך של הסרעפת ללא פגע (כדי ליצור מאגר חלל חזה ניקוז). למנוע דימום דרך התהליך הזה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ספציפי, להתחיל את החתך לפי הנמוךנקודת קו אמצע בטן, ללא איברים פנימיים מזיקים, והתקדמות לשני הצדדים באלכסון לכיוון הצלעות, חיתוך דרך אותם לרמות חזה החלל העליונות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נסיגת המעיים והמקום מחוץ חית זכותו של הנסיין, כדי לחשוף את וריד השער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט 30 גרם, מחוברת משאבה peristaltic לתוך מקורי פורטל וריד אל וריד הטחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הווריד הנבוב הנח מעל הסרעפת כדי לאפשר ניקוז ואיסוף של perfusate מחלל החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה peristaltic במהירות של כ 3 מ&quot;ל / דקה בעדינות לאסוף את perfusate 3 מ&quot;ל של הראשון כי הם מזוהמים עם דם ממאגר חלל החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל perfusate זה. חזור כביסה כזה שוב במידת הצורך, באמצעות מלוחים, ורק אז להתחיל לאסוף perfusate הכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל מחדש את זלוף במהירות של עד 4 מ&quot;ל / דק &#39;, ולאסוף 10 מ&quot;ל של perfusate מחלל החזה באמצעותפרפר מחובר מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים זלוף כאשר הצבע של הכבד פונה חום בהיר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקה לויקוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה perfusate במשך 10 דקות ב 400 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל PBS, צנטריפוגות ב 400 XG במשך 10 דקות, ולאחר לשאוב supernatant בהתבסס על מטרות המחקר, להשתמש בתכשיר כפי שהוא, או לנהל purifications נוספים (למשל, פרידה שיפוע צפיפות). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ספציפי, שכבה כל 4 מ&quot;ל של perfusate מעל 4 מ&quot;ל של המונית ההפרדה-שיפוע צפיפות בתוך שפופרת צנטריפוגות פוליפרופילן 50 סמ&quot;ק. ספין צינורות ב 754 XG, RT, למשך 30 דקות עם לנתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את שכבות mononuclear בממשק ההפרדה-supernatant צפיפות שיפוע ידי pipetting ידנית, לשטוף ב- PBS, ולהכניס לתוך צינור 5 מ&quot;ל. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats:+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells.">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li><li>Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+mice+exhibits+increased+NK+cytotoxicity+and+unique+cellular+characteristics.">The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics.</a> Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).</li><li>Wisse, E., van't Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pit+cell:+description+of+a+new+type+of+cell+occurring+in+rat+liver+sinusoids+and+peripheral+blood.">The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood.</a> Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).</li><li>Vermijlen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+natural+killer+cells+exclusively+kill+splenic/blood+natural+killer-resistant+tumor+cells+by+the+perforin/granzyme+pathway.">Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway.</a> J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).</li><li>Gao, B., Radaeva, S., Park, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+natural+killer+and+natural+killer+T+cells:+immunobiology+and+emerging+roles+in+liver+diseases.">Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases.</a> J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).</li><li>Kaneda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-associated+large+granular+lymphocytes:+morphological+and+functional+aspects.">Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects.</a> Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).</li><li>Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+central+role+of+perforin+in+cytolysis?.">A central role of perforin in cytolysis?.</a> Annu Rev Immunol. 9, 129-157 (1991).</li><li>Kamada, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+carboxypeptidase+and+tryptic+esterase+activities+that+are+complexed+to+proteoglycans+in+the+secretory+granules+of+human+cloned+natural+killer+cells.">Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells.</a> J Immunol. 142, 609-615 (1989).</li><li>Wisse, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+function+of+pit+cells,+the+liver-specific+natural+killer+cells.">On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells.</a> Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).</li><li>Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+granular+lymphocytes+or+&amp;#34;pit+cells&amp;#34;+from+rat+liver:+isolation,+ultrastructural+characterization+and+natural+killer+activity.">Large granular lymphocytes or &amp;#34;pit cells&amp;#34; from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity.</a> Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).</li><li>Vanderkerken, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+differentiation+of+hepatic+natural+killer+cells+(pit+cells).">Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells).</a> Hepatology. 18, 919-925 (1993).</li><li>Luo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+adhesion+molecules+in+the+recruitment+of+hepatic+natural+killer+cells+(pit+cells)+in+rat+liver.">The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver.</a> Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).</li><li>Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+and+lymphokine-activated+killer+cells+require+granzyme+B+for+the+rapid+induction+of+apoptosis+in+susceptible+target+cells.">Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).</li><li>Luo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+LFA-1+in+hepatic+NK+cell+(pit+cell)-mediated+cytolysis+and+apoptosis+of+colon+carcinoma+cells.">Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells.</a> J Hepatol. 31, 110-116 (1999).</li><li>Wiltrout, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmentation+of+mouse+liver-associated+natural+killer+activity+by+biologic+response+modifiers+occurs+largely+via+rapid+recruitment+of+large+granular+lymphocytes+from+the+bone+marrow.">Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow.</a> J Immunol. 143, 372-378 (1989).</li><li>Schluter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+metastatic+tumor+cell+adhesion+and+extravasation+of+colon+carcinoma+cells+with+different+metastatic+potential.">Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential.</a> Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).</li><li>Wiltrout, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmentation+of+organ-associated+natural+killer+activity+by+biological+response+modifiers.+Isolation+and+characterization+of+large+granular+lymphocytes+from+the+liver.">Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver.</a> J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).</li><li>Winnock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+liver-associated+lymphocytes+in+patients+with+liver+metastasis.">Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis.</a> Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).</li><li>Hata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+phenotyping,+and+functional+analysis+of+lymphocytes+from+human+liver.">Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver.</a> Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).</li><li>Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+phenotypically+and+functionally+distinct+subset+of+large+granular+lymphocytes+(pit+cells)+in+rat+liver+sinusoids.">Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids.</a> Hepatology. 12, 70-75 (1990).</li><li>Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2015).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

שיטת זלוף הכבד המוצגת כאן מאפשרת קצירת סלקטיבית ולומדים של האוכלוסייה הייחודית של marginating לויקוציטים כבד. תאים כבדיה NK, המכונים גם בורים תאים 3, מהווים אוכלוסיית תא NK ייחודית מתגוררות sinusoids הכבד. הם נמצאים אצל חולדות, עכברים 17 ובבני אדם 18,19. לעומת תאים ?...

הכבד sinusoids מכיל תת לויקוציטים רבים של פעילויות שונות חיסון קריטיות האורגניזם. לדוגמה, marginating הכבד (MH) הרג טבעיים (NK) תאים, הידוע גם בשם תאים בור, מאופיינים מורפולוגית לימפוציטים פרטנית גדול (LGLs) והן מבחינה תפקודית כמו לויקוציטים עם קיבולת ציטוטוקסיות ספונטנית, מה שמאפשר בכבד התנגדות נגד הקמת דם גרורות גידול מובל. מטרת השיטה המוצגת כאן היא לאפשר קצירת סלקטיבית של לויקוציטים MH, כדי ללמוד אוכלוסיית תאים חשוב וייחודי זה (תא החיסון), וכדי להבהיר את ההשפעה של מניפולציות שונות (הפעלה חיסונית למשל) על תאים ספציפיים אלה. למרות הכישלון של חסינות לחסל גידול ראשוני בפיתוח, ראיות חולות סרטן במודלים של בעלי החיים עולות כי מערכת החיסון יכולה לשלוט במחזור תאים סרטניים, micrometastases, ומחל שיורית throuתא בתיווך GH חסין (CMI). עם זאת, קיימת אי התאמה לכאורה בין אלה יכולות vivo ו במבחנה בבני אדם ובחיות, שיש בהם כדי להעיד כי רוב תאי הגידול עצמיים עמידים cytotoxicity ידי מחזורי או לויקוציטים הטחול 1,2. חוסר עקביות זה ניתן לייחס, לפחות חלקית, על קיומה in vivo של תת-אוכלוסייה לויקוציטים ברורה, כלומר בכבד marginating (sinusoids) לויקוציטים-אוכלוסייה שלהם של תאי NK מופעלים, כלומר תאים בורים 3. ואכן, נתונים שלא פורסמו מהמעבדה שלנו הראו כי אצל חולדות F344 תאים סרטניים syngeneic (MADB106), אשר נמצאו עמידים לויקוציטים במחזור הטחול, היו lysed ידי תאים MH-NK 4. לכן, תאים סרטניים, כי הם לכאורה &quot;NK עמידים&quot; כדי לויקוציטים במחזור עשוי להיות נשלט על ידי תאים MH-NK. ראויים לציון, בעכברים פעילות מוגברת של MH-NK ניכרת רק לאחר in vivo החיסוניתגירוי (למשל באמצעות שימוש לי פולי: C או CPG-C) 5. כבד ספציפי תא NK (MH-נ&quot;ח) ממוקם בתוך לומן סינוסי, דבקות לתאי אנדותל ותאי Kupffer. תאי MH-NK מאופיינים באופן בלעדי על ידי גרגרים צפופים כדורי שלפוחית ​​cored מוט 6, אשר מכילים חומצת phosphatase אנזימים ליזוזומלית, ו perforin ו granzymes כחומרים ביו 7,8. לעומת תאי NK, תאי MH-NK מציגים מספר גבוה וגודל גרגירי שלפוחית ​​9-11. בתנאים דלקתיים, תאי MH-NK הוצגו להפגין ביטוי גבוה של LFA-1 12, לעומת תאי NK. ביטוי משופר זו עשויה להוות מנגנון שבאמצעותו תאי MH-NK הם יותר ציטוטוקסיות נגד תאים סרטניים מסוימים מאשר תאי NK 13,14. nterestingly, בא במבחנת דגירה עם interleukin (IL) -2, תאי MH-NK להיות מוגדלים,המספר והגודל של גרגרים שלהם להגדיל, שכולן עולים בקנה אחד עם רוצח פרו fi le של מופעל lymphokine (LAK) תאים 15. לויקוציטים MH הפעילים לא ניתן להשיג אך ורק באמצעות שיטות קציר לויקוציטים כבד הרגילות, אשר מבוססות על שחיקה ושפלה ביולוגית של הרקמה. יש גישה זלוף שלנו המתוארים כאן שני יתרונות מרכזיים לעומת הגישות הסטנדרטיות. ראשית, גישת זלוף סלקטיבי היבול לויקוציטים MH, מניעת זיהום על ידי לויקוציטים אחרים מעמוד תאים כבדים אחרים. שנית, טכניקת זלוף הטובה יותר שומרת על השלמות, הפעילות, ובין ההוויה הפיזיולוגית של לויקוציטים MH, בניגוד עיבוד רקמות גישות הפוגעים בתאים או לשנות המורפולוגיה שלהם, ובשל ניזק לרקמות, לגרום לשחרור של גורמים שונים כי ניכרו לווסת חיסונית פעילות. הכבד הוא איבר יעד מרכזי עבור גרורות סרטןnd לזיהומים שונים 16. ככל שתאי MH להציג מאפיינים ייחודיים חשוב ללמוד האוכלוסייה הספציפית הזה בתנאים שונים ביחס לפתולוגיות אלה. לדוגמא, הוא ראוי לציין כי הפעלה מערכתית חיסון על ידי BRMs השונה (למשל פולי לי: C או CPG-C) הוכח להפעיל MH-לויקוציטים יותר במחזור לויקוציטים 5.

<table><tbody><tr><td>Autoclud Peristaltic pump</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butterfly needle</td><td>OMG</td><td></td><td>26 G</td></tr><tr><td>Butterfly needle</td><td>OMG</td><td></td><td>21 G*3/4&quot;</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>2.5 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>25 ml</td></tr><tr><td>Blunted-edged forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hemostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

selective harvesting of marginating-hepatic leukocytes

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

בחולדות F344 השווינו את cytotoxicity של תאי MH-NK (נגבי sinusoids הכבד על ידי זלוף כבד בכפייה) כדי cytotoxicity של אוכלוסיית התא כבד כולו בעקבות שחיקה מכאנית של רקמת הכבד, ואל cytotoxicity של מחזורים לויקוציטים. כל הכנות התא נשטפו לפחות 3 פעמים, כדבר שבשגרת מבחני אימונולוגית, וכ...

Watch this Scientific Journal Video about Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes at JoVE.com

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-כבדית

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

selective-harvesting-of-marginating-hepatic-leukocytes

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

5.6K Views.  Tel-Aviv University. Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

Video: Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

שיטה פשוטה ויעילה על מנת לבודד המקרופאגים מתרבויות ראשי מעורבות של תאים בכבד למבוגרים

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular infiltrate and epithelial cell activation. The progenitor cell population during such inflammatory reactions has mostly been investigated using single surface markers, either by histological analysis or by flow cytometry-based techniques. However, novel surface markers identified various functionally distinct subsets within the liver progenitor/stem cell compartment. The method presented here describes the isolation and detailed flow cytometry analysis of progenitor subsets using novel surface marker combinations. Moreover, it demonstrates how the various progenitor cell subsets can be isolated with high purity using automated magnetic and FACS sorting-based methods. Importantly, novel and simplified enzymatic dissociation of the liver allows for the isolation of these rare cell populations with a high viability that is superior in comparison to other existing methods. This is especially relevant for further studying progenitor cells in vitro or for isolating high-quality RNA to analyze the gene expression profile.

Liver injuries are accompanied by progenitor cell expansion that represents a heterogeneous cell population. Novel classification of this cellular compartment allows for the distinguishing of multiple subsets. The method described here illustrates the flow cytometry analysis and high purity isolation of various subsets that can be used for further assays.

בידוד והעשרה של קבוצות משנה כבדים ובתאים המזוהים על ידי שילוב מרקר Surface Novel

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular ...

Developmental Biology

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Evidence suggests higher cytotoxicity of natural killer cells, and a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MP-leukocyte population compared to circulating or splenic immunocytes. The method presented herein enables selective harvesting of MP-leukocytes by forced perfusion of the lungs in either mice or rats. In contrast to other methods used to extract lung-leukocytes, such as tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the lung capillaries, uncontaminated with parenchymal, interstitial, and broncho-alveolar cells. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MP-leukocytes, without inducing physiological responses due to tissue processing. This unique MP leukocyte population is strategically located to identify and react towards abnormal circulating cells, as all circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the lung capillaries, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes,. Thus, selective harvesting of MP-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of their biological and clinical significance, specifically with respect to controlling circulating aberrant cells and lung-related diseases.

Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.

קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-ריאתי

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Biology

הקמת תרביות LLEC חוץ גופיות באמצעות בחירת תאים מגנטיים

Harvest and Primary Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct from peripheral lymphatic endothelial cells. Their cellular function and clinical implications remain largely unknown. Consequently, the availability of a supply of LLECs is essential for conducting functional research in vitro. However, there is currently no existing protocol for harvesting and culturing LLECs in vitro.
This study successfully harvested LLECs using a multi-step protocol, which included coating the flask with fibronectin, dissecting the leptomeninges with the assistance of a microscope, enzymatically digesting the leptomeninges to prepare a single-cell suspension, inducing the expansion of LLECs with vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C), and selecting lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1) positive cells through magnetic-activated cell sorting (MACS). This process ultimately led to the establishment of a primary culture. The purity of the LLECs was confirmed through immunofluorescence staining and flow cytometric analysis, with a purity level exceeding 95%. This multi-step protocol has demonstrated reproducibility and feasibility, which will greatly facilitate the exploration of the cellular function and clinical implications of LLECs.

מחבר זרקור: חשיפת תפקודים תאיים והשלכות קליניות פוטנציאליות של תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal 

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs), a recently identified intracranial cell type, have poorly understood functions. This study presents a reproducible protocol for harvesting LLECs from mice and establishing in vitro primary cultures. This protocol is designed to enable researchers to delve into the cellular functions and potential clinical implications of LLECs.

קציר ותרבית ראשונית של תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct ...

Neuroscience

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream single-cell applications is challenging. A marked accumulation of lipids within regenerating hepatocytes is observed during the first 2 days of normal liver regeneration in mice. This so-called transient regeneration-associated steatosis (TRAS) is temporary but partially overlaps the major proliferative phase. Density-gradient purification is the backbone of most existing protocols for the isolation of primary hepatocytes. As gradient purification relies on the density and size of cells, it separates non-steatotic from steatotic hepatocyte populations. Therefore, fatty hepatocytes often are lost, yielding non-representative hepatocyte fractions. 
The presented protocol describes an easy and reliable method for the in vivo isolation of regenerating hepatocytes regardless of their lipid content. Hepatocytes from male C57BL/6 mice are isolated 24-48 h after hepatectomy by a classic two-step collagenase perfusion approach. A standard peristaltic pump drives the warmed solutions via the catheterized inferior vena cava into the remnant, using a retrograde perfusion technique with outflow through the portal vein. Hepatocytes are dissociated by collagenase for their release from the Glisson's capsule. After washing and careful centrifugation, the hepatocytes can be used for any downstream analyses. In conclusion, this paper describes a straightforward and reproducible technique for the isolation of a representative population of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice. The method may also aid the study of fatty liver disease.

Lipid-laden hepatocytes are inherent to liver regeneration but are usually lost upon density-gradient centrifugation. Here, we present an optimized cell isolation protocol that retains steatotic hepatocytes, yielding representative populations of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice.

בידוד של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

Medicine

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-כבדית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שיטה פשוטה ויעילה על מנת לבודד המקרופאגים מתרבויות ראשי מעורבות של תאים בכבד למבוגרים

בידוד והעשרה של קבוצות משנה כבדים ובתאים המזוהים על ידי שילוב מרקר Surface Novel

קציר סלקטיבי של לויקוציטים Marginating-ריאתי

העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

קציר ותרבית ראשונית של תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal

קציר ותרבית ראשונית של תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal

קציר ותרבית ראשונית של תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal

בידוד של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר