Funding was provided by the Austrian Science Fund FWF grant No. P-22969-B11 to F. Ferraguti, and by the Charitable Hertie Foundation and the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience and by the DFG (CIN-Exc. 307) to I. Ehrlich.

<ol>
	<li>Fujimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-digested+freeze-fracture+replica+labeling+electron+microscopy+to+study+the+two-dimensional+distribution+of+integral+membrane+proteins+and+phospholipids+in+biomembranes:+practical+procedure,+interpretation+and+application.">SDS-digested freeze-fracture replica labeling electron microscopy to study the two-dimensional distribution of integral membrane proteins and phospholipids in biomembranes: practical procedure, interpretation and application.</a> Histochem Cell Biol. 107 (2), 87-96 (1997).</li><li>Masugi-Tokita, M., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+quantitative+visualization+of+glutamate+and+GABA+receptors+at+central+synapses.">High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 387-393 (2007).</li><li>Rash, J. E., Yasumura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+immunogold+labeling+of+connexins+and+aquaporin-4+in+freeze-fracture+replicas+of+liver,+brain,+and+spinal+cord:+factors+limiting+quantitative+analysis.">Direct immunogold labeling of connexins and aquaporin-4 in freeze-fracture replicas of liver, brain, and spinal cord: factors limiting quantitative analysis.</a> Cell Tissue Res. 296 (2), 307-321 (1999).</li><li>Emes, R. D., Grant, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+synapse+complexity+and+diversity.">Evolution of synapse complexity and diversity.</a> Annu Rev Neurosci. 35, 111-131 (2012).</li><li>Matsuzaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+geometry+is+critical+for+AMPA+receptor+expression+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 4 (11), 1086-1092 (2001).</li><li>Rollenhagen, A., L&#252;bke, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+of+excitatory+central+synapses:+from+structure+to+function.">The morphology of excitatory central synapses: from structure to function.</a> Cell Tissue Res. 326 (2), 221-237 (2006).</li><li>Tarusawa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input-specific+intrasynaptic+arrangements+of+ionotropic+glutamate+receptors+and+their+impact+on+postsynaptic+responses.">Input-specific intrasynaptic arrangements of ionotropic glutamate receptors and their impact on postsynaptic responses.</a> J Neurosci. 29 (41), 12896-12908 (2009).</li><li>Nusser, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+and+pathway+dependence+of+synaptic+AMPA+receptor+number+and+variability+in+the+hippocampus.">Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus.</a> Neuron. 21 (3), 545-559 (1998).</li><li>Ny&#236;ri, G., Stephenson, F. A., Freund, T. F., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+variability+in+synaptic+N-methyl-D-aspartate+receptor+density+on+interneurons+and+a+comparison+with+pyramidal-cell+spines+in+the+rat+hippocampus.">Large variability in synaptic N-methyl-D-aspartate receptor density on interneurons and a comparison with pyramidal-cell spines in the rat hippocampus.</a> Neuroscience. 119 (2), 347-363 (2003).</li><li>Nicholson, D. A., Geinisman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axospinous+synaptic+subtype-specific+differences+in+structure,+size,+ionotropic+receptor+expression,+and+connectivity+in+apical+dendritic+regions+of+rat+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Axospinous synaptic subtype-specific differences in structure, size, ionotropic receptor expression, and connectivity in apical dendritic regions of rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 512 (3), 399-418 (2009).</li><li>Millhouse, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intercalated+cells+of+the+amygdala.">The intercalated cells of the amygdala.</a> J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).</li><li>Busti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+fear+states+engage+distinct+networks+within+the+intercalated+cell+clusters+of+the+amygdala.">Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala.</a> J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).</li><li>Amano, T., Unal, C. T., Par&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+correlates+of+fear+extinction+in+the+amygdala.">Synaptic correlates of fear extinction in the amygdala.</a> Nat Neurosci. 13 (4), 489-494 (2010).</li><li>Duvarci, S., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+microcircuits+controlling+learned+fear.">Amygdala microcircuits controlling learned fear.</a> Neuron. 82 (5), 966-980 (2014).</li><li>J&#252;ngling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+S-mediated+control+of+fear+expression+and+extinction:+role+of+intercalated+GABAergic+neurons+in+the+amygdala.">Neuropeptide S-mediated control of fear expression and extinction: role of intercalated GABAergic neurons in the amygdala.</a> Neuron. 59 (2), 298-310 (2008).</li><li>Asede, D., Bosch, D., L&#252;thi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+inputs+to+intercalated+cells+provide+fear-learning+modulated+inhibition+to+the+basolateral+amygdala.">Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala.</a> Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).</li><li>Maren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+Pavlovian+fear+conditioning.">Neurobiology of Pavlovian fear conditioning.</a> Annu Rev Neurosci. 24, 897-931 (2001).</li><li>Pape, H. C., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+synaptic+networks+of+the+amygdala+for+the+acquisition,+expression,+and+extinction+of+conditioned+fear.">Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear.</a> Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).</li><li>Sigurdsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+in+the+amygdala:+a+cellular+mechanism+of+fear+learning+and+memory.">Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory.</a> Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).</li><li>Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex-vivo+optogenetic+dissection+of+fear+circuits+in+brain+slices.">Ex-vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices.</a> J. Vis. Exp. (110), e53628 (2016).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li><li>Bienvenu, T. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+intercalated+neurons+of+amygdala+relay+noxious+sensory+information.">Large intercalated neurons of amygdala relay noxious sensory information.</a> J. Neurosci. 35 (5), 2044-2057 (2015).</li><li>Sandri, C., Akert, K., Livingston, R. B., Moor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+aggregations+at+specialized+sites+in+freeze-etched+postsynaptic+membranes.">Particle aggregations at specialized sites in freeze-etched postsynaptic membranes.</a> Brain Res. 41 (1), 1-16 (1972).</li><li>Likhtik, E., Popa, D., Apergis-Schoute, J., Fidacaro, G. A., Par&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+intercalated+neurons+are+required+for+expression+of+fear+extinction.">Amygdala intercalated neurons are required for expression of fear extinction.</a> Nature. 454 (7204), 642-645 (2008).</li><li>Fukazawa, Y., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-synapse-type+and+inter-synapse-type+relationships+between+synaptic+size+and+AMPAR+expression.">Intra-synapse-type and inter-synapse-type relationships between synaptic size and AMPAR expression.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 446-452 (2012).</li><li>Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+cytochemistry+in+neuroscience.">Immunogold cytochemistry in neuroscience.</a> Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).</li><li>Fukazawa, Y., Masugi-Tokita, M., Tarusawa, E., Hagiwara, A., Shigemoto, R., Cavalier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-digested+Freeze-fracture+replica+labelling+(SDS-FRL).">SDS-digested Freeze-fracture replica labelling (SDS-FRL).</a> Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. , 567-586 (2007).</li><li>Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-fracture+electron+microscopy.">Freeze-fracture electron microscopy.</a> Nat Protoc. 2 (3), 547-576 (2007).</li><li>Tanaka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+density+of+AMPA+receptors+in+single+synapses+in+immature+cerebellum.">Number and density of AMPA receptors in single synapses in immature cerebellum.</a> J Neurosci. 25 (4), 799-807 (2005).</li><li>Mansouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subsynaptic+localization+of+type+1+metabotropic+glutamate+receptors+at+glutamatergic+and+GABAergic+synapses+in+the+rodent+cerebellar+cortex.">Distinct subsynaptic localization of type 1 metabotropic glutamate receptors at glutamatergic and GABAergic synapses in the rodent cerebellar cortex.</a> Eur J Neurosci. 41 (2), 157-167 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

במיקרוסקופ אלקטרוני Freeze-שבר כבר טכניקת מרכזי מחקר ultrastructural במשך 40 שנים. עם זאת, עדר אמצעי יעיל כדי ללמוד את ההרכב המולקולרי של ממברנות פיק ירידה משמעותית את השימוש בו. לאחרונה, חלה תחייה גדולה במיקרוסקופ אלקטרונים להקפיא שבר עקב ההתפתחות של דרכים יעילות כדי לחשוף חלבונים בממברנה אינטגרליים ידי immunogold תיוג 1, 2, כלומר את טכניקת FRIL. טכניקת FRIL בעל מספר יתרונות על פני שיטות ultrastructural immunogold אחרות. ראשית, חלבונים נגישים בקלות לנוגדני הגדלת הרגישות. שנית, החשיפה של חלק גדול של התמחויות קרום הפלזמה, כגון הממברנה הפוסט-סינפטי, על משטח דו-ממדי של העתק מאפשר בדיקה של התפלגות מרחבית רצף פיזי של מולקולות של עניין ללא שיקום מייגע זמן רב של סריסעיפי ultrathin al. שלישית, על זמינותו של שני החצאים של קרום הפלזמה מגדילה את מספר חלבונים שיכולים להיות מתויג עבור כל אחד מהמבנים, נוגדנים מתאימים הניתנים זמינים. עם שבירה, הפנים ההידרופובי של הממברנה פיצול מצופה פלטינה פחמן כי משריש תחומים חלבון הנותרים על פני השטח שבורה. הדבר מונע גישה של נוגדנים לאנטיגנים בתחומים אלה. למשל על P-פני העתק רק אפיטופים וצפו בשטח protoplasmic יכולים להיות מזוהים על ידי נוגדנים, ואילו על E הפנים רק אפיטופים וצפו בשטח exoplasmic יכול להיות מחויבת על ידי נוגדנים (ראה איור 2). מצד שני, את הטכניקה FRIL סובל גם ממגבלות מסוימות 2. כמו שברים להתרחש באופן אקראי, זה עלול להיות קשה למקד תאים או מבנים ספציפיים. זה גם יכול להוביל הטית דגימה, למשל, באוסף סינפסה, כתוצאה מההסתברות השונה של fracturing לאורך הממברנה של מבנים עם עקמומיות שונה (למשל, עמוד השדרה לעומת פירים). יתר על כן, הקצאת חלבונים בממברנה לאחד שני הפרצופים הוא בלתי צפויה. לפיכך, פיזורו של חלבון אל P-פנים או E-הפנים, בייחוד עבור מחקרים כמותיים, צריך להיות בזהירות בחן באמצעות נוגדנים תגובתי תחומים תאיים תאיים. לבסוף, זיהוי של העתק של מבנים מסוימים, כגון מסופי האקסון presynaptic, יכול להיות קשה כאשר רק על סמך תכונות מורפולוגיות. עם זאת, השימוש של נוגדנים ספציפיים עבור חלבוני סמן או התמרה של חלבונים בממברנה נפרדים מתויגים או ערוצים באמצעות וקטורים ויראליים מציע כלים נוספים כדי להקל על זיהוי של ממברנות השבורות. לדוגמה, במחקר זה ניצל התמרה של ChR2-YFP בנוירונים התלמוס לזהות efferents axonal שלהם באמיגדלה או תיוג לקולטני μ-אופיואידים לחשוף אותי postsynapticmbranes של נוירונים ITC. על מנת לבצע את טכניקת FRIL בהצלחה, טיפול בפרט צריך לנקוט בנוגע קיבעון רקמות. קיבעון רקמות חזק (&gt; 2% paraformaldehyde) יכול לגרום שיעור גבוה של שברי צלב וירידה ברגישות תיוג. מצד השני, קיבעונות חלשים להפוך את הטיפול ברקמה (למשל, חיתוך סעיפים) קשה. כמו כן, חשוב לשלוט כי העובי של אובניים הגזוז תואם את העובי של הקלטת דו צדדית. אם העובי של הדגימה נמוך מזה של הקלטת, המשטחים של הרקמה אולי לא לצרף אל פני השטח של שני נישאי המתכת, וכתוצאה מכך הדגימה קפואה אינה שבר. אם הרקמה עבה, זה יהיה דחוס עם עיוותים מבניות בלתי נמנעות כאשר הכריך של שתי הנושאות נחושת הוא עשה. הטמפרטורה שבה הדגימה הוא שבר (בפרוטוקול זה, -115 ° C) משחק גם תפקיד חשובעל המבנה של ההעתק. טמפרטורות גבוהות עשויות להניב שיעור גבוה יותר של חפצים כגון התעבות של אדי מים על פני השטח של הרקמה לפני או במהלך אידוי. בטמפרטורות נמוכות יותר (&lt;-125 ° C) עלול להגביר את הסיכון של פיצול של החומר במהלך שבירה. חומר זה עלול ליפול על פני השטח של הדגימה או להישאר מחובר אליו. פתיתים אלה של חומרים הם גם מצופים בניגוד לייצר כתמים כהים בתמונה. שבירה בטמפרטורות נמוכות יכולה להשפיע גם על התדר של שברים צלבו במיוחד עבור מבני קנס קטנים כגון קוצים הדנדריטים. שלב קריטי נוסף בהכנת ההעתקים הוא עיכול חומר הניקוי. אם העיכול אינו שלם, הרקמה המעוכלת מופיעה כתמים כהים כמו על ההעתק, ערבבה בין הניתוח של המבנה על TEM. יתר על כן, הרקמה המעוכלת יכולה נוגדנים מלכודת או לאגד הלא ספציפית, הגדלת תיוג הרקע. מצד השני, השימוש של חומר ניקויים לעיכול רקמת יכול לפגל מולקולות השייכת לאוניברסיטה העתק שינוי מבני שניוני ושלישוני שלהם. לכן, עבור אנטיגנים מסוימים ייתכן שיהיה צורך בהדרגה לדלל את הריכוז של SDS עם צעדי כביסה נוספים. לקבלת immunolabeling, הזמינות של גדלים שונים של חלקיקי זהב מצומדות כדי נוגדנים משני מאפשרת לזהות בעת ובעונה האחת, אבל רק מבחינה איכותית, חלבונים מרובים, אפילו microdomains הספציפי של קרום הפלזמה, כגון התמחות הפוסט-סינפטי. עם זאת, בשל הפרעה סטרית, מחקרים כמותיים מוגבלים בדרך כלל זיהוי של מולקולה אחת בלבד. הגודל של חלקיקי זהב יכול גם להשפיע על יעילות התיוג. על הפרשנות של התיוג FRIL, זה צריך להישמר לזכור כי חלקיק immunogold יכול להיות ממוקם בכל מקום בתוך אונה עם רדיוס של 20-25 ננומטר מן אנטיגן בשל הצורה המורכבת הגמישהed ידי נוגדן ראשוני ומשני 26. למידע נוסף על התיאוריה והפרקטיקה של FRIL וטכנולוגיות רלוונטיות, אנו מפנים את הקורא גם למאמרים מתודולוגיות אחרות 27, 28. טכניקת FRIL לאחרונה נעשתה שימוש עבור ניתוחים כמותיים ברזולוציה גבוהה של לוקליזציה קולטן הגלוטמט באוכלוסיות סינפסה מגוונות 29, 30. יתר על כן, את רגישות זיהוי של טכניקת FRIL עבור AMPA-R נאמדת גבוה ככל חלקיקי immunogold אחד לכל AMPA אחד הפונקציונלי -R ערוץ 29. לכן, גישה זו היא בסיכומו מאוד שימושי לכמת ולנתח את דפוס הביטוי postsynaptic של AMPA-R ו NMDA-R ב סינפסות המרכזי. הנה, הראינו את תחולתו ב סינפסות PIN / MGN-ITC, אתר והחשוב סביר להעברת ארה&quot;ב מידע במהלך מיזוג פחד. באמצעות נוגדן העלה כנגד שאריות חומצת אמינו התאיות השמורות ביותר של היחידות משנה קולטן AMPA GluA1-GluA4, מצאנו חלוקה שווה של חלקיקי זהב בתוך האשכולות IMP המתאים התמחויות הממברנה הפוסט-סינפטי. הצפיפות-R AMPA ב קוצי ITC הייתה גבוהה באופן משמעותי לעומת סינפסות פירים כוונת של afferents התלמוס PIN / MGN. בשני סינפסות השדרה פיר, מתאם חיובי בין תיוג עבור AMPA-R ואזור postsynaptic זוהה, תכונה משותפת סינפסות glutamatergic אחרים 25. השונות הנמוכות בצפיפות של AMPA-R סינפסות PIN / MGN-ITC מראות התפלגות הומוגנית דומה סינפסות אחרים נוצרו על ידי efferents התלמוס 7, אבל שונה סינפסות קליפת מוח 25. לעומת זאת, צפיפות-R NMDA היה יותר משתנה ולא שונה בין הסינפסות השדרה פיר דבר המצביע על רגולציה שונה AMPA-R. בעתיד, השחזור הגבוה של טכניקת FRIL לא יאפשר רק להעריך את ההרכב המולקולרי הבסיסי של סינפסות מרכזית אך עשוי להקל זיהוי של גhanges במספרי קולטן ionotropic גלוטמט והפצת subsynaptic לאחר למידת פחד, המשלים הקלטות-vivo לשעבר של נכסים טרום postsynaptic של תשומות אלה. לסיכום, גישה זו יכולה להיות בשימוש על ידי חוקרים אחרים כדי להשיג תובנות יחסי פונקציה-מבנה של סינפסות מעוררות ספציפי קלט רב מעגלים עצביים אחרים בם מתירים את מקורם של התשומות וכן אופי רכב אלמנטי postsynaptic הוא חיוני אך בעייתי .

ההגדרה של אדריכלות פונקציונלית של בביו-ממברנות בקנה מידה ננומטרי כבר לערער בשנים האחרונות על ידי פיתוח של מספר טכניקות immunolabeling מתאים במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. עם זאת, טכניקות אלה, למשל, לפני ואחרי הטמעת immunogold, יש מספר מגבלות חשובות, הכוללים איתור העניים של אנטיגנים ו / או הערכה כמותית מוגבלת של חלבונים קרום הנכנס. מגבלות אלה הופכים להיות קריטיות במיוחד בחקירה של המבנה העדין של מערכת העצבים, מאופיינת ברמה גבוהה של גיוון תא ההטרוגניות סינפסה. ההטרוגניות הזאת תוצאות משתי מגוון מבני ותפקודי מוכתב על ידי האלמנטים טרום postsynaptic ועל ידי ביטוי דיפרנציאלי, העשרה, או אינטראקציה של איתות חלבונים, כגון קולטנים, מובילים, ומולקולות מפעיל. גישה חדשה עבור immunolabe ישירהלינג של חלבונים בממברנה נפרד או צולבים העתקים להקפיא שבר דטרגנט-solubilized (FRIL) הוצג לראשונה על ידי פוג&#39;ימוטו לפני שני עשורים 1. שיטה מקורית זו הייתה, עם זאת, מספר מגבלות, כלומר, פיצול חמור של העתקים, אשר הקשו על קורלציות משמעותיות של מולקולות שכותרתו עם תאים ממופים בנפרד רקמות מורכבות כמו המוח. לפני כ 10 שנים, Shigemoto ו Fukazawa בהדרגה שיפר את הטכניקה 2. זה היה מקביל המאמצים מקבוצה אחרת של מדענים במעבדות Boulder של קולורדו סטייט, שגם שיפרה בצורה משמעותית את הטכניקה, בפרט לחקר צמתים הפער 3. שיפור פרוטוקולים שבירים הקפאה ומכונות, כמו גם הכניסה של הקפאה מהירה (בלחץ גבוה), חברה מאפשרת לחוקרים כדי לייצר העתקים רצופים של דגימות של גודל גדול יחסית והיהתמונות באיכות GH של המרכיבים התאיים ביותר ללא מגבלות וממצאים היוצר על ידי קיבעונות כימיים חזקים. טכניקת FRIL מציעה את היתרון הגדול של כמותי מאוד להציג תעודה מזהה עם באתרו של חלבונים אחד או יותר (בו זמנית) ב היסטולוגית מופתה cytologically תאים שזוהו בתוך רקמות מורכבות כמו המוח, עם היתרון הנוסף של נוף מישוריים של טרום postsynaptic גורמי העתק יחיד. לכן, טכניקת FRIL, למרות מכשולים טכניים רבים, ולפוטנציאל במשך מספר פריצות דרך מדעית מאוד משמעותיות, במיוחד עבור המתאם של נכסים מבניים ותפקודיים של סינפסות בודדות. במהלך העשורים האחרונים, הרבה מידע שהושג על המבנה מולקולרי לפצות, ותפקוד פיסיולוגי של סינפסות; עדיין סינפסות הן מורפולוגית מולקולרית מאוד מגוון תלוי הרשות מראש ו postsynapticלהשכרה נוירונים 4. רק בעבור חופן סוגי סינפסה היו מחקרי מבנה-תפקוד מושלם עד כה 5-7. זה היה בעיקר בשל אילוצים טכניים שמנעו זיהוי מדויק של מהות האלמנטים טרום postsynaptic. ניתוח ultrastructural סיפקה תובנות קריטיות לתוך השתנות של התמחויות הממברנה הפוסט-סינפטי על פני קשרים סינפטיים ברורים הן מבחינת גודל הסינפטי ותוכן הנוירוטרנסמיטר קולטנים 6, אשר יש לו השפעה גדולה על חוזק הפלסטיות של העברה סינפטית. יתר על כן, מחקרים רבים עולים כי מספר ionotropic הקולטני גלוטמט הביע על סוגים שונים של סינפסה מוסדר בצורה afferent- ויעד תלויה 7-10. כאן, שיטה המתואר המאפשר ניתוח של הרכב מבנה הקולטן של התמחויות הממברנה הפוסט-סינפטי עם להגדיראלמנטים ותפקוד presynaptic ד. גישה זו מנצלת ביטוי presynaptic של חלבוני אצות רגישים לאור שפותחו לאחרונה, כגון Channelrhodopsin2 (ChR2), ושל טכניקת FRIL לנתח את דפוס ביטוי postsynaptic של α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-isoxazolepropionic חומצה (-R AMPA) ו-אספרטט N-methyl-D קולטני גלוטמט (-R NMDA). זו באה לידי ביטוי ב סינפסות הוקמה על ידי אקסונים שמקורם גרעינים התלמוס-מדיאלי ברך האחורי (PIN / MGN) על נוירונים של ההמונים תא intercalated של האמיגדלה (ITC). נוירונים ITC הם תאי GABAergic קוצניים קטנים מאורגנים באשכולות המקיפים את מבנה amygdaloid basolateral (BLA) 11, 12. נוירונים ITC ידועים לקבל תשומות מעוררות מתא העצב העיקרי BLA וכדי למקד את הגרעין המרכזי (CEA), ובכך לתפקד כשער מעכבות עבור זרימת המידע בין BLA ו- CEA 12-15. לאחרונה, הראינו כי ה- ITנוירונים C הממוקמים באשכול מדיו-הגבו בין BLA ו- CEA גם לקבל תשומות מעוררות ישירות מתכנסות מאזורי קליפת מוח התלמוס ובזמן חושי, אשר שונו על למידת פחד במהלך מיזוג פחד שמיעתי הפבלובית 16. מיזוג פחד הוא אחת הצורות להבין בצורה הטובה ביותר של למידה אסוציאטיבית מבחינת מנגנוני מוח. בשנת מיזוג פחד, גירוי מותנה ניטראלי בתחילה (CS, למשל, בטון) מזווג עם גירוי מותנה מרתיע (ארה&quot;ב, למשל, הלם ברגל קל) וכתוצאה מכך עמותת CS-US והתנה תגובת פחד 17, 18. מעורר תשומות משני אזורים התלמוס ואת neocortical, נושאות מידע המייצג את CS וארה&quot;ב, בהתאמה, היו ידועות להתכנס על עצב פירמידליים של הגרעין לרוחב של האמיגדלה (LA) וכדי לעבור פלסטיות 19. העבודה הקודמת שלנו גילתה כי מידע קלט חושי הוא גם במקביל העביר נוירונים ITC <sעד&gt; 16. כצעד ראשון לקראת ניתוח מולקולרי מכניסטית של הקלט החושי הפרט הסינפסות על נוירונים ITC, השתמשנו וירוס adeno הקשורים (AAV) להביע ChR2 מתויג עם חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP). AAV הוזרק מסופי PIN / MGN ואת האקסון זוהו על ידי הביטוי שלהם של ChR2-YFP. השתמשנו בשני הפניות שנוצרו על ידי טכניקת FRIL להעריך את הצפיפות של AMPA-R ו NMDA-R-סינפטי ב סינפסות הקים עם נוירונים ITC ידי מסופי האקסון PIN / MGN.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Surgery&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotactic frame</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>can be replaced by other stereotactic frame for mice</td></tr><tr><td>Stereotactic frame mouse adaptor</td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Gas anesthesia mask for mice</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>no longer available, replaced by item no. 51609M</td></tr><tr><td>Pressure injection device, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, USA</td><td>T25-2-900</td><td>other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used</td></tr><tr><td>Kwik Fill glass capillaries</td><td>World Precision Instruments, Germany</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia machine, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Germany</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>DC Temperature Controler and heating pad</td><td>FHC, USA</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal Micropipette Puller Model P-1000</td><td>Sutter Instruments, USA</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75</td><td>Melag, Germany</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>fast green</td><td>Roth, Germany</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1 ml/ml)</td><td>CP Pharma, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiseptic, Betadine (providone-iodine)</td><td>Purdure Products, USA</td><td>BSOL32</td><td>can be replaced by other disinfectants</td></tr><tr><td>Analgesic, Metacam Solution (5 mg/ml meloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim, Germany</td><td></td><td>can be replaced by other analgesics</td></tr><tr><td>Bepanthen eye ointment</td><td>Bayer, Germany</td><td>0191</td><td>can be replaced by other eye ointments</td></tr><tr><td>Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)</td><td>Nouvag, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Suture Needle</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Braided Silk Suture</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde EM grade</td><td>Agar Scientific Ltd., United Kingdom</td><td>AGR1018</td><td></td></tr><tr><td>Saturated picric acid solution</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P6744-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1063451000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>4N NaOH</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>T198.1</td><td></td></tr><tr><td>Thiopental</td><td>Sandoz, Austria</td><td>5,133</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>GenPure ultrapure water system</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>50131235</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>ISMATEC, Germany</td><td>ISM 930C</td><td></td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>MACHEREY-NAGEL, Germany</td><td>MN 615 1/4</td><td></td></tr><tr><td>Vibroslicer, VT1000S</td><td>Leica Microsystems, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic scalpel</td><td>Alcon Laboratories, USA</td><td></td><td>can be replaced by other ophthalmic scalpels</td></tr><tr><td>Perfusion cannula</td><td>Vieweg, Germany</td><td>F560088-1</td><td>can be replaced by similar items from other companies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;High-pressure&amp;nbsp; Freezing&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Copper carriers</td><td>Engineering Office M. Wohlwend, CH</td><td>528</td><td></td></tr><tr><td>Sidol Polish</td><td>Henkel, Germany</td><td></td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Chamois skin</td><td>Household supply store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hole punch, 1,5mm</td><td>Stubai, Austria</td><td></td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Denatured ethanol</td><td>Donauchem, Austria</td><td></td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Roth, Germany</td><td>9372.5</td><td>CAUTION!</td></tr><tr><td>High Pressure Freezing Machine HPM 010</td><td>BalTec, CH; now Leica Microsystems</td><td>HPM010</td><td>not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100</td></tr><tr><td>Stereo-microscope</td><td>Olympus, Japan</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>CAUTION!</td></tr><tr><td>Cryo-vials</td><td>Roth, Germany</td><td>E309.1</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>CryoCane</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5015-0001</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5016-0001</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen storage vessel</td><td>Cryopal, France</td><td>GT38</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Non-ionic detergent (Lavocid)</td><td>Werner &amp;amp; Mertz Professional, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Freeze-fracture and Replication&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sandblaster, Mikromat 200-1</td><td>JOKE Joisten &amp;amp; Kettenbaum, Germany</td><td>SANDURET 2-K</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 - 21&amp;micro;</td><td>JOKE Joisten &amp;amp; Kettenbaum, Germany</td><td>955932</td><td></td></tr><tr><td>Freeze Fracture System BAF 060</td><td>BalTec, CH; now Leica Microsystems</td><td>BAF060</td><td></td></tr><tr><td>Ceramic 12 well plate</td><td>Gr&amp;ouml;pel, Austria</td><td>14511</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>SIGMA, USA</td><td>T1503</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>SIGMA, USA</td><td>T3253</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck, Germany</td><td>1,064,041,000</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>SDS, Sodium lauryl sulfate</td><td>Roth, Germany</td><td>5136.1</td><td>CAUTION! ;&amp;nbsp; can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck, Germany</td><td>1,076,871,000</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, Germany</td><td>5429.3</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Universal Hybridization Oven</td><td>Binder, Germany</td><td>7001-0050</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Immunolabelling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA, USA</td><td>A9647</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Anti-GFP Antibody</td><td>Molecular Probes, USA</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pan-AMPAR Antibody</td><td>Frontier Institute, Japan</td><td>pan AMPAR-GP-Af580-1</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody</td><td>ImmunoStar, USA</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>EM goat anti-guinea pig, 5 nm; secondary antibody</td><td>BBInternational, UK</td><td>EM.GAG5</td><td></td></tr><tr><td>EM goat anti-rabbit, 15 nm; secondary antibody</td><td>BBInternational, UK</td><td>EM.GAR15</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody</td><td>AURION, Netherlands</td><td>DAR 10nm</td><td></td></tr><tr><td>Copper grids, 100 Parallel Bar</td><td>&amp;nbsp;Agar scientific, UK</td><td>G2012C</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Major Science, USA</td><td>MO-RC</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Pioloform Powder</td><td>&amp;nbsp;Agar scientific, UK</td><td>R1275</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Roth, Germany</td><td>3313.1</td><td>CAUTION! ;&amp;nbsp; can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EM analysis&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM120 TEM</td><td>Philips/FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Morada CCD camera</td><td>Soft Imaging Systems, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTEM Ver. 5.2, imaging software</td><td>Soft Imaging Systems, Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combined optogenetic and freeze-fracture replica immunolabeling to examine input-specific arrangement of glutamate receptors in the mouse amygdala

במיקרוסקופ אלקטרוני Freeze-שבר כבר טכניקת מרכזי מחקר ultrastructural במשך 40 שנים. עם זאת, עדר אמצעי יעיל כדי ללמוד את ההרכב המולקולרי של ממברנות פיק ירידה משמעותית את השימוש בו. לאחרונה, חלה תחייה מרכזית הודות במיקרוסקופ אלקטרונים להקפיא שבר לפיתוח דרכים יעילות כדי לחשוף חלבונים בממברנה נפרדים על ידי תיוג immunogold. אחת השיטות הללו שמכונה immunolabeling Replica Freeze-שבר דטרגנט-solubilized (FRIL). השילוב של טכניקה FRIL עם optogenetics מאפשר ניתוח בקורלציה של נכסים מבניים ותפקודיים של סינפסות המרכזית. בגישה זו ניתן לזהות ולאפיין הוא נוירונים טרום postsynaptic על ידי הביטוי של כל אחד מהם של channelrhodopsin מתויג סמנים מולקולריים ספציפיים. המראה הייחודי של התמחות הממברנה הפוסט-סינפטי של glutamatergic הסינפסות נוסף מאפשר בעת תיוג של קולטני גלוטמט ionotropic, לכמת ולנתח את חלוקת intrasynaptic של קולטנים אלה. הנה, אנחנו נותנים צעד-אחר-צעד תיאור של ההליכים הנדרשים כדי להכין העתקים מותאמים ועל איך immunolabel אותם. נדונו גם האזהרות והמגבלות של טכניקת FRIL, במיוחד אלה הקשורים הטיות דגימה פוטנציאליות. השחזור הצדדי הגבוהים של טכניקת FRIL, בשילוב עם optogenetics, מציע גישה חזקה מאוד לאפיון של היבטים שונים של העברה סינפטית ב שבבים עצביים מזוהים במוח. כאן, אנו מספקים דוגמא כיצד גישה זו שמשה להשיג תובנות יחסי מבנה-תפקוד של סינפסות מעוררות ב נוירונים של המוני תא intercalated של האמיגדלה העכבר. בפרט, אנו חקרנו את הביטוי של קולטני גלוטמט ionotropic ב תשומות מזוהות אוiginated מן intralaminar האחורי התלמוס וגרעיני ברך המדיאלי. סינפסות אלו הוצגו להעביר מידע חושי רלוונטי ללמידה פחד לעבור שינויי פלסטיק על מיזוג פחד.

טכניקת FRIL, בשילוב עם ביטוי של מפעילי optogenetic ממוצא מיקרוביאלי 21, כלומר, ערוצי משולב קרום הפלזמה והובלו ביעילות anterogradely לאורך אקסונים, מאפשרת לבחון את ביטוי postsynaptic כמותית של AMPA-R ו NMDA-R בכל תת-קבוצה מוגדרת של סינפסות. זו מוצגת כאן עבור אקסונים שמקורם גרעינים התלמוס מובהק (למשל, PIN / MGN) על נוירונים ITC באמיגדלה. גישה זו מאפשרת ניתוח מולקולרי של סינפסות הקלט החושי הפרט על נוירונים ITC, קבוצה של תאים שהיו מגיבים אפיון אנטומי ומולקולרית מפורט עד כה. ארבעה שבועות לאחר ההזרקה stereotactic של rAAV-ChR2-YFP לתוך PIN / MGN, ChR2-YFP חיובי אקסונים בצפיפות מעוצבבים את הלוס אנג&#39;לס, באזור המעבר amygdalostriatal (Astria) ואת ואני paracapsular המדיאלי<html> אשכול TC באמיגדלה, דפוס עקבי לחלוטין עם העקיבה הקודם שלומד 16, 22. גם זיהינו זהב אינטנסיבי immunolabeling עבור ChR2-YFP על P פנים של אקסונים ומסופי ב העתק להקפיא שבר מן rAAV-ChR2-YFP- עכברים שהוזרק (איור 5 א), אך לא העתקים מעכברים הלא מוזרק. ההתמחות הממברנה הפוסט-סינפטי של סינפסות glutamatergic ב העתק ניתן לצפות כמו מקבץ של חלקיקים intramembrane (שדונים) על E-פני קרום התא 2, 23, והוא מלווה לעתים קרובות על ידי P-פני קרום התא presynaptic שלה 7 (איור 5 ב-ג). תכונות אלה אפשרו לזהות את התמחות postsynaptic של סינפסות glutamatergic הוקמה על ידי מסופי האקסון PIN / MGN (איור 5 ו -6). אנחנו שכותרתו AMPA-R עם נוגדן שמכיר כל ארבע יחידות משנה (GluA1-4), ואילו-R NMDA התגלה באמצעות נוגדן כנגד למקטע NR1 החיוני. ntent &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; בגלל חוסר של כלים לגילוי על אותו העתק אם סינפסות אלה נעשו עם קוצים או פירים הדנדריטים של נוירונים ITC, אנו שכותרתו הפנים העתק המתאים עבור μ קולטנים -opioid, כמו נוירונים ITC מבטאים רמות גבוהות postsynaptically של קולטנים אלה 24. זה נדרש זיהוי של אותה פרופילים postsynaptic בשנתיים העתקים (איור 5 ג-F ואיור 6A-D) משתמש באסטרטגיה המעסיקה ציוני דרך (איור 4E) . <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig5.jpg" /> איתור איור 5. של ChR2-YFP ו ionotropic גלוטמט רצפטורים על Replica ידי immunogold חלקיקים. (א) מסוף האקסון צולב שבר (תכלת) ו מנות קטנות של P-הפנים שלה שכותרתו עם חלקיקי זהב 15 ננומטר גילוי ChR2-YFP. בתוך הטרמינל, קרום oשלפוחית ​​סינפטית רבה f ניתן לצפייה (ד&quot;ה). הערה הספציפית של immunolabeling במידה רבה מוגבלת קרום הפלזמה. תיוג עבור ChR2 מזהה את מסוף כנובעת ה- PIN / MGN. המסוף מהווה סינפסה סימטרית עם עמוד שדרה. התמחות הממברנה הפוסט-סינפטי (PSD) על E הפנים מציגה מקבץ מאפיין של חלקיקי intramembrane, והוא הנקרא עם 5 ננומטר חלקיקי זהב החושפים AMPA-R. (ב) P-פני האקסון להביע ChR2 (שכותרתו עם 15 חלקיקי זהב ננומטר) מוצג הגובלים שני דנדריטים, אחד מהם בעל שני PSDs שכותרתו עם חלקיקי זהב 5 ננומטר חושף NMDA-R. (CD) פרצופים השני של ממברנות טרום postsynaptic של סינפסה PIN / MGN-ITC. (ג) P-פני מסוף מבטא ChR2 (שכותרתו עם חלקיקי זהב 15 ננומטר) משתרע על פני E-פני שני פירים הדנדריטים, אחד מהם המכיל שני PSDs שכותרתו עבור AMPA-R (5 חלקיקי זהב ננומטר). ( <strong&gt; ד) P פן המקבילים של שני דנדריטים מתויג עבור μ-אופיואידים לקולטנים (10 חלקיקי זהב ננומטר). (EF) נופים מוגדלים של האזורים שהתוו קווים מהקווקווים. ברי סולם:. 500 ננומטר <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53853/53853fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> Immunoparticles עבור AMPA-R ב הסינפסות PIN / MGN-ITC נמצאו בכל רחבי אשכול IMP, דבר המצביע על חלוקה הומוגנית בתוך התמחות postsynaptic (איור 5E). גבוה משמעותית (p מבחן t מזווג &lt;0.018) צפיפות של תיוג AMPA-R נצפתה PIN / MGN הסינפסות על קוצים ITC (715 ± 38 חלקיקי זהב / מיקרומטר 2, n = 32) לעומת סינפסות על דנדריטים ITC (590 ± 44 חלקיקי זהב / מיקרומטר 2, n = 32). בסך הכל, צפיפות-R AMPA ב PIN / סינפסות MGN-ITC הראו נמוך יחסיתשונה (מקדם שונה, CV = 0.37) עולה בקנה אחד עם חלוקה הומוגנית. Immunoparticles עבור NMDA-R ב הסינפסות PIN / MGN-ITC לעתים קרובות נצפו התחלק באופן אחיד בתוך האשכולות IMP postsynaptic (איור 5). צפיפות תיוג NMDA-R היה דומה (עמ &#39;מבחן t מזווג = 0.39) בין PIN / MGN הסינפסות על קוצים ITC (חלקיקי זהב 1070 ± 153 / מיקרומטר 2, n = 8) דנדריטים ITC (812 ± 183 חלקיקי זהב / מיקרומטר 2, n = 9). בניגוד למה נצפה-R AMPA, הצפיפות של NMDA-R סינפסות PIN / MGN-ITC הייתה משתנית מאוד (CV = 0.54). <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig6.jpg" /> איור 6. AMPA-R ו NMDA-R immunolabeling ב Identified PIN / MGN-ITC סינפסות. (AB) פרצופים שניים של ממברנות טרום postsynaptic של PIN / MGN-ITCסינפסה עשתה על גבי עמוד שדרה הדנדריטים שבו P הפנים של מסוף מבטא ChR2 (שכותרתו עם 15 חלקיקי זהב ננומטר) ואת PSD על גבי עמוד שדרה הדנדריטים מתויג עבור-R AMPA (5 חלקיקי זהב ננומטר). (CD) נופים מוגדלים של האזורים שמתווים הקו המקווקו. אזורים אלה כבר הסתובב כ 45 ° נגד כיוון השעון כדי לאפשר לראות טוב יותר של PSD. (E) Scatterplots של מספר החלקיקים AMPA-R לעומת שטח סינפטי קוצים דנדריטים ITC. בשני המבנים, מתאם חיובי נצפה. (F) Scatterplots של מספר החלקיקים NMDA-R נגד אזור סינפטי קוצים דנדריטים ITC. קשר חיובי משמעותי זוהה רק קוצים הדנדריטים. ברי סולם:. 500 ננומטר <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53853/53853fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> כיP-פני קרום התא presynaptic לעתים קרובות מעולף חלקית באשכול IMP-סינפטי, נוכל להעריך את אזור סינפטיים של רק 30% של סינפסות (קוצים: מתכוון באזור 0.032 מיקרומטר 2, רכס: 0.007 כדי 0,063 מיקרומטר 2, n = 8; דנדריטים: 0.047 מיקרומטר 2, רכס: 0.024 כדי 0.166 מיקרומטר 2, n = 11). אלה היו בסדר גודל דומה כמו glutamatergic telencephalic ניתח בעבר הסינפסות 25. בשני קוצים דנדריטים, מספר immunoparticles זהב עבור AMPA-R סינפסות בודדות הייתה מתואמת חיובית עם השטח הסינפטי (ספירמן, קוצים: r = 0.88, דנדריטים: r = 0.60, p &lt;0.0001) (איור 6E). לעומת זאת, מספר immunoparticles זהב-R NMDA נמצא בקורלציה עם שטח סינפטי קוצים (ספירמן, קוצים: r = 0.90, p &lt;0.002), אך לא דנדריטים (r = 0.21, p = 0.29) (איור 6F ).

Watch this Scientific Journal Video about Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala at JoVE.com

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

בשילוב optogenetic ולהקפיא-שבר Replica immunolabeling לבחינת הסדר ספציפי קלט של גלוטמט הקולטנים עכבר האמיגדלה

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

combined-optogenetic-freeze-fracture-replica-immunolabeling-to

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.0K Views.  Medical University of Innsbruck. This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Video: Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of single neurons and region-specific transmitter release, up to whole neuronal circuitries in the central nervous system, and allows the direct measurement of behavioral outcomes. Neurons express optogenetic tools via an injection of viral vectors carrying the DNA of choice, such as Channelrhodopsin2 (ChR2). Light is brought into specific brain regions via chronic optical implants that terminate directly above the target region. After two weeks of recovery and proper tool-expression, mice can be repeatedly used for behavioral tests with optogenetic stimulation of the neurons of interest.
Optogenetic modulation has a high temporal and spatial resolution that can be accomplished with high cell specificity, compared to the commonly used methods such as chemical or electrical stimulation. The light does not harm neuronal tissue and can therefore be used for long-term experiments as well as for multiple behavioral experiments in one mouse. The possibilities of optogenetic tools are nearly unlimited and enable the activation or silencing of whole neurons, or even the manipulation of a specific receptor type by light.
The results of such behavioral experiments with integrated optogenetic stimulation directly visualizes changes in behavior caused by the manipulation. The behavior of the same animal without light stimulation as a baseline is a good control for induced changes. This allows a detailed overview of neuronal types or neurotransmitter systems involved in specific behaviors, such as anxiety. The plasticity of neuronal networks can also be investigated in great detail through long-term stimulation or behavioral observations after optical stimulation. Optogenetics will help to enlighten neuronal signaling in several kinds of neurological diseases.

With optogenetic manipulation of specific neuronal populations or brain regions, behavior can be modified with high temporal and spatial resolution in freely moving animals. By using different optogenetic tools in combination with chronically implanted optical fibers, a variety of neuronal modulations and behavioral testing can be performed.

מניפולציה אופטוגנטית של פעילות עצבית לווסת את ההתנהגות בעכברים נעים בחופשיות

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Behavior

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

ניתוח ברזולוציה גבוהה כמותי immunogold של קולטני קרום ב סינפסות רצועת הכלים רשתית

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenetic Dissection של מעגלי פחד פרוסות המוח

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.

בודד סינפסה אינדיקטורים של גלוטמט שחרור ספיגה בפרוסות המוח חריפה מעכברים נורמלי הנטינגטון

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this purpose, an in vivo imaging technique that detects calcium transients in neurons using genetically encoded calcium indicators (GECIs), a miniaturized fluorescence microscope, and a gradient refractive index (GRIN) lens has been developed and successfully applied to many brain structures1,2,3,4,5,6. This imaging technique is particularly powerful because it enables chronic simultaneous imaging of genetically defined cell populations for a long-term period up to several weeks. Although useful, this imaging technique has not been easily applied to brain structures that locate deep within the brain such as amygdala, an essential brain structure for emotional processing and associative fear memory7. There are several factors that make it difficult to apply the imaging technique to the amygdala. For instance, motion artifacts usually occur more frequently during the imaging conducted in the deeper brain regions because a head-mount microscope implanted deep in the brain is relatively unstable. Another problem is that the lateral ventricle is positioned close to the implanted GRIN lens and its movement during respiration may cause highly irregular motion artifacts that cannot be easily corrected, which makes it difficult to form a stable imaging view. Furthermore, because cells in the amygdala are usually quiet at a resting or anesthetized state, it is hard to find and focus the target cells expressing GECI in the amygdala during baseplating procedure for later imaging. This protocol provides a helpful guideline for how to efficiently target cells expressing GECI in the amygdala with head-mount miniaturized microscope for successful in vivo calcium imaging in such a deeper brain region. It is noted that this protocol is based on a particular system (e.g., Inscopix) but not restricted to it.

In vivo microendoscopic calcium imaging is an invaluable tool that enables real-time monitoring of neuronal activities in freely behaving animals. However, applying this technique to the amygdala has been difficult. This protocol aims to provide a useful guideline for successfully targeting amygdala cells with a miniaturized microscope in mice.

מוצלח בהדמיית סידן Vivo עם מיקרוסקופ מיניאטורי ראש הר באמיגדלה של עכבר מתנהג בחופשיות

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

<a href='https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53853/combined-optogenetic-freeze-fracture-replica-immunolabeling-to'>Source: Sch&#246;nherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala. J. Vis. Exp. (2016)</a>This video demonstrates the immunolabelling of freeze-fractured replicas of mouse brain tissue for electron microscopy. The fractured and coated replicas are digested to expose receptors. Primary and gold-tagged secondary antibodies are added to label specific neuronal membrane receptors. The replica is mounted on a grid and visualized under an electron microscope.

Source: Sch&#246;nherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Epilepsy and Seizure Disorders

Visualization and Mapping of Neuronal Pathways in an Amygdala Brain Slice

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a procedure for analyzing synaptic connectivity between medial prefrontal cortex (mPFC) and amygdala neurons using acute amygdala brain slices from mice. The mPFC neurons in these mice express channelrhodopsin fused to a fluorescent protein. The channelrhodopsins facilitate ion influx and action potential generation in the mPFC neurons upon light activation. Consequently, mPFC neurons release neurotransmitters that bind to postsynaptic amygdala neurons, triggering postsynaptic currents that are recorded to visualize mPFC-amygdala connectivity.

הדמיה ומיפוי של מסלולים עצביים בפרוסת מוח של אמיגדלה

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Visualization and ...

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Generation of Tilted Amygdala Slices from a Mouse Brain

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016)
The video demonstrates the generation of tilted amygdala slices from a mouse brain. The brain is positioned at an angle on the vibratome specimen stage to obtain slices containing the amygdala and axons from the medial prefrontal cortex that form synaptic connections with the amygdala. The brain slices are maintained at the physiological temperature to preserve the tissue for further experiments.

יצירת פרוסות אמיגדלה מוטות ממוח עכבר

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Acute Slices

	...

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Generating a Coronal Brain Slice Exposing the Amygdala Regions from a Mouse Brain

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the preparation of thin coronal brain slices from a murine brain, exposing the amygdala regions rich in synaptic connections from the medial prefrontal cortex. The slices are then recovered in oxygenated artificial cerebrospinal fluid to maintain neuronal viability.

יצירת פרוסת מוח קורונלית החושפת את אזורי האמיגדלה ממוח עכבר

1. Preparation of Acute Slices

	Prepare ACSF, cutting solution, tools (scissors, scalpel, forceps, spatula, Pasteur pipette), and agar blocks.
	NOTE: 1 L ...