VK was funded by grants from the IUP Department of Biology and School of Graduate Studies and Research (Graduate Student Professional Development). CQD and TWS were supported by the IUP School of Graduate Studies and Research (Faculty Publication Costs/Incidental Research Expenses). We also thank members of the Diep laboratory for maintaining the zebrafish facility.

הנהלים המתואר בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת אינדיאנה פנסילבניה. 1. עובר קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על דג הזברה על 28.5 מעלות צלזיוס, pH 7, מוליכות בין 500-1,500 מיקרו-שניות, ואת מחזור אור / חושך של 14 אור hr ו -10 שעות חושך 24. השתמש זני wild-type כגון ט&quot;ו, AB או היברידי ט&quot;ו / AB. זנים שונים עשויים להגיב באופן שונה לטיפול כימי 25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הדגים לצורך הזדווגות אמש ביצי קציר על ידי הוספת מי מערכת דגים לתוך טנק הזדווגות. הוספת זכר ודגי נקבה לתוך הטנק להפריד בין שני דגים עם מחיצה. כל זוג דגים ייצרו מגוון של 50-300 ביצים. כדי להבטיח כי ביצים מספיק תופקנה, להקים 30 זוגות של דגים. בדרך כלל, כ -50% של זוגות דגים בגיל ההזדווגות הממשלה (6-9 חודשים) יהיה לייצר ביציות, וכתוצאה מכך עד 200 ביצים לכל זוג ועד למקסימום של עד 3ביצים, 000 לצורך הניסוי הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר אחרי האור נדלק, להסיר את המחיצה כדי ליזום הזדווגות. בדקו את טנקי הזדווגות ביצים כל 15 דק &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגים מטילים ביצים, לקצור את כל העוברים באמצעות מסננת תה ולשלב אותם לתוך מכולה אחת גדולה עם חיץ E3 (5 mM NaCl, 0.17 מ&quot;מ KCl, 0.33 מ&quot;מ CaCl 2, 0.33 מ&quot;מ MgSO 4). 1.5 hpf, להסיר ולסלק ביצים מופרות עם pipet העברה פלסטיק תחת מיקרוסקופ לנתח. ביצים מופרות הן אטומות בעוד ביצים מופרות הם שקופות 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 50 עוברים לתוך צלחת זכוכית מ&quot;מ 100 x 15 פטרי המכילה 50 מ&quot;ל E3 חיץ עבור כל תנאי הטיפול. סך של 33 מנות נדרשים עבור 11 תנאי טיפול ו -3 משכפל. </li></ol> 2. עובר טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע טיפולים ב -2 שעות לאחר ההפריה (hpf) 35. עוברים / זחלים לדגור על 28.5 מעלות צלזיוס ולבחון את הזחלים ב 120 hpf. בצע בבית לאהרח שלושה משכפל של כל תנאי הטיפול לניתוח סטטיסטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך 3 צלחות פטרי (כל 50 עוברים המכילים) בשעה 2 hpf, להסיר את החיץ E3 עם pipet העברת ולהוסיף 50 מ&quot;ל של אתנול 300 מ&quot;מ מדולל במאגר E3. מכסים את צלחות פטרי עם Parafilm כדי למזער אידוי של אתנול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך חשיפה עוברת כדי אתנול במשך 22 שעות. ואז להסיר את אתנול עם העברת pipet. הוסף 50 מ&quot;ל של חיץ E3 ו מערבולת צלחת כמה פעמים כדי לשטוף את אתנול. הסר חוצץ E3 זה עם pipet העביר וחזור על שלב כביסה פי 2 יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך 3 צלחות פטרי (כל 50 עוברים המכילים) בשעה 2 hpf, להסיר את החיץ E3 עם pipet העברת ולהוסיף 50 מ&quot;ל של חיץ E3 חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך 9 צלחות פטרי (כל 50 עוברים המכילים) בשעה 2 hpf, להסיר את החיץ E3 עם pipet העברת ולהוסיף 50 מ&quot;ל של 1,000 מ&quot;ג / L סודיום ניטריט מומס חיץ E3. אשר את הריכוז של הפתרון ניטריט המניות מראש באמצעותשינוי של diazotization (USEPA שיטה 354.1) שיטת spectrophotometric 28. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך חשיפת 3 מנות במשך 46 שעות, 3 מנות עבור 70 שעות ו 3 מנות עבור 94 שעות. החלף את הפתרון ניטריט עם פתרון ניטריט טרי מדי יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל זמן החשיפה, להסיר את ניטריט עם pipet העברה. הוסף 50 מ&quot;ל של חיץ E3 ו מערבולת צלחת כמה פעמים כדי לשטוף את ניטריט. הסר חוצץ E3 זה עם pipet העביר וחזור על שלב כביסה פי 2 יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך 3 צלחות פטרי (כל 50 עוברים המכילים) בשעה 2 hpf, להסיר את החיץ E3 עם pipet העברת ולהוסיף 50 מ&quot;ל של 200 מ&quot;ג / L סודיום ניטריט. חזרו על פעולה זו עם 400, 600, 800, ו -1,000 מ&quot;ג / ליטר של סודיום ניטריט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך חשיפה עוברת ניטריט עבור 70 שעות. החלף את הפתרון ניטריט עם פתרון ניטריט טרי מדי יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן החשיפה, להסיר את ניטריט עם pipet העברה. הוסף 50 מ&quot;ל של חיץ E3 ו מערבולת המנה מספרפעמים כדי לשטוף את ניטריט. הסר חוצץ E3 זה עם pipet העביר וחזור על שלב כביסה פי 2 יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך 3 צלחות פטרי (כל 50 עוברים המכילים) בשעה 2 hpf, להסיר את החיץ E3 עם pipet העברת ולהוסיף 50 מ&quot;ל של 1,000 מ&quot;ג / L נתרן חנקתי מומס חיץ E3. אשר את הריכוז של התמיסה חנקה כסף המניות מראש באמצעות שינוי של הפחתת קדמיום (שיטת USEPA 353.3) שיטת spectrophotometric 28. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך חשיפת העוברים חנקו עבור 70 שעות. החלף את הפתרון חנק עם פתרון חנק טרי מדי יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן החשיפה, להסיר את חנקתי עם pipet העברה. הוסף 50 מ&quot;ל של חיץ E3 ו מערבולת צלחת כמה פעמים כדי לשטוף את חנקתי. הסר חוצץ E3 זה עם pipet העביר וחזור על שלב כביסה פי 2 יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך כל יום של החשיפה, לספור את מספר עובר / זחלים מתים באמצעות סטראו. סימנים של מוותבין השאר, חוסר דופק ואת זרימת הדם, או חוסר תנועתיות לאחר 1 דקות של התבוננות. סר עובר / זחלים מתים עם pipet העביר להפחתת זיהום של למאגר E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ניסויים נגמרים בגיל 120 hpf, להרדים את הזחלים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוצץ E3 עם העברת pipet. לאחר מכן להוסיף 50 מ&quot;ל של 0.2% MS-222 (שנאגרו ל- pH 7) ולחכות 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את MS-222 עם העברת pipet. הוסף 50 מ&quot;ל של חיץ מערבולת E3 לשטוף את MS-222. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוצץ E3 עם pipet העברת ולהוסיף 20 מ&quot;ל של 4% paraformaldehyde (PFA) כדי לתקן את הזחלים. מערבולת פעמים צלחת מספר. השתמש העברת pipet להעביר את הזחלים לתוך בקבוקון זכוכית יחד עם מספיק PFA למלא את הבקבוקון. אחסן את הבקבוקונים במקרר למשך הלילה (O / N). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות של זחלים קבועים באמצעות סטריאוסקופ עם מצלמה דיגיטלית. השתמש בהגדלה 30X, ISO 200, ו -200 זמן החשיפה msec. אוריינט הזחלים כך קדמי leרגל ו הגבי הוא לחלק העליון של השדה. </li></ol>

<ol>
	<li>Gilbert-Barness, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teratogenic+causes+of+malformations.">Teratogenic causes of malformations.</a> Ann Clin Lab Sci. 40 (2), 99-114 (2010).</li><li>Brent, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cause+and+prevention+of+human+birth+defects:+What+have+we+learned+in+the+past+50+years.">The cause and prevention of human birth defects: What have we learned in the past 50 years.</a> Con Anom. 41 (1), 3-21 (2001).</li><li>Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+an+in+vivo+model+for+nano+EHS+studies.">Zebrafish: an in vivo model for nano EHS studies.</a> Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).</li><li>Pamanji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+effects+of+profenofos+on+embryonic+and+larval+development+of+zebrafish+(Danio+rerio).">Toxicity effects of profenofos on embryonic and larval development of zebrafish (Danio rerio).</a> Environ Toxicol Pharmacol. 39 (2), 887-897 (2015).</li><li>Simmons, A. E., Karimi, I., Talwar, M., Simmons, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+nitrite+on+development+of+embryos+and+early+larval+stages+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Effects of nitrite on development of embryos and early larval stages of the zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 9 (4), 200-206 (2012).</li><li>Mantecca, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+Evaluation+of+a+New+Zn-Doped+CuO+Nanocomposite+With+Highly+Effective+Antibacterial+Properties.">Toxicity Evaluation of a New Zn-Doped CuO Nanocomposite With Highly Effective Antibacterial Properties.</a> Toxicol Sci. , (2015).</li><li>Jensen, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+formation+from+nitrite+in+zebrafish.">Nitric oxide formation from nitrite in zebrafish.</a> J Exp Biol. 210, 3387-3394 (2007).</li><li>Scholz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+embryo+model+in+environmental+risk+assessment--applications+beyond+acute+toxicity+testing).">The zebrafish embryo model in environmental risk assessment--applications beyond acute toxicity testing).</a> Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>CDC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+abortions+possibly+related+to+ingestion+of+nitrate-contaminated+well+water--LaGrange+County,+Indiana,+1991-1994.">Spontaneous abortions possibly related to ingestion of nitrate-contaminated well water--LaGrange County, Indiana, 1991-1994.</a> MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 45 (26), 569-572 (1996).</li><li>Brender, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+nitrate+intake+from+drinking+water+and+selected+birth+defects+in+offspring+of+participants+in+the+national+birth+defects+prevention+study.">Prenatal nitrate intake from drinking water and selected birth defects in offspring of participants in the national birth defects prevention study.</a> Environ Health Perspect. 121 (9), 1083-1089 (2013).</li><li>Huber, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+dietary+intake+of+nitrates,+nitrites+and+nitrosamines+and+selected+birth+defects+in+offspring:+a+case-control+study.">Maternal dietary intake of nitrates, nitrites and nitrosamines and selected birth defects in offspring: a case-control study.</a> Nutr J. 12, 34 (2013).</li><li>Phillips, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+nitrate+and+nitrite+in+foods+in+relation+to+infant+methaemoglobinaemia.">Naturally occurring nitrate and nitrite in foods in relation to infant methaemoglobinaemia.</a> Food Cosmet Toxicol. 9 (2), 219-228 (1971).</li><li>Moncada, S., Palmer, R. M., Higgs, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide:+physiology,+pathophysiology,+and+pharmacology.">Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology.</a> Pharmacol Rev. 43 (2), 109-142 (1991).</li><li>Gladwin, M. T., Crawford, J. H., Patel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemistry+of+nitric+oxide,+nitrite,+and+hemoglobin:+role+in+blood+flow+regulation.">The biochemistry of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin: role in blood flow regulation.</a> Free Radic Biol Med. 36 (6), 707-717 (2004).</li><li>Gupta, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+acute+respiratory+tract+infections+in+areas+with+high+nitrate+concentrations+in+drinking+water.">Recurrent acute respiratory tract infections in areas with high nitrate concentrations in drinking water.</a> Environ Health Perspect. 108 (4), 363-366 (2000).</li><li>Kross, B. C., Ayebo, A. D., Fuortes, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methemoglobinemia:+nitrate+toxicity+in+rural+America.">Methemoglobinemia: nitrate toxicity in rural America.</a> Am Fam Physician. 46 (1), 183-188 (1992).</li><li>Greer, F. R., Shannon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infant+methemoglobinemia:+the+role+of+dietary+nitrate+in+food+and+water.">Infant methemoglobinemia: the role of dietary nitrate in food and water.</a> Pediatrics. 116 (3), 784-786 (2005).</li><li>Sanchez-Echaniz, J., Benito-Fernandez, J., Mintegui-Raso, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methemoglobinemia+and+consumption+of+vegetables+in+infants.">Methemoglobinemia and consumption of vegetables in infants.</a> Pediatrics. 107 (5), 1024-1028 (2001).</li><li>Virtanen, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrate+and+nitrite+intake+and+the+risk+for+type+1+diabetes+in+Finnish+children.+Childhood+Diabetes+in+Finland+Study+Group.">Nitrate and nitrite intake and the risk for type 1 diabetes in Finnish children. Childhood Diabetes in Finland Study Group.</a> Diabet Med. 11 (7), 656-662 (1994).</li><li>Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-+and+acetaldehyde-mediated+developmental+toxicity+in+zebrafish.">Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish.</a> Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 769-781 (2004).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Loucks, E., Carvan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-dependent+effects+of+developmental+ethanol+exposure+in+zebrafish.">Strain-dependent effects of developmental ethanol exposure in zebrafish.</a> Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 745-755 (2004).</li><li>Bilotta, J., Barnett, J. A., Hancock, L., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+exposure+alters+zebrafish+development:+a+novel+model+of+fetal+alcohol+syndrome.">Ethanol exposure alters zebrafish development: a novel model of fetal alcohol syndrome.</a> Neurotoxicol Teratol. 26 (2), 737-743 (2004).</li><li>Li, J., Jia, W., Zhao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+nitrite+affects+zebrafish+valvulogenesis+through+yielding+too+much+NO+signaling.">Excessive nitrite affects zebrafish valvulogenesis through yielding too much NO signaling.</a> PLoS One. 9 (3), e92728 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods for chemical analysis of water and wastes. , (1983).</li><li>Loucks, E., Ahlgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+teratogenic+changes+in+a+zebrafish+model+of+fetal+alcohol+exposure.">Assessing teratogenic changes in a zebrafish model of fetal alcohol exposure.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li><li>Addiscott, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilizers+and+nitrate+leaching.">Fertilizers and nitrate leaching.</a> Agricultural Chemicals and the Environment, Issues in Environmental Science and Technology. , 1-26 (1996).</li><li>Su, Y. F., Lu, L. H., Hsu, T. H., Chang, S. L., Lin, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+treatment+of+methemoglobinemia+in+an+elderly+couple+with+severe+cyanosis:+two+case+reports.">Successful treatment of methemoglobinemia in an elderly couple with severe cyanosis: two case reports.</a> Journal of Medical Case Reports. 6 (290), (2012).</li><li>Harvey, M., Cave, G., Chanwai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+methaemoglobinaemia+induced+by+self-poisoning+with+sodium+nitrite.">Fatal methaemoglobinaemia induced by self-poisoning with sodium nitrite.</a> Emergency Medicine Australasia. 22, 463-465 (2010).</li><li>Nishiguchi, M., Nushida, H., Okudaira, N., Nishio, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autopsy+case+of+fatal+methemoglobinemia+due+to+ingestion+of+sodium.">An autopsy case of fatal methemoglobinemia due to ingestion of sodium.</a> Forensic Research. 6, (2015).</li><li>Avdesh, A., Chen, M., Martin-Iverson, M. T., Mondal, A., Ong, D., Rainey-Smith, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+Care+and+Maintenance+of+a+Zebrafish+(Danio+rerio)+Laboratory:+An+Introduction.">Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction.</a> J. Vis. Exp. (69), (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+A+tool+for+chemical+screens.">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 185-192 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

השיטה המתוארת כאן ממחיש את התועלת של דג הזברה בהערכת הפוטנציאל טרטוגניות של הניטריט ו חנקתי. בהשוואת חוליות אחרות, יש דג זברה יתרונות הכוללים פוריות גבוהה, הפריה חיצונית, שקיפות אופטית, ואת התפתחות מהירה. מוטציות זמינות חסרות פיגמנטציה (כגון דג זברת קספר 36) גם ל?...

Teratogenesis הוא תהליך המשבש את ההתפתחות הנורמלית של העובר או העובר על ידי גרימת מומים מבניים ותפקודיים קבע, פיגור בגדילה, או הפלה במקרים חמורים 1. זה יכול להיגרם על ידי סוכנים טבעיים מסוימים (teratogens), אשר מפריעים להתפתחות עוברית מספר דרכי 2. במהלך התפתחות עובר אנושית, teratogens הנפוצה כגון קרינה, חומרים מזהמים, מתכות רעילות, וכימיקלים אורגניים דווחה לגרום למומים בקפלים מלוכסנים (לקפל עור מכסה העין העליון) ו clinodactyly (אצבע מעוקלת או בוהן) דרך שגיאות המוךפו&quot;גנטי שהולכות 1. הבנת המנגנון המולקולרי של teratogenesis היא הצעד הראשון לקראת פיתוח טיפול ומניעה. מודלים חוליות כמה כגון אפריקה שרט צפרדע (laevis Xenopus) ו דג הזברה (Danio rerio) שימשו לקביעת מסלולים מולקולריים מושפע teratogens. מחקרים קודמים השתמשו דג הזברה כמודל אפידמיולוגיה, טוקסיקולוגיה teratogenesis 3-7. שולץ et al. דג זברה נחשב &quot;תקן זהב&quot; להערכת רעילות סביבתית. הדבר נובע, בין השאר, על השקיפות של העובר דג הזברה, אשר מאפשר לחוקרים לחזות את פגם התפתחותי כפי שהוא מתרחש 8. כ -70% מן הגנים באדם יש orthologues דג הזברה, מה שהופך דג הזברה כמודל החולייתנים רצוי ללימוד פגמים אנושיים 9. כמה מחקרים אפידמיולוגיים הראו כי ניטראט ניטריט, נפוץ במזונות החווה ומים, קשורים עם מומים מולדים או הפלות ספונטניות 10,11, בעוד מחקרים אחרים אינם תומכים קשר זה 12. ניטראט (NO 3 -) ו ניטריט (NO 2 -) נוכחים באופן טבעי באדמה ובמים. הם מהווים מקור של חנקן לצמחים והם חלק nitrogen מחזור 13. מזונות כגון שעועית ירוקה, גזר, דלעת, תרד, סלק מחוות המשתמשות דשנים גבוה חנקתי חיזקו באופן משמעותי רמות ניטראט ניטריט 7. חלב פרות ניזונים עם מזונות חנקות גבוה ודגים במים חנקות גבוה (בעיקר נגר אדמה 30) יכול להוביל בני אדם לצרוך כמויות גדולות של ניטראט 14 ניטריט. ניטרט ניטריט גם משמשות לשימור מזון, אשר מגדיל באופן דרמטי את כמות מעובדים על ידי בני אדם 12. רמות אופטימליות של ניטראט ניטריט ממלאות תפקידים יסודיים תהליכים פיסיולוגיים כמו הומאוסטזיס וסקולרית ותפקוד, עצבי ומנגנוני הגנה מארחים אימונולוגיים 13-15. עם זאת, חשיפה לרמות גבוהות של ניטראט ניטריט עלול להוביל לתופעות לוואי, במיוחד אצל תינוקות וילדים 16. חנקתי נבלעו הוא עוד המרה ניטריט בחלל הפה על ידי מיקרואורגניזמים וב הדואר מערכת העיכול על ידי מיקרופלורת המעי 17. ניטראט מכניס תינוקות בסיכון גבוה לתסמונת התינוק הכחולה על ידי חמצון של המוגלובין כדי methemoglobin, וכתוצאה מכך נפגעת המוגלובין מהחמצן שלה נושאת יכולת 18. זו התוצאה של הצבע הכחול של עור המשתרע לרקמות היקפיות במקרים חמורים יותר. חמצון עכבות של תוצאות רקמות בתסמינים אחרים, בצורה החמורה ביותר שמוביל תרדמת ומוות 19,20. סימפטומים דומים נצפו אצל תינוקות ומבוגרים בריכוזים גבוהים של ניטראט 21. רמות גבוהות של methemoglobin במבוגרים בשל התוצאות הרעלת ניטריט ב כיחלון, כאבי ראש, הפרעות נשימה 31, ומוות אם אינו מטופל בשל סיבוכים הקשורים היפוקסיה רקמות חיוניות 32,33. ניטרט בליעה ברמות גבוהות יותר גם יכול לגרום לסיבוכים בריאותיים שונים. סוכרת ילדות, שלשולים חוזרים, וזיהומים בדרכי הנשימה חוזרתאצל ילדים נקשרו עם 11,17,22 צריכת חנקות הגבוהה. חשיפה כרונית לרמה של חנקות גבוהה קשורה במתן שתן ודימום טחול. חשיפה במינון גבוה אקוטית חנקות יכול להוביל למגוון רחב של בעיות רפואיות כמו כאבי בטן, חולשת שרירים, דם בצואה ושתן, התעלפות, ומוות 11. חשיפה טרום לידתית חנק ברמות גבוהות כבר משויכת בצינור העצבי פגם שרירים ושלד 11. דו&quot;ח שנערך לאחרונה הראה כי טיפול עוברי דג זברה עם ניטריט הוביל חלמון בצק צק, מומי craniofacial ו ציריים, ולשחות שלפוחית ​​noninflation 5. במחקר זה, אנחנו מדגימים שיטה לטיפול עוברי דג הזברה עם ניטראט ניטריט לקבוע פוטנציאל טרטוגניות שלהם. עוברים שנחשפו ניטריט בריכוזים שונים ואורך זמן שונה. אתנול שמש כביקורת חיובית, שכן הוא teratogen הוקם 23. Oשיטת ur הראו כי הן ריכוזים גבוהים וזמני חשיפה ארוכה ניטריט היו מזיק הישרדות הביאה פנוטיפים שונים, החל (בצקת) מתון עד חמור (פגמים התפתחותיים ברוטו). לכן, דג הזברה הוא מודל יעיל לבדיקה ישירות השפעות טרטוגניות הפוטנציאל של ניטראט ניטריט בעוברים כדי להשלים מחקרים אפידמיולוגיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">DREL/2010 instrument</td>
			<td style="width:185px;">Hach</td>
			<td style="width:104px;">26700-03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">Ethanol</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">KIMAX glass Petri Dish</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">89001-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">MS-222</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">NitraVer 5 Nitrate Reagent</td>
			<td style="width:185px;">Hach</td>
			<td style="width:104px;">14034-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">NitriVer 3 Nitrite Reagent</td>
			<td style="width:185px;">Hach</td>
			<td style="width:104px;">14065-99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">Parafilm</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">3-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">S6E stereomicroscope</td>
			<td style="width:185px;">Leica</td>
			<td style="width:104px;">10446294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">Sodium nitrate</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">S343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">Sodium nitrite</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">S347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">Transfer pipets</td>
			<td style="width:185px;">Laboratory Products Sales</td>
			<td style="width:104px;">L320072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">Glass vials</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">03-338B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish as a model to assess the teratogenic potential of nitrite

רמות ניטראט גבוהות בסביבה עלולות לגרום למומים מולדים או הפלות אצל בני אדם. יש להניח, זה נובע מהמרת ניטראט ניטריט ידי חיידקים במעי רוק. עם זאת, במחקרים יונקים אחרים, רמות ניטריט גבוהה לא לגרום למומים מולדים, אם כי הם יכולים להוביל לתוצאות רבייה עניה. לפיכך, פוטנציאל טרטוגניות של ניטריט לא ברור. זה יהיה שימושי יש מערכת מודל חוליות בקלות להעריך השפעות טרטוגניות של ניטריט או כל חומר כימי אחר שיש בו עניין. כאן אנו להדגים את התועלת של דג הזברה (Danio rerio) כדי לסרוק תרכובות המצויות לרעילות ופגמים עובריים. עוברי דג זברה הם מופרים חיצוניים ויש התפתחות מהירה, מה שהופכים אותם מודל טוב מחקרים טרטוגניות. אנחנו מראים כי הגדלת זמן חשיפה ניטריט משפיע הישרדות שלילית. הגדלת ריכוז של ניטריט גם משפיעה לרעה על הישרדות, ואילו חנק לא. עבור עוברי that לשרוד חשיפה ניטריט, פגמים שונים יכולים להתרחש, כוללים קרום לב ואת החלמון בצק צק, לשחות שלפוחית ​​noninflation, ו מום craniofacial. התוצאות שלנו מעיד כי דג הזברה היא מערכת נוחה ללימוד הפוטנציאל טרטוגניות של ניטריט. גישה זו יכולה בקלות להיות מותאמת כדי לבדוק כימיקלים אחרים והשפיע על התפתחות החולייתנים הראשונה.

החשיפה אתנול 300 מ&quot;מ במשך 22 שעות לא הייתה השפעה על הישרדות (מידע לא מוצג), עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים 5,23,26. זה צפוי, כמו אתנול הוא teratogen ידוע ושימש כביקורת חיובית. פנוטיפים שנצפו כללו בצקת קרום לב, noninflation בשלפוחית ​​שחייה (איור 1), פ?...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite at JoVE.com

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

חשיפת teratogens עלולה לגרום למומים מולדים. דג זברה היא שימושי לקביעת פוטנציאל טרטוגניות של כימיקלים. אנו להדגים את התועלת של דג זברה על ידי חשיפה עוברת לרמות שונות של ניטריט וגם בזמנים שונים של חשיפה. אנו מראים כי ניטריט יכול להיות רעיל ולגרום ליקויים התפתחותיים חמורים.

דג הזברה כמודל להעריך את הפוטנציאל טרטוגניות של ניטריט

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

zebrafish-as-a-model-to-assess-the-teratogenic-potential-of-nitrite

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Immunology and Infection

Unit 1

Adverse Drug Effects and Chemical Toxicity

SCIENTISTS IN ACTION

9.4K Views.  Indiana University of Pennsylvania.  חשיפת teratogens עלולה לגרום למומים מולדים. דג זברה היא שימושי לקביעת פוטנציאל טרטוגניות של כימיקלים. אנו להדגים את התועלת של דג זברה על ידי חשיפה עוברת לרמות שונות של ניטריט וגם בזמנים שונים של חשיפה. אנו מראים כי ניטריט יכול להיות רעיל ולגרום ?...

Video: Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Small animal models such as mice have been extensively used to study human disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of information gained from these studies, the unique characteristics of mouse immunity as well as the species specificity of viral diseases such as human immunodeficiency virus (HIV) infection led to the development of humanized mouse models. The earlier models involved the use of C. B 17 scid/scid mice and the transplantation of human fetal thymus and fetal liver termed thy/liv (SCID-hu) 1, 2 or the adoptive transfer of human peripheral blood leukocytes (SCID-huPBL) 3. Both models were mainly utilized for the study of HIV infection.
One of the main limitations of both of these models was the lack of stable reconstitution of human immune cells in the periphery to make them a more physiologically relevant model to study HIV disease. To this end, the BLT humanized mouse model was developed. BLT stands for bone marrow/liver/thymus. In this model, 6 to 8 week old NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) immunocompromised mice receive the thy/liv implant as in the SCID-hu mouse model only to be followed by a second human hematopoietic stem cell transplant 4. The advantage of this system is the full reconstitution of the human immune system in the periphery. This model has been used to study HIV infection and latency 5-8.
We have generated a modified version of this model in which we use genetically modified human hematopoietic stem cells (hHSC) to construct the thy/liv implant followed by injection of transduced autologous hHSC 7, 9. This approach results in the generation of genetically modified lineages. More importantly, we adapted this system to examine the potential of generating functional cytotoxic T cells (CTL) expressing a melanoma specific T cell receptor. Using this model we were able to assess the functionality of our transgenic CTL utilizing live positron emission tomography (PET) imaging to determine tumor regression (9).
The goal of this protocol is to describe the process of generating these transgenic mice and assessing in vivo efficacy using live PET imaging. As a note, since we use human tissues and lentiviral vectors, our facilities conform to CDC NIH guidelines for Biosafety Level 2 (BSL2) with special precautions (BSL2+). In addition, the NSG mice are severely immunocompromised thus, their housing and maintenance must conform to the highest health standards (<a href="http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html" target="_blank">http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html</a>).

The generation and characterization of tumor specific T cells using humanized mice is described here. Human thymic tissue and genetically modified human hematopoietic stem cells are transplanted into immunocompromised mice. This results in the reconstitution of an engineered human immune system allowing for in vivo examination of anti-tumor immune responses.

שימוש בעכבר האנושי של BLT כמודל לתאי גזע מבוסס Gene Therapy גידול

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system1. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals1. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.
Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.
G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 &deg;C to 30 &deg;C) and infection studies can be conducted between 15 &deg;C to above 37 &deg;C12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD5014, measurement of bacterial survival15,16 and examination of the infection process17. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections18,19.

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Oral and intra haemocolic infection of larvae of the greater wax moth Galleria mellonella is described. This insect can be used to study virulence factors of entomopathogenic as well as mammalian opportunistic bacteria. Rearing of the insects, methods of infection and examples of in vivo analysis are described.

החרקים<em&gt; גלרית mellonella</em&gt; כדגם זיהום רב עצמה כדי לחקור פתוגנזה קטריאלי

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

כימות תגובת Burst נשימה כאינדיקטור של החיסון מולדת בריאות בדג הזברה

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

שימוש<em&gt; Mellonella Galleria</em&gt; כאורגניזם מודל לחקר<em&gt; הלגיונלה pneumophila</em&gt; זיהום

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is provided to induce sepsis of varying severity in mice using the CLP technique. Autophagy is a fundamental tissue response to stress and pathogen invasion. Two current protocols to assess autophagy in vivo in the context of experimental sepsis are also presented here. (I) Transgenic mice expressing green fluorescence protein (GFP)-LC3 fusion protein are subjected to CLP. Localized enhancement of GFP signal (puncta), as assayed either by immunohistochemical or confocal assays, can be used to detect enhanced autophagosome formation and, thus, altered activation of the autophagy pathway. (II) Enhanced autophagic vacuole (autophagosome) formation per unit tissue area (as a marker of autophagy stimulation) can be quantified using electron microscopy. The study of autophagic responses to sepsis is a critical component of understanding the mechanisms by which tissues respond to infection. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the pathogenesis of sepsis, which represents a major problem in critical care medicine.

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method. Current protocols to assess autophagy in vivo in the context of CLP-induced sepsis are presented here: A protocol for measuring autophagy using (GFP)-LC3 mice, and a protocol for measuring autophagosome formation by electron microscopy.

Cecal קשירת ונקר-Induced אלח דם כמודל ללמוד Autophagy בעכברים

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

הדמיה לא פולשנית של התגובה החיסונית המולדת בדגם דג הזברה הזחל של<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; זיהום

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Retroviral תמרה של Helper T תאים כגישה גנטית לחקר מנגנוני בקרת הבידול והתפקוד שלהם

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Overexpression וטיהור האדם<em&gt; Cis</em&gt; פרנליטרונפרפרז ב<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can be utilized as an alternative animal model for the study of virulence, host-pathogen interaction, innate immune response, and drug efficacy. Details for the rearing, care and breeding of the hissing cockroach are provided. We also illustrate how it can be infected with bacteria such as the intracellular pathogens Burkholderia mallei, B. pseudomallei, and B. thailandensis. Use of the hissing cockroach is inexpensive and overcomes regulatory issues dealing with the use of mammals in research. In addition, results found using the hissing cockroach model are reproducible and similar to those obtained using mammalian models. Thus, the Madagascar hissing cockroach represents an attractive surrogate host that should be explored when conducting animal studies.

We present a protocol to utilize the Madagascar hissing cockroach as an alternative non-mammalian animal model to conduct bacterial virulence, pathogenesis, drug toxicity, drug efficacy, and innate immune response studies.

מדגסקר שריקה מקק בתור מודל אלטרנטיבי של בעלי חיים שאינם מידע יונקים לחקור התקפה אלימה, פתוגנזה ואת יעילות התרופה

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...

דג הזברה כמודל להעריך את הפוטנציאל טרטוגניות של ניטריט

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

שימוש בעכבר האנושי של BLT כמודל לתאי גזע מבוסס Gene Therapy גידול

החרקים

כימות תגובת Burst נשימה כאינדיקטור של החיסון מולדת בריאות בדג הזברה

שימוש

Cecal קשירת ונקר-Induced אלח דם כמודל ללמוד Autophagy בעכברים

הדמיה לא פולשנית של התגובה החיסונית המולדת בדגם דג הזברה הזחל של

Retroviral תמרה של Helper T תאים כגישה גנטית לחקר מנגנוני בקרת הבידול והתפקוד שלהם

Overexpression וטיהור האדם

מדגסקר שריקה מקק בתור מודל אלטרנטיבי של בעלי חיים שאינם מידע יונקים לחקור התקפה אלימה, פתוגנזה ואת יעילות התרופה