This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.

1. הכנה של נימי microreactor <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את 100 מיקרומטר קוטר פנימי (ID) x 360 מיקרומטר קוטר חיצוני (OD) נימי באורך של 7-8 ס&quot;מ, ואת נימי 20 מיקרומטר מזהה x 90 מיקרומטר OD 3-5 ס&quot;מ עם קופיץ נימי זכוכית; לאמת תחת מיקרוסקופ כי בשני הקצוות נימי יש חתך נקי, ישר, ללא כל קוצים בולטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את 20 מיקרומטר מזהה x 90 מיקרומטר OD נימי לתוך קצה אחד של נימי OD 100 מיקרומטר מזהה x 360 מיקרומטר, למשך פרק ~ 6 מ&quot;מ; במקרה הצורך, יש למלא אחר המבצע הזה תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל טיפה קטנה של E6000 הדבק סביב צומת של הנימים מזהים 90 מיקרומטר OD / 100 מיקרומטר עם סופו של Q-Tip, ולתת את התרופה הדבקה O / N ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את 20 מוכנס מיקרומטר מזהה x 90 מיקרומטר OD נימי באורך של ~ 10-15 מ&quot;מ; זה יהיה פולט יינון electrospray. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לחתוך באמבטיה &quot;OD הצצה, 1/16&quot; הצצה OD ו 1/16 &quot;OD PTFE 1/32ing לחתיכות של 4-5 ס&quot;מ אורך; אלה יהיו השרוולים המשמשים איגודים נימי למתן חיבור חופשי דליפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הקצה השני של נימי OD 100 מיקרומטר מזהה x 360 מיקרומטר לאיחוד הצצה; להשתמש שרוול 1/32 &quot;הצצה למתן חיבור דליפה חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס / להדק פיסת ~ 5 ס&quot;מ 1/16 &quot;צינורות PTFE אל הקצה השני של האיגוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול ~ 4 מ&quot;ג של C18 (5 מיקרומטר) חלקיקים בתוך מראש לנקות / יבשים 2 בקבוקון זכוכית מ&quot;ל; להוסיף 0.5 מ&quot;ל isopropanol, לסגור את הבקבוקון לפזר את התערובת הדלילה באמבטיה ultrasonicator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משיכה עם מזרק 250 μl כ 200 סלארי μl, הכנס את מחט המזרק בצינור 1/16 &quot;PTFE של האיגוד הצצה, ולחלק את התערובת הדלילה לאט לתוך נימי OD 100 מיקרומטר מזהה x 360 מיקרומטר; להתבונן תחת מיקרוסקופ כמו נימים מתמלאות חלקיקים עד אורך של אריזת 2-3 מ&quot;מ מושגת; זה יהיה microreactor (איור 1) 20 μ.נימים מ מזהה שומרות על חלקיקי microreactor דרך שפעת Keystone. 15 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את microreactor עם ~ 50 μl פתרון של H 2 O / CH 3 CN 50:50 v / v, ולאחר מכן עם ~ 50 μl פתרון של H 2 O / CH 3 CN 98: 2 V / V. </li></ol> 2. הכנת פתרונות לדוגמא הערה: תפעול הכרוכות בטיפול של ממיסים אורגניים וחומצות והכנת הפתרון הם להתבצע במנדף. תלבש משקפי מגן, כפפות וביגוד מגן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם CH 3 OH ולייבש כמה צלוחיות זכוכית (4 מ&quot;ל) צינורות פוליפרופילן (15 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ל של פתרון של H 2 O / CH 3 CN (98: 2 V / V) בתוך צינור פוליפרופילן 15 מ&quot;ל ידי ערבוב 9.8 מ&quot;ל H 2 O עם 200 μl CH 3 CN; ומערבבים על ידי sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ל של פתרון של H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) בתוך צינור פוליפרופילן 15 מ&quot;ל על ידי ערבוב 5 מ&quot;ל H 2 &lt;/ sub&gt; O עם 5 מ&quot;ל CH 3 CN; ומערבבים על ידי sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4 מ&quot;ל של תמיסה מימית acidified (נ 0.01% TFA / v) על ידי הוספת 4 μl TFA (10%) ל -4 מ&quot;ל H 2 O / CH 3 CN (98: 2 V / V) בבקבוקון זכוכית 4 מ&quot;ל; ומערבבים על ידי sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4 מ&quot;ל של פתרון אורגני acidified (נ 0.01% TFA / v) על ידי הוספת 4 μl TFA (10%) ל -4 מ&quot;ל H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) בקבוקון זכוכית 4 מ&quot;ל; ומערבבים על ידי sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 16 מ&quot;ג NH 4 HCO 3 עם microbalance אנליטיות בקבוקון זכוכית 4 מ&quot;ל; להוסיף 4 מ&quot;ל של H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) פתרון ולפזר על ידי sonication; הדבר גורם פתרון 50 מ&quot;מימ של NH 4 HCO 3 (pH ~ 7.8) במאגר מימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 5 מ&quot;ג של חלבון סטנדרטי (למשל, אלבומין בסרום שור, המוגלובין α / β, ציטוכרום C, anhydrase פחמתית, α-2-HS-גליקופרוטאין, וכו &#39;) עם microbalance אנליטיות בקבוקון זכוכית 4 מ&quot;ל; להוסיף שתייה DI 4 מ&quot;לr ולפזר על ידי sonication; זה בדרך כלל תוצאות פתרון ריכוז גבוהה מיקרומטר-רמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מ&quot;ל פתרון חלבון (1-2 מיקרומטר) על ידי דילול פתרון ריכוז מיקרומטר ברמה גבוהה עם נפח מתאים של NH 4 HCO 3 (50 מ&quot;מ) חיץ מימית; ומערבבים על ידי sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון טריפסין (5 מיקרומטר) על ידי המסת טריפסין 20 מיקרוגרם רצף כיתה ב 170 μl NH 4 HCO 3 (50 מ&quot;מ) חיץ מימית; לפזר על ידי sonication. </li></ol> 3. הגדרת ניסוי הערה: מערכת LTQ-MS מצויד מקור ESI שונה הכוללת XYZ שלבית מובנה הביתה המאפשר התממשקות של ספקטרומטר מסה לגישות קלט מדגם שונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתקתי את microreactor הנימים מהאיגוד הצץ ולהתחבר טי הצץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס ~ 2 ס&quot;מ חוט Pt בזרוע בצד של טי הצצה; להשתמש שרוול הצצה &quot;1/32 למתןדליפה ללא חיבור עבור בידוד חוט Pt. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר OD 50 מיקרומטר מזהה x 360 מיקרומטר (~ 0.5 מ &#39;אורך) נימי מדגם העברה לקצה השני של טי הצצה; להשתמש שרוול 1/32 &quot;הצצה למתן חיבור דליפה חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את טי הצצה על הבמה-XYZ ומקם את מ&quot;מ ESI פולט ~ 2 הרחק נימי מפרצון ספקטרומטר מסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הכבל Pt למקור אספקת החשמל ESI של ספקטרומטר מסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הקצה השני של נימי העברת מדגם לאיחוד נירוסטה; להשתמש שרוול 1/16 &quot;הצצה למתן חיבור דליפה חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר צינורות PTFE 1/16 &quot;4-5 ס&quot;מ עד הסוף השני של האיחוד נירוסטה להכניס את המחט במזרק 250 μl בצינור PTFE; להפעיל את המשאבה ולהגדיר את קצב הזרימה לפי השווי הרצוי (למשל, 2 μl / min). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרמטרי רכישת נתוני הקלט טנדם MS לתוך חבילת התוכנה שולטת מכשיר MSd לשמור כקובץ שיטה ולהכין את ההתקנה לביצוע הניתוח; עבור מערכת LTQ-MS, השתמש בפרמטרי ניתוח הנתונים התלויים הבאים: הדרה דינמית הופעל עבור 180 שניות עם רוחב המוני הדרת ± 1.5 מ &#39;/ z; אחד MS סריקה ואחריו זום אחד ו- MS 2 סריקות על 5 הפסגות האינטנסיביות ביותר העליונות, זום רוחב סריקת ± 5 מ &#39;/ z; דיסוציאציה התנגשות מושרה (CID) פרמטרים שנקבעו ברוחב בידוד 3 מ &#39;/ z, אנרגית התנגשות מנורמלת 35%, ש הפעלת 0.25, וזמן הפעלה של 30 מילים-שניות. </li></ol> 4. הגדרת Microfluidic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן מכשיר microfluidic זכוכית או מצעים פולימריים; 16-18 הפריסה של המכשיר מסופקת 2A איור, מורכב microreactor (1) (אורך רוחב 0.13 מ&quot;מ x 2 מ&quot;מ x 50 מיקרומטר עמוקים) מחוברים כניסה (2 ), מוצא (3) וכן יציאה בצד (4); ערוצי מקשרות מניפולציות fluidic הם ~110 מיקרומטר רחב ו ~ 50 מיקרומטר עמוק; מבנה רב (5), מורכב ~ 1.5-2 מיקרומטר עמוק x 10 מיקרומטר x הרחב 100 מיקרומטר microchannels הארוך להציב 25 מיקרומטר בנפרד, יפעל כמסנן עבור שמירה על חלקיקי microreactor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל חיבורים נוזלים למסירת השבב על ידי הדבקת מחברים מיוחדים ליציאות המפרצון, או על ידי המצאת עמדת פולימריים המתאימה אבזרים למסירת נוזל (איור 2 ב). 16 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תרחיף של חלקיקים C18 (5 מיקרומטר) כמתואר בשלב 1.8; לספק את התערובת הדלילה אל microreactor עם מזרק באמצעות צינורות 1/16 &quot;PTFE המחובר ליציאת שבב הצד (4); לאטום את הנמל לאחר טעינת חלקיק עם דבק אפוקסי תרופה עבור שעה 1 בתנור ב 90 ºC 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס נימי (20 מיקרומטר מזהה x 90 מיקרומטר OD x 10 מ&quot;מ אורך) בנמל לשקע, חותם עם דבק E6000, ולתת תרופה O / N; זה יהפוך את פולט ESI ( <sטרונג&gt; 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר OD 50 מיקרומטר מזהה x 360 מיקרומטר (~ 0.5 מ &#39;אורך) נימי מדגם העברה לנמל כניסת שבב (2); חבר את הקצה השני של נימי מזרק μl 250 ואת משאבת מזרק, כמתואר 3.6-3.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח מחבר הצצה טי קל משקל על קו העברת מדגם קצר לפני יציאת הכניסה (2) והכניס תיל Pt על הזרוע בצד של טי, כמתואר 3.2; זה יהיה האלקטרודה ESI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את המכשיר microfluidic על הבמה XYZ עם פולט ESI ממוצבת ~ 2 מ&quot;מ מן נימי מפרצון ספקטרומטר מסה; להכין את MS לניתוח כמתואר 3.8. </li></ol> 5. טוען לדוגמא, פרוטאוליטים עיכול Elution עבור ניתוח MS הערה: כל השלבים העברה פתרון / מדגם מבוצעים בעזרת משאבת מזרק וצריך לאפשר לכמה דקות נוספות כדי להשלים, כדי לפצות על-volum מתes הקשורים קווי העברה ומן microreactor; את הזמן הדרוש יהיה תלוי את הספיקות מעורבות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את microreactor ולהכינו ניתוח על ידי יציקת בתמיסה מימית של NH 4 HCO 3 (50 מ&quot;מ) H 2 O / CH 3 CN (98: 2 V / V) בשעה 2 μl / דקה 5 דקות; להשתמש במזרק 250 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טענו מדגם החלבון (1 מיקרומטר) על microreactor ידי יציקת הפתרון המדגם ב 2 μl / דקה 5 דקות; להשתמש במזרק 250 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות את הפתרון טריפסין (5 מיקרומטר) על חלבון adsorbed על microreactor ב 2 μl / דקה במשך 1-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את תהליך העיכול פרוטאוליטים על ידי שטיפת microreactor עם בתמיסה מימית acidified של TFA (0.01% v / v) H 2 O / CH 3 CN (98: 2 V / V) בשעה 2 μl / דקה 5 דקות; להשתמש במזרק 250 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל משחררי החלבון לעכל מן microreactor על ידי יציקת פתרון אורגני acidified של TFA (0.01%v / v) H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) ב 300 NL / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תהליך רכישת נתונים MS ואת מתח ESI (~ 2,000 V); לרכוש נתונים MS באמצעות הפרמטרים רכישת נתונים הניתנים בשלב 3.8; להתבונן elution של פפטידים tryptic. </li></ol> 6. עיבוד נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את הנתונים MS טנדם עם מנוע חיפוש תואם לפורמט נתונים MS גלם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את קבצי גלם LTQ-MS באמצעות אורגניזם ספציפי מינימאלי מסד נתוני חלבון מיותר; להעלות את הנתונים הגולמיים של מנוע החיפוש, להגדיר את העמידות המוני הורה שבר יון ל Da 2 ו -1, בהתאמה, ולהשתמש רק שברי tryptic מלא עם עד שני החמיץ שסעים עבור החיפוש; אינו מאפשר שינויי posttranslational; להגדיר את שיעורי גילוי הגבוהים וביטחון בינוני שווא (FDR) עד 1% ו -3%, בהתאמה, אינו מאפשר שינויי posttranslational. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנן את הנתונים כדי לבחור ברמת ודאות גבוהה רקפפטיד תואם את החלבונים המופיע במאגר; להעריך את תוצאות חלבון פפטיד-רמה. </li></ol>

<ol>
	<li>Petersen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Bioreactors.">Microfluidic Bioreactors.</a> Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , (2014).</li><li>Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+and+applications+of+immobilized+microfluidic+enzymatic+reactors.">Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors.</a> J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).</li><li>Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+enzymatic+reactors+for+proteome+research.">Microfluidic enzymatic reactors for proteome research.</a> Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).</li><li>Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+enzymatic-reactors+for+peptide+mapping:+strategy,+characterization,+and+performance.">Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance.</a> LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).</li><li>Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microchip-based+proteolytic+digestion+system+driven+by+electroosmotic+pumping.">A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping.</a> LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).</li><li>Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-immobilized+microfluidic+process+reactors.">Enzyme-immobilized microfluidic process reactors.</a> Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).</li><li>Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microfluidic+enzyme+reactor+mass+spectrometry+platform+for+detection+of+anthrax+lethal+factor.">Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor.</a> , 1071-1074 (2009).</li><li>Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+microfluidic+enzyme+reactor+utilizing+magnetic+beads.">Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads.</a> Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).</li><li>Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticle+assembly+microfluidic+reactor+for+efficient+on-line+proteolysis.">Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).</li><li>Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titania+and+alumina+sol-gel-derived+microfluidics+enzymatic-reactors+for+peptide+mapping:+design,+characterization,+and+performance.">Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance.</a> J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).</li><li>Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+protein+digestion+through+the+confinement+of+nanozeolite-assembled+microchip+reactors.">Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors.</a> Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).</li><li>Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+enzyme+reactor+and+high+resolving+chromatography+in+&amp;#34;sub-chip&amp;#34;+dimensions+for+sensitive+protein+mass+spectrometry.">Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in &amp;#34;sub-chip&amp;#34; dimensions for sensitive protein mass spectrometry.</a> Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).</li><li>Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave-enhanced+enzyme+reaction+for+protein+mapping+by+mass+spectrometry:+A+new+approach+to+protein+digestion+in+minutes.">Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes.</a> Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).</li><li>Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-assisted+sample+preparation+for+proteomic+analysis.">Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis.</a> Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).</li><li>Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tapers+and+restrictors+for+capillary+electrochromatography+and+capillary+electrochromatography-mass+spectrometry.">Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).</li><li>Lazar, I. M., Kabulski, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+LC+Device+with+Orthogonal+Sample+Extraction+for+On-Chip+MALDI-MS+Detection.">Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection.</a> Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).</li><li>Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis+and+sample+injection+systems+on+a+planar+glass+chip.">Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip.</a> Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).</li><li>Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Injection+Schemes+and+Column+Geometry+on+the+Performance+of+Microchip+Electrophoresis+Devices.">Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices.</a> Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).</li><li>Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Proteomic+Protocol+for+Biomarker+Fingerprinting+in+Cancerous+Cells.">Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).</li><li>Doucette, A., Craft, D., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometric+Study+of+the+Effects+of+Hydrophobic+Surface+Chemistry+and+Morphology+on+the+Digestion+of+Surface-Bound+Proteins.">Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).</li><li>Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Liquid+Chromatography+System+for+Proteomic+Applications+and+Biomarker+Screening.">Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening.</a> Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).</li><li>Lazar, I. M., Karger, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Open-Channel+Electroosmotic+Pumping+System+for+Microfluidic+Sample+Handling,&amp;#34.">Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,&amp;#34.</a> Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).</li><li>Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+TOFMS+Detection+for+Capillary+Electrophoresis.">High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis.</a> Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Microreactor המתואר בעבודה זו מספק קל ליישם התקנה ניסיונית לביצוע עיכול אנזימטי של חלבונים כדי לאפשר ניתוח MS והזדהות תוך פחות מ -30 דקות. היתרונות הברורים של מערכת זו, בהשוואת גישות קונבנציונליות, כוללים פשטות, מהירות, צריכת מגיב נמוכה ועלויות נמוכות. בפרט, אין צורך חרוזי מח?...

זיהוי ואפיון של חלבונים מטוהרים מושגת לעתים קרובות על ידי שימוש בטכניקות MS. החלבון מתעכל עם אנזים ופפטידים שלה מנותחים עוד יותר על ידי MS באמצעות התקנה ניסיונית עירוי פשוט. עיכול פרוטאוליטים הכרחי להפקה שברי פפטיד קטנים שנופלים הטווח המוני השימושי של רוב מנתחי MS, וזה יכול להיות מקוטע בקלות דרך התנתקות מושרה התנגשות אנרגיה נמוכה להפקת מידע רצף חומצות האמיניות. עבור חלבונים מבודדים או תערובות חלבון פשוט, אין צורך עוד הפרדה chromatographic של פפטידים לפני גילוי MS. תערובת של פפטידים 25-50 להיות יכולה לנתח בקלות על ידי יציקת המדגם עם משאבת מזרק ישירות מקור יון MS. ספקטרומטר המסה יכול לבצע את הניתוח ולאשר את הרצף של חלבון בתוך מסגרת זמן קצרה. בעזרת שיטות איסוף הנתונים מודרניות, תהליך זה יכול להתבצע within כמה דקות או אפילו שניות. הגורם המגביל בהשלמת התהליך על בקנה מידת זמן קצר הוא צעד העיכול פרוטאוליטים. בדרך כלל, זה מתבצע על פני כמה שעות (או O / N), בתמיסה, ב 37 ºC, באמצעות מצע: יחסי אנזים של (50-100): 1. כדי לצמצם את זמן עיכול אנזימטי לדקות או שניות, microreactors אנזים משותק, בצורה של כורי microfluidic או מחסניות זמינות מסחרי, תוארו. 1-6 בדרך כלל, האנזים הוא משותק על ידי קוולנטיים, הלא קוולנטיים / ספיחה פיזית, מורכב היווצרות או אנקפסולציה, 3,6 יעילות משופרת של תהליך אנזימטי מתאפשר בזכות יחסי קרקע-נפח האנזים אל המצע גדול. יתרונות נוספים של כורים משותקים כוללים מופחת autolysis והתערבות של האנזים בניתוח MS, שיפור יציבות אנזים ויכולת שימוש חוזר. מגוון של גישות, באמצעות זכוכית או מכשירי microfabricated פולימריים תואר,באמצעות אנזימים משותקים על חרוזים מגנטיים ידי אינטראקציות נוגדן-אנטיגן, 7,8 הלכוד רשתות ננו-חלקיקים מזהב, 9 גלומים סול ג&#39;ל טיטניה-אלומינה 10 ו nanozeolites, 11 או נתפסו באמצעות Ni-נ.ת.ע או ההיווצרות המורכבת-Tag שלו. 6 לחלופין נימים, פתוח צינורי עם קיבוע אנזימים פותחו, כמו גם. 12 יתר על כן, מחשוף פרוטאוליטים משופר הודגם באמצעות הקרנת מיקרוגל מבוקר 13 או לחץ בסיוע או לחץ טכנולוגית אופניים (PCT) לצמצום זמני התגובה ל 30-120 דקות. 14 למרות היתרונות המרובים של כורי אנזים משותקים, העלויות של מחסניות מסחריות היא גבוהות, הזמין של מכשירי microfluidic לשימוש שיגרתי מוגבל, ושימוש תוצאות טכנולוגיות מיקרוגל או PCT ב צורך במכשור נוסף. מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח שיטה כי circumveNTS החסרונות האלה, וזה יכול להיות מיושם בקלות בכל מעבדה להעצים חוקרים עם גישה פשוטה ויעילה לביצוע מחשוף אנזימטי של חלבונים כהכנה לניתוח MS בתוך דקות. הגישה מתבססת על השימוש הידרופובי, C18-חלקיקים שהם שנטענו מראש נימים או מכשיר microfluidic, ואת הספיחה של החלבון (ים) של עניין על חלקיקים אלה ואחריו עיכול אנזימטי במהלך העירוי של האנזים על מיטה וחלבון שנתפס ארוז (ים). לפי גישה זו, המצע הוא משותק באמצעות קישור לא קוולנטי, ואת האנזים הוא החדיר מעל החלבון ההמום. יעילות עיכול פרוטאוליטים מוגברת על-ידי אזורים פני החלקיקים גדולים החושפים את חלבון לעיבוד האנזימטית, מרחקים וזמני דיפוזיה אל מפני השטח של חלקיקים, שיפור העברת המוני, לא מצורף קוולנטיים שעשויים להשפיע על פעילותו של האנזים, היכולת במהירות evaluatשילובי דואר של אנזימים שונים, disposability, ריבוב אם התהליך מבוצע במתכונת microfluidic. גישה זו באה לידי ביטוי עם השימוש תערובת של חלבונים סטנדרטיים טריפסין-האנזים הנפוץ ביותר לעיכול פרוטאוליטים לפני גילוי ESI-MS. ספקטרומטר מסה משמש לגילוי במחקר זה היה quadrupole מלכודת ליניארי המכשיר (LTQ).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ion trap ESI-MS</td>
			<td>Thermo Electron</td>
			<td>LTQ</td>
			<td>The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ stage</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Multiple parts</td>
			<td>The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>G81-278</td>
			<td>The microscope is used to observe the microreactor packing process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance/Metler</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46600-204</td>
			<td>The balance is used to weigh the protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath/Branson</td>
			<td>VWR</td>
			<td>33995-540</td>
			<td>The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump 22</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>552222</td>
			<td>The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q ultrapure water system&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ZD5311595&#160;</td>
			<td>The MilliQ water system is used to prepare purified DI water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor/Eppendorf (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53513-410</td>
			<td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor/Eppendorf (100 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53513-406</td>
			<td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor/Eppendorf (10 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53513-402</td>
			<td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary (100 &#181;m ID x 360 &#181;m OD)</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>TSP100375</td>
			<td>This capillary is used for the fabrication of the microreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary (20 &#181;m ID x 100 &#181;m OD)</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>TSP020090</td>
			<td>This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary (50 &#181;m ID x 360 &#181;m OD)</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>TSP050375</td>
			<td>This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary cleaver</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>23740-U</td>
			<td>This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>Eclectic Products</td>
			<td>E6000 Craft</td>
			<td>This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Epo-Tek</td>
			<td>353NDT</td>
			<td>This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversed phase C18 particles (5 &#181;m)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Zorbax 300SB-C18</td>
			<td>These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe/glass (250 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81130-1725RN</td>
			<td>The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal reducing PEEK Union (1/16&#8221; to 1/32&#8221;)</td>
			<td>Valco</td>
			<td>ZRU1.5FPK</td>
			<td>This union is used to connect the 250 &#181;L syringe to the microreactor for loading the 5 &#181;m particle slurry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel union (1/16&#8221;)</td>
			<td>Valco</td>
			<td>ZU1XC</td>
			<td>The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume PEEK Tee connector (1/32&#8221;)</td>
			<td>Valco</td>
			<td>MT.5XCPK</td>
			<td>The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tee connector (light weight)</td>
			<td>Valco</td>
			<td>C-NTXFPK</td>
			<td>This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pt wire (0.404 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66260-126</td>
			<td>The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (1/16&#8221; OD)</td>
			<td>Valco</td>
			<td>TTF115-10FT</td>
			<td>The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing (0.015&#8220; ID x 1/16&#8221; OD)</td>
			<td>Upchurch Scientific</td>
			<td>1565</td>
			<td>The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 &#181;m ID transfer capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing (0.015&#8221; ID x 1/32&#8221; OD)</td>
			<td>Valco</td>
			<td>TPK.515-25</td>
			<td>The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean-cut polymer tubing cutter</td>
			<td>Valco</td>
			<td>JR-797</td>
			<td>This cutter is used to pre-cut the 1/16&#8221; and 1/32&#8217; Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber vial (2 mL)</td>
			<td>Agilent&#160;</td>
			<td>HP-5183-2069</td>
			<td>The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber vial (4 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66011-948</td>
			<td>The vials are used to prepare sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tube (15 mL)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-286D</td>
			<td>The vials are used to prepare buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylinder (100 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24710-463</td>
			<td>The cylinder is used to measure volumes of solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylinder (10 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24710-441</td>
			<td>The cylinder is used to measure volumes of solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-386</td>
			<td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (100 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53503-781</td>
			<td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (10 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53511-681</td>
			<td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass substrates</td>
			<td>Nanofilm</td>
			<td>B270 white crown, 3&#8221; x 3&#8221;</td>
			<td>These are glass substrates for microchip fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male nut fitting (1/16&#8221;)</td>
			<td>Upchurch</td>
			<td>P203X</td>
			<td>This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoport assembly</td>
			<td>Upchurch</td>
			<td>N-122H</td>
			<td>This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standards</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Multiple #</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol, HPLC grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, sequencing grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast enzymatic processing of proteins for ms detection with a flow-through microreactor

הרוב המכריע של ספקטרומטריית מסה (MS) מבוסס שיטות ניתוח חלבון בה התקדמות עיכול אנזימטי לפני הגילוי, בדרך כלל עם טריפסין. שלב זה הכרחי עבור הדור של פפטידים בעלי משקל מולקולרי קטן, בדרך כלל עם MW &lt;3,000-4,000 Da, כי ליפול בתוך טווח סריקה יעילה של מכשור ספקטרומטריית מסה. פרוטוקולים קונבנציונליים לערב עיכול אנזימטי O / N ב 37 ºC. ההתקדמות שחלה באחרונה הוביל לפיתוח של מגוון רחב של אסטרטגיות, בדרך כלל בתחום השימוש של microreactor עם קיבוע אנזימים או של מגוון רחב של תהליכים פיזיקליים משלימים המפחיתים את הזמן הדרוש לעיכול פרוטאוליטים לכמה דקות (למשל, מיקרוגל או גבוהה לַחַץ). בעבודה זו, אנו מתארים גישה פשוטה וחסכונית שיכול להיות מיושמת בכל מעבדה להשגת עיכול אנזימטי מהיר של חלבון. החלבון (או תערובת החלבונים) היא adsorbed על Perf הגבוהה C18-בונדד התהפכו פאזייםormance כרומטוגרפיה נוזלי (HPLC) חלקיקי סיליקה נטענו מראש טור נימים, טריפסין חיץ מימי הוא החדיר מעל החלקיקים לתקופה קצרה של זמן. כדי לאפשר on-line זיהוי MS, פפטידים tryptic הם eluted עם מערכת ממס עם תוכן אורגני גדל ישירות למקור MS יון. גישה זו תמנע את השימוש של חלקיקי קיבוע אנזימים יקרן ואינו מצריכה כל עזרה שתגיע להשלמת התהליך. עיכול חלבון וניתוח מדגם מלא ניתן להשיג בפחות מ ~ 3 דקות ו ~ 30 דקות, בהתאמה.

תוצאת נציג של תהליך עיכול פרוטאוליטים בצעה בו זמנית על תערובת של חלבונים, עם microreactors המתואר לעיל (איורי 1 או 2), מופיע בלוח 1. הטבלה כוללת רצף הפפטידים הייחודי לזהות חלבון מסוים, הצלב מתאם ציון (Xcorr) (כלומר, ציון המאפיין את איכות המ?...

Watch this Scientific Journal Video about Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor at JoVE.com

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

עיבוד אנזימתי תענית חלבונים עבור איתור MS עם microreactor זרימה דרך

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

fast-enzymatic-processing-proteins-for-ms-detection-with-flow-through

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.9K Views.  Virginia Tech. A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

Video: Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Postproduction עיבוד Fibres Electrospun עבור הנדסת רקמות

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

עור מלא פגמים דגם להערכת כלי דם של Biomaterials<em&gt; בVivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

הידרוג&#39;ל Nanoparticle קציר של פלזמה או שתן לגילוי חלבונים שפע נמוך

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. However, to achieve robust sample manipulation it is necessary to address device integration with the macroscale environment. To realize repeatable, sensitive particle separation with microfluidic devices, this protocol presents a complete automated and integrated microfluidic platform that enables precise processing of 0.15&#8211;1.5 ml samples using microfluidic devices. Important aspects of this system include modular device layout and robust fixtures resulting in reliable and flexible world to chip connections, and fully-automated fluid handling which accomplishes closed-loop sample collection, system cleaning and priming steps to ensure repeatable operation. Different microfluidic devices can be used interchangeably with this architecture. Here we incorporate an acoustofluidic device, detail its characterization, performance optimization, and demonstrate its use for size-separation of biological samples. By using real-time feedback during separation experiments, sample collection is optimized to conserve and concentrate sample. Although requiring the integration of multiple pieces of equipment, advantages of this architecture include the ability to process unknown samples with no additional system optimization, ease of device replacement, and precise, robust sample processing.

This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15&#8211;1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.

פלטפורמת microfluidic לעיבוד מדגם Precision הקטן-נפח ושימוש בו לגודל חלקיקים הביולוגיים נפרדים עם Microdevice אקוסטי

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

איתור רגיש של פעילות זריעת Proteopathic עם סריג cytometry הזרימה

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

סינתזה מיקרוגל מונחה של תחמוצת ברזל חלקיקים עבור איתור מהיר של טרשת עורקים

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

סינתזה של Cationized Magnetoferritin עבור המגנטיזציה אולטרה-מהירה של תאים

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

פלטפורמת microfluidic עם איתור Multiplexed אלקטרוני למערכות מעקב מרחבית של חלקיקים

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

עיבוד אנזימתי תענית חלבונים עבור איתור MS עם microreactor זרימה דרך

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video