This work was supported by FIRB-Merit grants RBNE08YFN3_005 and RBNE08HWLZ_012, and the Italian Ministry of Economy and Finance to the CNR for the Project &#8220;FaReBio di Qualit&#224;&#8221;.

1. הכן את פתרונות siRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend 5 nmol של מקושקשת (Ctrl) ו -5 nmol של כדורים מיובשים BRCA2 siRNA במים RNase ללא 100 μl (ריכוז siRNA סופי: 50 מיקרומטר). זהו מניית siRNA וחייבים להיות מאוחסנים ב -20 ° C ב 10 aliquots μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot של 10 μl ממניות siRNA ולהוסיף 40 μl מים RNase ללא להשיג הפתרון עובד 10 מיקרומטר siRNA. דילול זה חייב להיות מאוחסן ב -20 ° C עד לשימוש. הערה: הפתרון עובד siRNA לא צריך לעבור הקפאה / פשרה יותר מ 3 פעמים. </li></ol> 2. זריעה של שורות תאי אפיתל האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום גידול משורות תאי אפיתל אדם גדלו כמו monolayers תא בצלחות תרבית רקמת חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בצלחת פעם אחת עם RT PBS (10 מיליליטר של PBS לצלחת 100 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתק את התאים מהצלחת,להוסיף 2 מיליליטר של טריפסין 0.25% / 0.53 פתרון mM EDTA ודגירה 3-5 דקות, תלוי בסוג התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני איסוף התאים מנותקים, לנטרל טריפסין על ידי הוספת 2 מיליליטר של מדיום גידול מלא המכיל 10% בסרום שור עוברי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי צינור 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב320-330 XG במשך 3 דקות על 4 מעלות צלזיוס בהרוטור דלי מתנדנד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדורי תא ב5 מיליליטר של מדיום אנטיביוטיקה-חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים תחת מיקרוסקופ בתא &quot;שודד גופות או על ידי שימוש במערכת ספירה אוטומטית בהתאם להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי התאים בצלחות 6-גם להיות מחוברים כ -80% לאחר 24 שעות (0.5-1 x10 6 תאים ב 2 מיליליטר של מדיום לכל טוב). מספר תאים אופטימלי לזרע עשוי להשתנות בהתאם לשורות תאים הספציפיות וקצב הצמיחה. הערה: אל תוסיף אנטיביוטיקה במדיום בשלב זה בגלל אנטיביוטיקה שלילי להפריע ליעילות של transfeסיפורת. זה מאוד חשוב כי התאים במעברים נמוכים תרבות (&lt;10) כדי להשיג יעילות גבוהה של transfection BRCA2 siRNA. </li></ol> 3. תאי Transfect עם siRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עשרים וארבע שעות לאחר ציפוי התאים, להמשיך בסיבוב הראשון של transfection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 6 μl של מגיב transfection שומנים מבוסס siRNA ספציפי 10 ב -130 μl של מדיום סרום מופחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 3 μl של 10 מיקרומטר siRNA (30 pmol) ב -130 μl של מדיום סרום מופחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את siRNA המדולל עם מגיב transfection המדולל ודגירה של 5-10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, להסיר את המדיום מן התאים ולהוסיף 2 מיליליטר של מדיום טרי מחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס (ללא אנטיביוטיקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של המתחמים מגיב siRNA-transfection לתאים (סכום זה הוא לטוב אחד של צלחת 6-היטב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים בחממה humidified ב 3776; C עם 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, להמשיך בסיבוב השני של transfection ידי חזרה על שלבי 3.1.1-3.1.5 עם השינוי הבא לצעד 3.1.2: לדלל 5 μl של 10 מיקרומטר siRNA (50 pmol) ב -130 μl של מדיום סרום מופחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים במשך 1-2 ימים על 37 מעלות צלזיוס לפני הניתוח. הערה: שני סבבים של transfections ושימוש ביחס מגיב siRNA / transfection הגבוה בסיבוב השני הם חיוניים כדי לקבל יעילות גבוהה של השתקת BRCA2. </li></ol></li></ol> 4. תאי Lyse לניתוח immunoblotting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר תמוגה טרי עם PBS (pH 7.4) המכיל 1% מאינם denaturing octylphenoxypolyethoxyethanol nonionic, חומרי הניקוי, pyrophosphate נתרן 5 מ&quot;מ, orthovanadate נתרן 1 מ&quot;מ, פלואוריד נתרן 10 מ&quot;מ, פלואוריד phenylmethylsulfonyl 2 מ&quot;מ, 10 מיקרוגרם / מיליליטר leupeptin, 10 מיקרוגרם / מיליליטר aprotinin. שמור את זה על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום מן התאים וwאפרם פעם אחת עם PBS הקר (2 מיליליטר / טוב) בצלחת. כדי למנוע כל שריד PBS, להסיר אותו לחלוטין מהצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של חיץ תמוגה היטב כל אחד. הערה: אם התאים צריכים לשמש גם למבחנים אחרים, trypsinize התאים כמתואר בשלב 2.1-2.6 וresuspend התאים במאגר / בינוני מתאימים בהתאם ליישום לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לסובב את הצלחת להפיץ באופן אחיד מאגר תמוגה ודגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C על הכתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את lysate התא בצינור microcentrifuge על קרח באמצעות מגרד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 17900 XG במשך 25 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולאסוף את supernatant בצינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ריכוז החלבון באמצעות assay חלבון זמין מסחרי על פי הוראות היצרן. </li></ol> ניתוח immunoblotting 5. BRCA2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המאגר פועל על ידי דילול 50 מיליליטר של 20x טריס-אצטט SDS ב פועליםuffer (50 מ&quot;מ tricine, 50 מ&quot;מ טריס בסיס, 0.1% SDS, pH 8.24) עם 950 מיליליטר של מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדגם באופן הבא: להוסיף 15 מיקרוגרם בסך הכל lysate תא, 5 μl של חיץ מדגם 4x מכיל סולפט dodecyl ליתיום ב- pH 8.4, 2 μl 10x מדגם סוכן צמצום (0.5 M DTT) של, ומאגר תמוגה לנפח סופי של 20 μl. הערה: פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של BRCA2 בשורות תאים נורמלים גם בעת שימוש בכמות נמוכה יותר של חלבונים כולל (עד 5 מיקרוגרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל דגימות ב 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הערה: זה חיוני כדי להשתמש 55 מעלות צלזיוס. מאז חלבון BRCA2 הוא thermosensitive 11, טמפרטורות denaturing גבוהות לגרום לאובדן של באורך מלא בשלמות (390 KDA) חלבון BRCA2 עקבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקים את תא electrophoretic לפי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הדגימות ו -10 μl לסטנדרטים של חלבון משקל מולקולרי גבוה מראש צבעונית על ג&#39;ל precasted (טריס-אצטט 3-8%) ולהפעיל ב 120 V לabמתוך 2 שעות 12. לעצור את ריצת electrophoretic לפני הסמן הכחול kDa 55 משאיר את הג&#39;ל precasted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ ההעברה עם 50 מיליליטר של 20x חיץ העברה, של מתנול 100% 100 מיליליטר ו -850 מיליליטר מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל קרום PVDF (גודל נקבובית 0.45 מיקרומטר) על ידי השרייה במתנול 100% במשך 5 דקות, לשטוף עם מים מזוקקים ולאזן במאגר העברה לפחות במשך 5 דקות. משרים את ספוגים של מנגנון ההעברה בהעברת חיץ על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר electrophoretic הריצה נגמרה, להרכיב את הכריך בערימת ההעברה בהזמנה (מלמטה למעלה) הבאה: שלושה ספוגים רוויים במאגר העברה, גיליון נייר כיתה 3 מ&quot;מ אחד רווי במאגר העברה, ג&#39;ל, קרום PVDF הופעל, אחד 3 מ&quot;מ גיליון נייר כיתה רווי במאגר העברה, שלושה ספוגים רוויים במאגר העברת 13,14. הנח את המחסנית לתוך חלבוני המנגנון והעברה ב 350 מילי-אמפר לשעה 4 על 4 מעלות צלזיוס או 180 מילי-אמפר הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: להיות BRCA2 חלבון גדול מאוד, זה הוא חיוני כדי להאריך את זמן העברה מהשעה 1 (כפי שהוצע על ידי היצרן ורוב פרוטוקולי העברה) 4 שעות או לילה על מנת להבטיח העברה של חלבוני משקל מולקולריים גבוהים מלאה. בנוסף, בשל הזמן ארוך העברה, זה הכרחי כדי לבצע את סופג בחדר קר ב 4 ° C כדי למזער התחממות יתר ולהקל פירוק כריך. מערכות העברת חצי יבשות הן לא טובות להעברת חלבונים גדולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העברה, לשטוף את הממברנה עם כפות, לחסום אותו במשך שעה 1 ב RT ב0.25% TBS-Tween (TBS-T) המכילה חלב ללא שומן 5% יבשים ובדיקת הלילה ב 4 ° C עם נוגדן הארנב polyclonal 30 μl אנטי-BRCA2 ( 200 מיקרוגרם / מיליליטר), בדילול מלא 9 מיליליטר TBS-T + 5% שומן חלב יבש [1: 300 (V / V) דילול]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה שלוש פעמים (10 דקות כל אחד) עם כפות-T, אז דגירה המסנן עבור שעה 1 עם 1 μl של נוגדן נגד ארנב חזרת peroxidase מצומדות המשני מדולל ב 10 מיליליטר של TBS-T + 5% שומן חלב יבש. לאחר מכן, לשטוף את הממברנה שלוש פעמים (10 דקות כל אחד) עם כפות-T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע immunodetection ידי ECL לחשוף חלבון BRCA2 באמצעות chemiluminescence המשופרת (ECL) מערבית סופג איתור מגיב, הבאים להוראות היצרן. דמיינו להקות immunochemiluminescent בסרטים ברזולוציה גבוהה ECL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע immunodetection עם נוגדן לגן משק, כמו β-טובולין (55 KDA), באותו המסנן בקרת טעינה באמצעות נוגדנים חד שבטיים לβ-טובולין בדילול של 1: 1,000 (10 μl של נוגדן אנטי-טובולין ב 10 מיליליטר TBS-T + 5% חלב יבש ללא שומן) במשך שעה 1 ב RT. לשטוף דגירה נוגדנים משני כמתואר עבור BRCA2 (5.10-5.11), פרט לשימוש בחזרת אנטי עכבר peroxidase מצומדות במקום נוגדנים משני נגד ארנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונה דיגיטלית של הסרטים הרשימו עם להקות immunochemiluminescent ולנתח את עוצמת הלהקה על ידי תוכנת ניתוח תמונה ייעודית (לדוגמא., ImageJ). </li></ol>

<ol>
	<li>Thorslund, T., West, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA2:+a+universal+recombinase+regulator.">BRCA2: a universal recombinase regulator.</a> Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).</li><li>Yoshida, K., Miki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+BRCA1+and+BRCA2+as+regulators+of+DNA+repair,+transcription,+and+cell+cycle+in+response+to+DNA+damage.">Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage.</a> Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).</li><li>Martin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+mutations+in+BRCA1+and+BRCA2+in+breast-ovarian+families+from+a+breast+cancer+risk+evaluation+clinic.">Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic.</a> J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).</li><li>Castro, E., Eeles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+BRCA1+and+BRCA2+in+prostate+cancer.">The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer.</a> Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).</li><li>Vencken, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensitivity+and+outcome+of+BRCA1-+and+BRCA2-associated+ovarian+cancer+patients+after+first-line+chemotherapy+compared+with+sporadic+ovarian+cancer+patients.">Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients.</a> Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434, 917-921 (2005).</li><li>Arbini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+depletion+sensitizes+cancer+cells+to+PARP+inhibitors+by+translational+and+post-translational+repression+of+BRCA2.">Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2.</a> Oncogenesis. 2, e82 (2013).</li><li>Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AURKA+and+BRCA2+expression+highly+correlate+with+prognosis+of+endometrioid+ovarian+carcinoma.">AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma.</a> Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).</li><li>Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+BRCA2+decreases+anoikis+and+its+heterologous+expression+sensitizes+yeast+cells+to+acetic+acid-induced+programmed+cell+death.">Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death.</a> Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).</li><li>Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-based+gene+delivery+systems:+pharmaceutical+perspectives.">Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives.</a> Pharm Res. 14, 853-859 (1997).</li><li>Su, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+BRCA2:+temperature+sensitivity+of+detection+and+cell-cycle+regulated+expression.">Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression.</a> Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Burnette, W. N. '. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Western+blotting':+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).</li><li>Hunter, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+targeting+of+hypoxia+and+homologous+recombination+repair+dysfunction+in+triple-negative+breast+cancer.">Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer.</a> Mol Cancer Ther. , (2014).</li><li>Drew, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitor+AG014699+in+human+cancers+with+mutated+or+methylated+BRCA1+or+BRCA2.">Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2.</a> J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).</li><li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434, 913-917 (2005).</li><li>Ihnen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+the+poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitor+rucaparib+for+the+treatment+of+sporadic+human+ovarian+cancer.">Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer.</a> Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).</li><li>Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brca2+Deficiency+Leads+to+T+Cell+Loss+and+Immune+Dysfunction.">Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction.</a> Mol Cells. , (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בגלל מוטציות בתאי מין של עופרת גן BRCA2 לעלייה בסיכון למספר סוגי הסרטן, כוללים סרטן נשי וגברי השד, סרטן השחלות, סרטן הערמונית, סרטן לבלב, ולנומה 3,4, מספר מחקרים נעשו על מנת להבין את התפקיד הביולוגי של חלבון BRCA2. רוב המחקרים האלה הם בעיקר מבוסס גנטיים בשל קשיים טכ...

גן BRCA2 (רגישות לסרטן שד גן-2) מקודד לחלבון מדכא גידולים שממלא תפקיד מכריע בתיקון הפסקות פעמיים גדיל DNA על ידי המסדיר את התפקוד של אנזים recombinase 1 Rad51. BRCA2 גם היה מעורב באפנון של שעתוק ובבקרת מחזור תא 2. מוטציות בתאי מין בגן BRCA2 לגרום רגישות אוטוזומלית דומיננטית לסרטן שד ושחלות בנשים וסרטן הערמונית אצל גברים, כמו גם נטייה לסוגי סרטן אחרים 3,4. עם זאת, למרות העלייה בסיכון בהתפתחות סרטן, מוטציות BRCA2 המדכאות או להפחית פונקצית BRCA2 עלול להפוך תאים סרטניים פגיעים יותר לתרופות כימותרפיות הגורמות לניזק לדנ&quot;א 5-7. סרטן סדיר להציג שיעור נמוך של מוטציות BRCA2 (&lt;3%) למרות שרמות מופחתות של חלבון BRCA2 של אותרו בכמה סוגי הסרטן, טוען כי חלבון BRCA2עלול ללכת לאיבוד במהלך tumorigenesis בסרטן סדיר באמצעות מנגנונים שאינן מוטציה תלויה 7,8. לכן, חשוב להבין באופן מלא פונקציות BRCA2 בהקשר של ביולוגיה של הסרטן, כמו גם בהגדרות ביולוגיות אחרות. כלי רב עוצמה המשמש לזיהוי פונקציות רומן של גן בתאי יונקים הוא להשתיק את ביטויה. כדוגמא, ביטוי BRCA2 השתקה במגוון רחב של תאי האפיתל נורמלים הוביל לאחרונה לזיהוי של תפקוד רומן של BRCA2 כרגולטור של התנגדות anoikis, צעד חשוב ברכישה של תאים סרטניים יכולת פולשנית וגרורתי 9. השתקת גנים יכולה להיות מושגת על ידי החדרת בתאים או RNA הקטן מפריע (si) או מולקולות RNA סיכה קצרה (SH) מיקוד הגן הספציפי. העוצמה הגבוהה של siRNA וקלות שימוש להפוך אותו לכלי המועדף להשתקת ניסויים שמטרתם תובנה חדשות תהליכים ביולוגיים קריטייםND לזהות מטרות טיפוליות חדשניות. עם זאת, מציאה יעילה של ביטוי גנים לא יכולה להיות ברת השגה בקלות לכל הגנים ויכולה להיות מאוד משתנה בהתאם לסוג התא. בגלל ירידה ברמות חלבון תאיות הוא הפנוטיפ הרלוונטי ביותר בחקירה, חשוב לכמת השתקת גנים על ידי immunoblotting ניתוח של מוצר הגן. עם כל כבוד זה, חלבון BRCA2 מציב אתגר נוסף: להיות חלבון גדול (כ 390 KDA), קשיים טכניים קיימים לאנליזה ביוכימית קונבנציונלית, כוללים immunoblotting. אנו מדווחים כאן פרוטוקול מותאם להשתקה יעילה של BRCA2 בשורות תאי אפיתל אדם ולזיהוי מהיר ומוצלח חלבון BRCA2 מציאה ידי immunoblotting ניתוח.

<table><tbody><tr><td>BRCA2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003462-00</td><td>SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA</td></tr><tr><td>Ctrl siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>&amp;nbsp;D-001810-10-05</td><td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Reagent&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/13778075&quot;&gt;13778075&lt;/a&gt;</td><td>Transfection Reagent</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Medium for transfection procedure</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast</td><td>Life Technologies</td><td>EA0378</td><td>Gel for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample buffer&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>Reagent for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>NuPAGE Sample Reducing agent (10x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0004</td><td>Reagent for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>NuPAGE Antioxidant</td><td>Life Technologies</td><td>NP0005</td><td>Reagent for protein electrophoresis</td></tr><tr><td>HiMark Pre-stained protein standard</td><td>Life Technologies</td><td>LC5699</td><td>Prestained marker for gel electrophoresis</td></tr><tr><td>XCell SureLoc Mini-Cell&amp;nbsp; System</td><td>Life Technologies</td><td>EI0002</td><td>Equipment for protein electrophoresis/transfer</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LA0041</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0006-1</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8326</td><td>1:300 dilution</td></tr><tr><td>Beta-tubulin monoclonal antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4026-100UL</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>Skim Milk powder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70166</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>Reagent for Western blotting</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>34080/34096</td><td>Chemiluminescence system</td></tr><tr><td>PNT1A cells</td><td>SIGMA Aldrich (for ECACC)</td><td>95012614</td><td>PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40</td></tr><tr><td>Nthy cells</td><td>SIGMA Aldrich (for ECACC)</td><td>90011609</td><td>Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells</td></tr><tr><td>Cell Proliferation Kit I (MTT)</td><td>Roche</td><td>11465007001</td><td>Kit for cell proliferation assays</td></tr></tbody></table>

silencing of brca2 to identify novel brca2-regulated biological functions in cultured human cells

השתקה של BRCA2 החלבון המדכא הסרטן וגילויה על ידי ניתוח ביוכימי קונבנציונלי מהווה אתגר טכני גדול בגלל הגודל הגדול של חלבון BRCA2 האנושי (כ 390 KDA). אנו מדווחים שינויים של פרוטוקולי transfection וimmunoblotting siRNA סטנדרטיים להשתיק BRCA2 האנושי ולזהות חלבון אנדוגני BRCA2, בהתאמה, בשורות תאי אפיתל אנושיות. צעדים עיקריים כוללים siRNA גבוה יחס מגיב transfection ושני סיבובים הבאים של transfection siRNA בתוך אותו הניסוי. באמצעות שינויים אלה ואחרים לפרוטוקול הסטנדרטי באופן עקבי להשיג השתקה יותר מ -70% מגן BRCA2 האנושי כמו להישפט על ידי immunoblotting ניתוח עם נוגדנים נגד BRCA2. בנוסף, denaturation של lysates התא ב 55 מעלות צלזיוס במקום C הקונבנציונלי 70-100 מעלות ואופטימיזציות טכניות אחרות של הליך immunoblotting לאפשר זיהוי חלבון BRCA2 שלם של אפילו ש&quot;שen סכומים נמוכים מאוד של חומר מוצא זמינים או כאשר רמות ביטוי חלבון BRCA2 הן נמוכות מאוד. השתקה יעילה של BRCA2 בתאים אנושיים מציעה אסטרטגיה יקרה להפריע לפעילות של BRCA2 בתאים עם BRCA2 שלם, כוללים תאים סרטניים, לבחון מסלולים מולקולריים חדשים ותפקודים תאיים שעלולים להיות מושפע על ידי מוטציות BRCA2 פתוגניים בגידולים. העיבוד של פרוטוקול זה להשתקה וניתוח של חלבונים אחרים &#39;גדולים&#39; כמו BRCA2 יעילים צריך להיות בר השגה בקלות.

לפני שתמשיך עם assay ביולוגי / ביוכימי לבחון את ההשפעה של השתקת BRCA2 על פונקציות תא, הצעד הראשון הוא לאשר את הספציפיות של ההשתקה באמצעות siRNA מקושקשת (ללא מיקוד siRNA) זה לצד זה עם BRCA2 siRNA (איור 1 א ). חשוב לבצע סיבוב של transfection siRNA שני עם יחס גבוה siRNA / transfection כדי לקבל י?...

Watch this Scientific Journal Video about Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells at JoVE.com

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

השתקת<em&gt; BRCA2</em&gt; לזיהוי פונקציות ביולוגיות-מוסדר BRCA2 רומן בתאי אדם בתרבית

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

silencing-brca2-to-identify-novel-brca2-regulated-biological

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

9.0K Views.  National Research Council. Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented. 

Video: Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Cancer Research

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

הערכה פונקציונלית של גרסאות BRCA1 באמצעות עורכי בסיס בתיווך CRISPR

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

בידוד והערכה תפקודית של תאי גזע מסרטן השד האנושי מדגימות תאים ורקמות

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Medicine

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

הערכת היעילות של תרופות למלחמה בסרטן רגישות<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the BRCA1 have been complicated by the lack of a robust assay for the full length BRCA1 protein and the difficulties inherent in working with cell lines that express hypomorphic BRCA1 protein1,2,3,4,5. We developed a system whereby the endogenous BRCA1 protein in a cell was acutely depleted by RNAi targeting the 3'-UTR of the BRCA1 mRNA and replaced by co-transfecting a plasmid expressing a BRCA1 variant. One advantage of this procedure is that the acute silencing of BRCA1 and simultaneous replacement allow the cells to grow without secondary mutations or adaptations that might arise over time to compensate for the loss of BRCA1 function. This depletion and add-back procedure was done in a HeLa-derived cell line that was readily assayed for homologous recombination activity. The homologous recombination assay is based on a previously published method whereby a recombination substrate is integrated into the genome (Figure 1)6,7,8,9. This recombination substrate has the rare-cutting I-SceI restriction enzyme site inside an inactive GFP allele, and downstream is a second inactive GFP allele. Transfection of the plasmid that expresses I-SceI results in a double-stranded break, which may be repaired by homologous recombination, and if homologous recombination does repair the break it creates an active GFP allele that is readily scored by flow cytometry for GFP protein expression. Depletion of endogenous BRCA1 resulted in an 8-10-fold reduction in homologous recombination activity, and add-back of wild-type plasmid fully restored homologous recombination function. When specific point mutants of full length BRCA1 were expressed from co-transfected plasmids, the effect of the specific missense mutant could be scored. As an example, the expression of the BRCA1(M18T) protein, a variant of unknown clinical significance10, was expressed in these cells, it failed to restore BRCA1-dependent homologous recombination. By contrast, expression of another variant, also of unknown significance, BRCA1(I21V) fully restored BRCA1-dependent homologous recombination function. This strategy of testing the function of BRCA1 missense mutations has been applied to another biological system assaying for centrosome function (Kais et al, unpublished observations). Overall, this approach is suitable for the analysis of missense mutants in any gene that must be analyzed recessively.

We provide a method for testing BRCA1 variants in a tissue culture based assay for homologous recombination repair of DNA damage by depleting endogenous BRCA1 protein from a cell using RNAi and replacing it with a BRCA1 point mutant that contains a coding change.

זיהוי השפעות של מוטציות BRCA1 על רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים אקספרס BRCA1 אנדוגני wild-type

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

במבחנה בחירת מדכאי שעתוק מהונדסים להשתקה אפיגנטית ממוקדת

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Bioengineering

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

gDNA העשרה על ידי טכנולוגיה מבוססת Transposase לניתוח NGS של הרצף השלם של<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, ו -9 גנים המעורבים בתיקון נזק לדנ&quot;א

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

השתקת

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video