The authors thank Drs. Hukriede and Tsang for discussions. M.K. was supported by an NIH training grant (T32EB001026). This work was supported in part by grants from the American Liver Foundation, the March of Dimes Foundation (5-FY12-39), and the NIH (DK101426) to D.S.

דג הזברה הועלתה וגדלה בהתאם לנוהל מקובל; ניסויים אושרו על ידי אוניברסיטת פיטסבורג מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה. 1. הכנת עוברים / זחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל הזדווגויות מתוזמן, זכר להגדיר מבוגר והנקבה Tg (fabp10a: CFP-NTR) O דגי hemizygous או הומוזיגוטים s931 / N ולמקם את מחיצה ביניהם. הסר מחיצה זו למחרת בבוקר כאשר ההזדווגות היא רצויה. איסוף עובר על ידי סינון המים באמצעות מסננת רשת פלסטיק דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המסננת הפוכה ולשטוף את משטח הרשת עם זרם עדין של מים ביצה לוותר מבקבוק לחיץ. העבר את 100 עוברים לצלחת פטרי 100 מ&quot;מ עם 25 מיליליטר של מים ביצה. לשמור על לא יותר מ -100 עובר לכל צלחת פטרי ולגדל אותם בגיל 28 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכב פיגמנטציה, להוסיף phenylthiourea (PTU) לתוך צלחות פטרי לפני 10 שעות לאחר ההפריה (hpf), ולהעלות את הדוארmbryos / זחלים עד 80 hpf. הריכוז הסופי של PTU הוא 0.2 מ&quot;מ. זהירות: PTU הוא רעיל. השתמש בבהתאם להנחיות טיפול מתאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הזחלים על ידי הוספת 3-אמינו אסתר benzoic אתיל החומצה (Tricaine), בריכוז סופי של 0.016%, לצלחות פטרי. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence, זחלי סוג CFP-חיוביים. השתמש זחלים עם גודל דומה כבד וזורקים אותם עם כבד קטן יותר או גדול יותר. הערה: כל זחלים CFP-חיובי, ללא קשר לעוצמת, ניתן להשתמש כי אין הבדל בין זחלי hemizygous והומוזיגוטים היקף אבלציה hepatocyte. זהירות: tricaine היא רעילה. השתמש בבהתאם להנחיות טיפול מתאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המים ביצה המכילים Tricaine ולהוסיף מים ביצה בתוספת 0.2 מ&quot;מ PTU. שמור את העוברים / הזחלים ב 28 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. Mtz טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 10 מ&quot;מ Mtz טרי על ידי המסת .171 גרם של אבקת Mtz ב 1בתוספת מים ביצה 00 מיליליטר עם 0.2% מ&quot;מ PTU DMSO ו0.2. לפזר לגמרי Mtz, לערבב את הפתרון על RT עם ערבוב מהיר במשך 20-30 דקות. כדי לעזור solubilize Mtz וכדי לשפר את חלחול Mtz לזחלים, להוסיף DMSO בעת הכנת Mtz. זהירות: חשיפה ממושכת או ריכוז מוגבר של Mtz הוא רעילה. השתמש בבהתאם להנחיות טיפול מתאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הזחלים לקבוצות שליטה והניסיון בהעברת מספר רצוי של זחלים לשני 100 שונים צלחת פטרי מ&quot;מ או צלחת רב גם. לקבוצת הניסוי, לשמור על הזחלים ב 10 מ&quot;מ פתרון Mtz; לקבוצת הביקורת, לשמור אותם במי ביצה המכילים 0.2% DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הצלחות או צלחות פטרי המכילות את פתרון Mtz בנייר אלומיניום כדי למנוע את צילום איון של Mtz, ולדגור על 28 מעלות צלזיוס. משך טיפול Mtz תלוי בשלב הזחל והקו המהונדס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתבונן אבלציה hepatocyte החמורה דומה ב <eמ &#39;&gt; Tg (fabp10a: CFP-NTR) קו, טיפול בזחלים עם פתרון Mtz משני 3.5 ימים לאחר ההפריה (DPF) (למשך 36 שעות) או מ -5 DPF (לתקופה של 24 שעות). </li></ol> 3. ניתוח של התחדשות כבד מונעת-מרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף תקופת אבלציה, להסיר את פתרון Mtz מהצלחות. שטוף את הזחלים שטופלו Mtz על ידי הוספת 25 מיליליטר של מים ביצה. מערבולת הצלחת 2-3 פעמים כדי לשטוף את הזחלים לפני השלכת המים הביצה. חזור שלוש פעמים ולאחר מכן לטבול את הזחלים פעם נוספת במי ביצה. כדי להימנע מבצקת לב ומות זחל בזחלים שטופלו Mtz, להוסיף ריכוז נמוך יותר של Tricaine, בריכוז סופי של 0.008%, כדי לשתק את הזחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח בכבד, לבחון את הגודל הכבד של הזחלים שטופלו Mtz תחת מיקרוסקופ epifluorescence עם מסנן CFP. להעריך רמות אבלציה hepatocyte בהתבסס על הגודל הכבד יחסית: גדולים (לא מלוטשים; זחלי% 0-10), בינוני (ablated באופן חלקי; 10-20%), וקטנים מאוד (ablated באופן מלא; 80-90%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הזחלים עם כבדים שאינם ablated או ablated באופן חלקי. לשמור רק זחלים עם כבד זעיר, אשר מעיד על אבלציה hepatocyte החמורה. לניתוח בכבד בזמן שעות הנקודה (R0h) התחדשות 0, לקצור את הזחלים לאחר כישלון Mtz ומיון CFP. אחרת, לשמור על הזחלים מסודרים במי ביצה בתוספת 0.2 מ&quot;מ PTU עד מוכן לקציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הזחלים שנקטפו לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ולהחליף מים ביצה עם פתרון הקיבעון של פורמלדהיד 3% במאגר PEM. דגירה הצינור על C ° O מסובבי / N ב 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את פתרון הקיבעון עם 1 מיליליטר של PBSDT ולסובב את הצינור המכיל את הזחלים על הכתף במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הזחלים הקבועים לצלחת פטרי 100 מ&quot;מ המכילים PBSDT ובאמצעות מלקחיים, להסיר באופן ידני סנפירי חלמון וחזה תחת מיקרוסקופ לנתח. העבר את TP 20 זחלים גזור לתוך צינור 1.5 מיליליטר. </li> &lt;li&gt; החלף פתרון PBSDT עם 1 מיליליטר של תמיסת חסימה ולטלטל את הצינור על הכתף ב RT עבור שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף פתרון חסימה עם החסימה של תמיסה המכילה נוגדנים ראשוניים 100 μl. לאט רוק הצינור על C ° O מסובבי / N ב 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון הנוגדן הראשוני ולשטוף עם PBSDT 5 פעמים במשך 10 דקות בכל פעם. לאחר מכן להוסיף חסימת תמיסה המכילה נוגדנים משני ורוקו על הכתף ב RT עבור 2hr 100 ul. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 5 פעמים עם PBSDT במשך 10 דקות בכל פעם ב RT על ידי נדנדה על הכתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכוון את הזחלים רוחבי בשקופית מיקרוסקופ ולהוסיף טיפה של תקשורת הרכבה. לכסות בזהירות אותם עם מכסה זכוכית ולאטום את מכסה הזכוכית עם לטש מסמר. עכשיו, שהוא מוכן למיקרוסקופיה confocal. </li></ol>

<ol>
	<li>Riehle, K. J., Dan, Y. Y., Campbell, J. S., Fausto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+concepts+in+liver+regeneration.">New concepts in liver regeneration.</a> J Gastroen Hepatol. 26, 203-212 (2011).</li><li>Fausto, N., Campbell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+hepatocytes+and+oval+cells+in+liver+regeneration+and+repopulation.">The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation.</a> Mechanisms of Development. 120, 117-130 (2003).</li><li>Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+and+Liver+Regeneration.">Stem Cells and Liver Regeneration.</a> Gastroenterology. 137, 466-481 (2009).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+Alternative+epithelial+pathways.">Liver regeneration: Alternative epithelial pathways.</a> Int J Biochem Cell B. 43, 173-179 (2011).</li><li>Falkowski, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+hepatocyte+'buds'+in+cirrhosis+from+intrabiliary+stem+cells.">Regeneration of hepatocyte 'buds' in cirrhosis from intrabiliary stem cells.</a> Journal of hepatology. 39, 357-364 (2003).</li><li>Yoon, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Cell+Adhesion+Molecule+(EpCAM)+Marks+Hepatocytes+Newly+Derived+from+Stem/Progenitor+Cells+in+Humans.">Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) Marks Hepatocytes Newly Derived from Stem/Progenitor Cells in Humans.</a> Hepatology. 53, 964-973 (2011).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> J Cell Physiol. 213, 286-300 (2007).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+Regeneration+after+Partial+Hepatectomy+Critical+Analysis+of+Mechanistic+Dilemmas.">Liver Regeneration after Partial Hepatectomy Critical Analysis of Mechanistic Dilemmas.</a> Am J Pathol. 176, 2-13 (2010).</li><li>Yanger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+hepatocytes+are+generated+by+self-duplication+rather+than+stem+cell+differentiation.">Adult hepatocytes are generated by self-duplication rather than stem cell differentiation.</a> Cell stem cell. 15, 340-349 (2014).</li><li>Schaub, J. R., Malato, Y., Gormond, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+against+a+Stem+Cell+Origin+of+New+Hepatocytes+in+a+Common+Mouse+Model+of+Chronic+Liver+Injury.">Evidence against a Stem Cell Origin of New Hepatocytes in a Common Mouse Model of Chronic Liver Injury.</a> Cell reports. 8, 933-939 (2014).</li><li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+alpha+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish.">Topoisomerase II alpha is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and cellular biology. 29, 3746-3753 (2009).</li><li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development.">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li><li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator,+uhrf1.">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator, uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li><li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-nitrosothiol+signaling+regulates+liver+development+and+improves+outcome+following+toxic+liver+injury.">S-nitrosothiol signaling regulates liver development and improves outcome following toxic liver injury.</a> Cell reports. 6, 56-69 (2014).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGE2-regulated+wnt+signaling+and+N-acetylcysteine+are+synergistically+hepatoprotective+in+zebrafish+acetaminophen+injury.">PGE2-regulated wnt signaling and N-acetylcysteine are synergistically hepatoprotective in zebrafish acetaminophen injury.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17315-17320 (2010).</li><li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish:+A+new+tool+for+regeneration+studies.">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies.</a> Developmental Dynamics. 236, 1025-1035 (2007).</li><li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase.">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li><li>Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+conversion+of+hepatic+biliary+epithelial+cells+to+hepatocytes+after+near+total+loss+of+hepatocytes+in+zebrafish.">Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146, 776-788 (2014).</li><li>Huang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+interaction+between+Wnt+and+Notch+activity+modulates+the+regenerative+capacity+of+a+zebrafish+fibrotic+liver+model.">Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model.</a> Hepatology. , (2014).</li><li>He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+liver+after+extreme+hepatocyte+loss+occurs+mainly+via+biliary+transdifferentiation+in+zebrafish.">Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146, 789-800 (2014).</li><li>Sakaguchi, T. F., Sadler, K. C., Crosnier, C., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+signals+modulate+hepatocyte+apicobasal+polarization+in+zebrafish.">Endothelial signals modulate hepatocyte apicobasal polarization in zebrafish.</a> Curr Biol. 18, 1565-1571 (2008).</li><li>Ninov, N., Borius, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+Notch+signaling+regulate+quiescence,+renewal+and+differentiation+in+pancreatic+endocrine+progenitors.">Different levels of Notch signaling regulate quiescence, renewal and differentiation in pancreatic endocrine progenitors.</a> Development. 139, 1557-1567 (2012).</li><li>Lorent, K., Moore, J. C., Siekmann, A. F., Lawson, N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+notch+signal+during+zebrafish+intrahepatic+biliary+development.">Reiterative use of the notch signal during zebrafish intrahepatic biliary development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 239, 855-864 (2010).</li><li>Itoh, T., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+Regeneration+by+Stem/Progenitor+Cells.">Liver Regeneration by Stem/Progenitor Cells.</a> Hepatology. 59, 1617-1626 (2014).</li><li>Mathias, J. R., Zhang, Z., Saxena, M. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+cell-specific+ablation+in+zebrafish+using+a+triple+mutant+of+Escherichia+coli+nitroreductase.">Enhanced cell-specific ablation in zebrafish using a triple mutant of Escherichia coli nitroreductase.</a> Zebrafish. 11, 85-97 (2014).</li><li>Stueck, A. E., Wanless, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+cirrhosis:+The+maturation+sequence+of+buds+arising+from+hepatocyte+progenitor+cells.">Regression of cirrhosis: The maturation sequence of buds arising from hepatocyte progenitor cells.</a> Hepatology. 58, 235A (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

חמור, אבל לא קל, אבלציה hepatocyte מעוררת התחדשות כבד מונע מרה. לכן, לאחר טיפול Mtz וכישלון, חשוב לבחון את הגודל הכבד של הזחלים שטופלו Mtz, אשר ניתן להעריך על ידי הקרינה CFP מהותית מfabp10a: transgene CFP-NTR. מאז אחוז קטן של הזחלים שטופלו Mtz יציג הלא ablated (0-5%) או באופן חלקי ablated כבדים ...

הכבד הוא איבר משובי מאוד. במהלך התחדשות כבד, התחדשות hepatocytes, תאי parenchymal של הכבד, נגזרים מhepatocytes קיים מראש (התחדשות כבד מונע hepatocyte) או BECs (התחדשות כבד מונע מרה) 1,2. פגיעה בכבד בדרך כלל מעוררת את ההתפשטות של hepatocytes קיים מראש; עם זאת, כאשר התפשטות hepatocyte נפגעת, BECs יכולה לתרום לhepatocytes 2-4. שני מצבים אלה של התחדשות כבד הם משמעותיים מבחינה קלינית. לאחר ההסרה כירורגית של חלק מהכבד האנושי (למשל, בגלל גידולים בכבדים או תורמים כבד חיים), hepatocytes בכבד שנותר להתרבות כדי לשחזר את מסת כבד לאיבוד. לעומת זאת, בחולים עם מחלות כבד חמורות, התפשטות hepatocyte נפגעת מאוד, כך שBECs או תאי כבד (LPCs) מופיעות לתרום לhepatocytes התחדשות 5,6. מודל כריתה החלקי המכרסמים 2/3, שבhepatocytes להתרבות כדי לשחזר את המסה הכבד איבדה, תרם באופן משמעותי להבנה הנוכחית של התחדשות כבד מונע hepatocyte 7,8. עם זאת, אין מודל מכרסם בתוקף שבhepatocytes התחדשות נגזרים בעיקר מBECs. למרות שכמה דגמי רעלן כבד מכרסמים הובילו לזיהוי של התחדשות כבד מונע מרה 2-4, מחקרי שושלת ההתחקות אחרונים בעכברים מצביעים תרומה מינימאלית של BECs להתחדשות hepatocytes במודלים אלה 9,10. חלק מדגמי הפגיעה בכבד מכרסמים, כולל כריתה חלקית 11-13 ונזק כבד נגרם פרצטמול 14,15, יושמו לדג זברה והוביל לזיהוי של גנים חדשים או מסלולים מעורבים בהתחדשות כבד. עם זאת, המונע על ידי hepatocyte, אבל לא מונע-BEC, התחדשות כבד מתרחשת בדגמי פגיעה בכבד דג הזברה אלה. לכן, מודל פגיעה בכבד רומן שבי BECs הרחבה לתרום לregenerating hepatocytes נחוץ להבנה טובה יותר של התחדשות כבד מונעת-BEC. מטרות העל של מודל אבלציה hepatocyte מתואר כאן (1) כדי ליצור מודל פגיעה בכבד שבי BECs נרחבת תורם להתחדשות תאים כבדות, ו- (2) להבהיר את המנגנונים המולקולריים ותאיים שבבסיס התחדשות כבד מונעת-BEC. חוקרים שערנו כי חומרת פגיעה קובעת את המצב של התחדשות כבד; כך, אנו חוזים כי התחדשות כבד מונע מרה תיזום על פציעת hepatocyte חמורה. כדי לבדוק השערה זו, פיתחנו מודל פגיעה בכבד דג הזברה על ידי יצירת קו מהונדס, Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931, שמאוד מבטא Nitroreductase חיידקים (NTR) התמזגה עם חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP) תחת fabp10a hepatocyte הספציפי אמרגן. מאז NTR ממיר את prodrug אינה רעילה, metronidazole (Mtz), לתרופה רעילה לתאים, זה ablates רק נועד NTR-לבטא בתאים 16-18, במקרה זה, hepatocytes. על ידי מניפולציה של משך טיפול Mtz, היקף אבלציה hepatocyte יכול להיות נשלט. שימוש במודל זה, שדיווחנו לאחרונה כי על אובדן hepatocyte חמור, BECs הרחבה להצמיח hepatocytes התחדשות 19, אשר אושר עוד יותר על ידי שני מחקרים עצמאיים אחרים 20,21. לכן, בהשוואה למכרסמים האמורים ודגמי פגיעה בכבד דג הזברה, מודל אבלציה hepatocyte שלנו הוא יתרון נוסף ללימוד התחדשות כבד מונעת-BEC. פרוטוקול זה מתאר את ההליך לביצוע ניסויי התחדשות כבד באמצעות מודל אבלציה hepatocyte דג הזברה. מודל זה יהיה מתאים לקביעת מנגנוני התחדשות כבד מונע מרה ולמסכים כימיים לזהות מולקולות קטנות שיכול להדחיק או להגדיל את ההתחדשות כבד.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td>Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium sulfate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media (Vectashield)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x 15 mm petri dish&#160;</td>
			<td>Denville Scientific Inc.</td>
			<td>M5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear nail polish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50949071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>Dumont #5&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540-A and 12-542-A</td>
			<td>18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zn-5 (mouse anti-Alcam)</td>
			<td>ZIRC</td>
			<td>zn-5</td>
			<td>1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-Hnf4a</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-6556 (C-19)</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-RFP</td>
			<td>Allele Biotechnology</td>
			<td>ACT-CM-MRRFP10</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson laboratories</td>
			<td>705-605-147</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21240</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 donkey anti-rat IgG</td>
			<td>Jackson laboratories</td>
			<td>712-165-150</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>S6F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>M205FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>egg water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3 g/L of sea salts &#8216;Instant Ocean&#8217; and 0.5 mM CaSO4 in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25.6 g Na2HPO4&#183;7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4.&#160; Bring to 1 L with distilled water.&#160; Adjust pH 7.&#160; Autoclave for 20 min at 121&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBSDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4.&#160; Bring to 1 L with distilled water.&#160; Adjust pH 7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hepatocyte-specific ablation in zebrafish to study biliary-driven liver regeneration

יש כבד קיבולת גדולה להתחדש. Hepatocytes, תאי parenchymal של הכבד, יכול להתחדש באחת משתי דרכים: התחדשות כבד hepatocyte- או מונע מרה. בהתחדשות כבד מונע hepatocyte, hepatocytes התחדשות נגזרים מhepatocytes preexisting, ואילו, בהתחדשות מונעת מרה, hepatocytes התחדשות נגזרים מתאי אפיתל מרה (BECs). להתחדשות כבד מונע hepatocyte, יש מודלים של מכרסמים מצוינים שתרמו באופן משמעותי להבנה הנוכחית של התחדשות כבד. עם זאת, אין מודל מכרסם כזה קיים להתחדשות כבד מונע מרה. אנחנו דיווחו לאחרונה על מודל פגיעה בכבד דג הזברה שבBECs הרחבה להצמיח hepatocytes על אובדן hepatocyte חמור. במודל זה, hepatocytes הם ablated במיוחד על ידי אמצעי pharmacogenetic. כאן אנו מציגים בפירוט את השיטות ללקטוע hepatocytes ולנתח את תהליך ההתחדשות הכבד מונע-BEC.מודל אבלציה hepatocyte ספציפי זה יכול לשמש נוסף כדי לגלות את המנגנונים מולקולריים ותאיים הבסיסיים של התחדשות כבד מונע מרה. יתר על כן, יכול להיות מיושמות בשיטות אלה למסכים כימיים לזהות מולקולות קטנות שלהגדיל או לדכא התחדשות כבד.

טיפול Mtz במשך 36 שעות (A36h, עומד לאבלציה) מגודל כבד 3.5 עד 5 DPF מופחת באופן דרמטי (איור 1). לאחר כישלון Mtz, נחשב כתחילת התחדשות כבד (R), fabp10a החזק: CFP-NTR וfabp10a: ביטוי dsRed הופיע בתוך 30 שעות (איור 1). רשת המרה intrahepatic, כפי שהוערך על ידי ביטוי של Alcam שנמצא בקרום ש?...

Watch this Scientific Journal Video about Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration at JoVE.com

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

אבלציה Hepatocyte הספציפי בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

hepatocyte-specific-ablation-zebrafish-to-study-biliary-driven-liver

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Regeneration and Repair

SCIENTISTS IN ACTION

8.5K Views.  University of Pittsburgh. To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Video: Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

אבלציה כירורגית Assay עבור לימוד Regeneration Eye ב Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

גישה אבולרית מדויק עבור דוגמנות פגיעה בכליות חריפה בפיתוח דג הזברה

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related morbidity and mortality and affects more than 2 million people in the United States. A better understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying alcohol-induced liver injury is crucial for developing effective treatment for ALD. Zebrafish larvae exhibit hepatic steatosis and fibrogenesis after just 24 h of exposure to 2% ethanol, making them useful for the study of acute alcoholic liver injury. This work describes the procedure for acute ethanol treatment in zebrafish larvae and shows that it causes steatosis and swelling of the hepatic blood vessels. A detailed protocol for Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) staining that is optimized for the histological analysis of the zebrafish larval liver, is also described. H&#38;E staining has several unique advantages over immunofluorescence, as it marks all liver cells and extracellular components simultaneously and can readily detect hepatic injury, such as steatosis and fibrosis. Given the increasing usage of zebrafish in modeling toxin and virus-induced liver injury, as well as inherited liver diseases, this protocol serves as a reference for the histological analyses performed in all these studies.

This protocol describes histological analyses of the livers from zebrafish larvae that have been treated with 2% ethanol for 24 h. Such acute ethanol treatment results in hepatic steatosis and swelling of the hepatic vasculature.

ניתוח היסטולוגית של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול דג הזברה

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult liver regeneration after 70% partial hepatectomy results in hepatocyte hypertrophy with some replication in remaining lobes with restoration of metabolic activity, but with permanent loss of the injured lobe&#39;s morphology and architecture. Here, we detail a new surgical method in the neonate that leaves a physiologic environment conducive to regeneration. This model involves amputation of the left lobe apex and a subsequent conservative management regimen, and lacks the necessity for ligation of major liver vessels or chemical injury, leaving a physiologic environment where regeneration may occur. We extend this protocol to amputations on juvenile (P7-14) mice, during which the injured liver transitions from organ regeneration to compensatory growth by hypertrophy. The presented, brief 30 min protocol provides a framework to study the mechanisms of regeneration, its age-associated decline in mammals, and the characterization of putative hepatic stem or progenitors.

Here, we present a new method for partial resection of the left hepatic lobe in neonatal (day 0) mice. This new protocol is suitable for studying acute liver injury and injury response in the neonatal setting.

Hepatectomy Lobular חלקית: מודל ניתוח עבור התחדשות הכבד מורפולוגיות

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

שיטות המחקר של התחדשות ב- Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

בדיקת גודל הכבד בזחל זברה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...