This work was funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (Exc257, SFB958).

הערה: כל נהלי בעלי החיים טופלו בCharité או אוניברסיטת מרפאת Jena בקנה אחד עם חוקים הגרמנים טיפול בבעלי חיים הימנעות מכל סבל מיותר של בעלי חיים. 1. פתרונות הכנה וDissection מקום עבודה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות הערה: הכן את הפתרונות הבאים לפני תחילת נתיחה של האפיתל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות להליך לנתיחה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון של רינגר (pH 7.4) עם ריכוזים של 140 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 10 מ&quot;מ HEPES, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 1 מ&quot;מ MgCl 2, ו -10 מ&quot;מ גלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PBS - / - פתרון (pH 7.4) עם ריכוזים של 2.68 מ&quot;מ KCl, 1.47 מ&quot;מ KH 2 PO 4, 136 מ&quot;מ NaCl, ו -8.1 מ&quot;מ Na 2 HPO 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מקבע (pH 7.2) עם ריכוזים של 1x PBS - / -, 0.2 מ&quot;מ CaCl 2, סוכרוז 4%, וparaformaldehyde 4%. סוכרוז בפתרון מקבע משפר cryoחתך ואיסוף של cryosections. חנות ב -20 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות להליך מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PBS + / + פתרון עם ריכוזים של 1x PBS - / -, 0.48 מ&quot;מ MgCl 2, 0.9 מ&quot;מ CaCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PBST + / + פתרון עם ריכוזים של 1x PBS + / + ו -0.1% Triton X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון חסימה עם ריכוזים של 1x PBST + / + ו -1% לטין. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום עבודה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקום העבודה לנתיחה, להשתמש מיקרוסקופ לנתח עם תאורה בהירה, כמו גם עט נוזלי בחסמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת פטרי, מלא בפתרון של רינגר, ושקופיות זכוכית דבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את מכשירי הניתוח הבאים: זוג מספריים כירורגית עם קצה קהה אחד חד ואחד, זוג מספריים אביב עם צורת קצה ישר, שני מלקחיים עם צורה עדינה מעוקלת קצה וסכין גילוח ( <strong&gt; איור 1 א). </li></ol></li></ol> 2. הכנת מחיצת האף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים בכלובים שאושרו בית עם גישה סדירה למזון ומים ומחזור היום / לילה מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הרדמה בגזת קיבול המכיל סגורה ספוגה עם isoflurane 100% ושיכוך כאבים צג על ידי בדיקת רפלקסים רגל אחורית. מאז נקע בצוואר הרחם יכול לגרום לדם בחללי האף, ישירות לערוף עכברים מורדמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העור כדי לחשוף את העצם של כל הגולגולת והאף, ולנגב את הדם ורקמות שנותר באמצעות מגבת נייר ביסודיות. הסר את הלסת ושיניים הקדמיות התחתונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את עצם הגב של האף דו-צדדי במקביל מרחק 1-2 מ&quot;מ לקו התפר כדי להפריד צד אחד של מחיצת האף (מדיאלית) מmaxilla (רוחבי). לפצל את האף עם חתך אחד. אם שרידי עצמות וturbinates עדיין מחוברים למחיצה, להסיר אלה בזהירות כדי לחשוף את המחיצה לחלוטיןמבלי לגעת בו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את עצם האף הגבי על ידי הזזה הקצה מעוגל הקנס של מלקחיים בצד הגב של מחיצת האף, בין המחיצה ועצם האף. להפעיל לחץ קל על העצם, לדחוף אותו ולהסיר אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לספק גישה לשתי רקמות במחיצה, אחד מכל חלל, להסיר בזהירות את maxilla של הצד של הראש האחר. בעת הכנת בעלי חיים מבוגרים (P&gt; 28), להסיר את קצה העצם הקדמי מכסה את נורות חוש הריח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את אפיתל ההרחה על ידי הצבע הצהוב מעט (איור 1). אפיתל הנשימה הגובל הוא לבן ומראה תנועה של cilia ניעתי שניתן לראות תחת מיקרוסקופ לנתח. לחתוך לאורך הגבול בין אפיתל הרחה ונשימה עם זוג מספריים אביב נאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאריך את החתך ולהפריד את המחיצה מחיבור הגחון עד עצם vomer. ואז לחתוך לאורך הגבול בין המחיצה וcribrosa lamina של ethmoidal Osדואר. המחיצה כעת מבודדת לחלוטין מכל החיבורים לראש. השתמש בעמדות החיתוך שמוצגים באיור 1 ג. </li></ol> 3. בידוד של האפיתל חוש הריח לImmunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות זכוכית דבק בצלחת פטרי מלאים בפתרון של רינגר. מניחים אותו על הקצה של צלחת פטרי, כך שמחצית מהזכוכית טמונה בפתרון (איור 1 א) רינגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים כדי להעביר בזהירות את עצם הכברה עם אפיתל ההרחה לצלחת פטרי. הרם אותו ללא תופס אותו עם הטיפים מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את הצלחת בניצב של העצם הכברה עם מלקחיים ולהשתמש שני אחת כדי להסיר בזהירות את האפיתל מצד אחד של מחיצת האף. חלק את הקצה המעוגל בין הצלחת ואפיתל בניצב לקלף את האפיתל מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להיות תמיד בטוח כדי לזהות את צד הריסים, במקרה אפיתל סלטות בsoluti רינגרעל. אם אפיתל סלטות, זה כמעט בלתי אפשרי לזהות את צד הריסים לאחר מכן. בעיקר, האפיתל מתגלגל עם משטח הריסים בפנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את צורת הרקמה נרשמה עם עמדות החיתוך שמוצגים באיור 1 ג. תפוס את האפיתל בעמדה בגבול ולמשוך אותו לשקופית הזכוכית. אל תיגע בצד הריסים עם המלקחיים כדי למנוע נגעים של הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מחץ ולחזור על התהליך עם אפיתל מהצד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את שקופיות הזכוכית סביב שני החתיכות של אפיתל ריח עם מגבת נייר ולהקיף את הרקמה עם עט נוזלי בחסמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן את הרקמה עם 150 פתרון מקבע μl 10 דקות ב RT. בנוגע ליציבות cilia ויושרה, להשתמש פעמים קיבעון קצרות עבור מגוון רחב של נוגדנים נבדקו. בתוך cilia 10 דקות אלה קבועים, אבל כנראה לא כל רקמת האפיתל. לפיכך, מיידי לדמיין עם מיקרוסקופ לאחר staining הליך. עם זאת, פעמים מקבע עשויות להשתנות לנוגדנים בודדים. </li></ol> 4. מכתים פרוטוקול הערה: ידית הרקמה מאוד בזהירות כדי לשמור על מבני הריסים של עצב סנסורי חוש הריח. הסר פתרונות על ידי pipetting. אל תפיל את כל פתרונות ישירות על גבי האפיתל, ככוחות מכאניים יכולים לשבש את הריסים העדינים. לבצע את כל השלבים בRT אם לא צוין אחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון מקבע ולשטוף 2 פעמים עם PBS + / +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה אפיתל במשך שעה לפחות 1 עם חסימת פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון נוגדן ראשוני על ידי המסת הנוגדן בחסימת פתרון (1: 200 לנוגדנים המשמשים במחקר זה) וצנטריפוגות במשך 5 דקות במהירות מלאה כדי להסיר כל משקעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה אפיתל עם פתרון נוגדנים בתא לח על 4 מעלות CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפיתל לשטוף עם PBS + / + 5 דקות לפחות 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">הכן פתרון נוגדנים משני על ידי המסת הנוגדן בחסימת פתרון (1: 500) וצנטריפוגות במשך 5 דקות במהירות מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה אפיתל עם פתרון נוגדנים משני עבור שעה 1 בתא חשוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפיתל לשטוף עם PBS + / + 5 דקות לפחות 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוזל בחסמי בסכין גילוח או מגבת נייר. שטוף את האפיתל במים מזוקקים למשך 5 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמר את הרקמה בantifade מגיב הרכבה. הערה: עליות הקרינה רקע במהירות בתוך ימים; ניתוח Microscopical לא יאוחר מ 2 ימים לאחר ההטבעה בהרכבה בינונית לכן, מומלץ. טיפול מיוחד צריך להילקח לא לסחוט את הרקמה בעת חיפוש מישור המוקד הנכון, שכן הוא עלול לגרום נזק חמור להכנה. בשל הקרינה מחוץ לפוקוס, חקירה נוספת עם מיקרוסקופיה confocal מומלצת. </li></ol>

<ol>
	<li>Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+olfactory+system+makes+sense+of+scents.">How the olfactory system makes sense of scents.</a> Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).</li><li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors:+a+molecular+basis+for+odor+recognition.">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li><li>Wong, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+type+III+adenylyl+cyclase+gene+leads+to+peripheral+and+behavioral+anosmia+in+transgenic+mice.">Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice.</a> Neuron. 27 (3), 487-497 (2000).</li><li>Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+deficient+in+G(olf)+are+anosmic.">Mice deficient in G(olf) are anosmic.</a> Neuron. 20 (1), 69-81 (1998).</li><li>Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anosmia+caused+by+a+targeted+disruption+of+the+mouse+olfactory+cyclic+nucleotide-gated+cation+channel.">General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel.</a> Neuron. 17 (4), 681-693 (1996).</li><li>Reisert, J., Lai, J., Yau, K. W., Bradley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+the+excitatory+Cl-+response+in+mouse+olfactory+receptor+neurons.">Mechanism of the excitatory Cl- response in mouse olfactory receptor neurons.</a> Neuron. 45 (4), 553-561 (2005).</li><li>Hengl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+components+of+signal+amplification+in+olfactory+sensory+cilia.">Molecular components of signal amplification in olfactory sensory cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 6052-6057 (2010).</li><li>Smith, D. W., Thach, S., Marshall, E. L., Mendoza, M. G., Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+lacking+NKCC1+have+normal+olfactory+sensitivity.">Mice lacking NKCC1 have normal olfactory sensitivity.</a> Physiolog., &amp; Behavior. 93 (1-2), 44-49 (2008).</li><li>Menco, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+aspects+of+olfactory+signaling.">Ultrastructural aspects of olfactory signaling.</a> Chemical Senses. 22 (3), 295-311 (1997).</li><li>Serizawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+identity+code+for+the+odorant+receptor-specific+and+activity-dependent+axon+sorting.">A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting.</a> Cell. 127 (5), 1057-1069 (2006).</li><li>Baumgart, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolding+by+MUPP1+regulates+odorant-mediated+signaling+in+olfactory+sensory+neurons.">Scaffolding by MUPP1 regulates odorant-mediated signaling in olfactory sensory neurons.</a> Journal Of Cell Science. 127 (11), 2518-2527 (2014).</li><li>Strotmann, J., Wanner, I., Krieger, J., Raming, K., Breer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+odorant+receptors+in+spatially+restricted+subsets+of+chemosensory+neurones.">Expression of odorant receptors in spatially restricted subsets of chemosensory neurones.</a> Neuroreport. 3 (12), 1053-1056 (1992).</li><li>Jenkins, P. M., McEwen, D. P., Martens, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+cilia:+linking+sensory+cilia+function+and+human+disease.">Olfactory cilia: linking sensory cilia function and human disease.</a> Chemical Senses. 34 (5), 451-464 (2009).</li><li>Tadenev, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Bardet-Biedl+syndrome+protein-8+(BBS8)+perturbs+olfactory+function,+protein+localization,+and+axon+targeting.">Loss of Bardet-Biedl syndrome protein-8 (BBS8) perturbs olfactory function, protein localization, and axon targeting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (25), 10320-10325 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

The en face preparation technique described in this protocol provides a powerful tool for the detailed analysis of the olfactory system. So far, most studies characterizing the localization of signaling proteins use immunostainings of cryosections. They present a good overview of the olfactory epithelium, and protein expression in distinct cell types or regions can be easily identified. However, expression in olfactory cilia is sometimes hard to detect. Even if ciliary localization is obvious, cryosections offer...

אפיתל ריח העכבר בחלל האף כולל 6-10,000,000 עצב סנסורי חוש הריח דו קוטבי 1. כל נוירון חוש הריח בוחר אחד של 1,200 גני קולט odorant לביטוי. איתור של odorants מתחיל בodorant מחייב קולטני ריח 2, אשר לאחר מכן מפעיל cyclase adenylyl סוג III (ACIII) 3 דרך חלבון G הספציפי Gα חוש הריח olf 4. העלייה וכתוצאה מכך monophosphate המחזורית אדנוזין (cAMP) פותחת מחזורי (CNG), ערוץ קטיון לא סלקטיבי שהוביל לזרם של Ca 2 + וNa +, ולאחר מכן Ca מגודרת נוקלאוטיד 2 + זרם מוביל לפתיחת Cl Ca 2 + מופעל - ערוץ 5,6. וכתוצאה מכך כלפי חוץ Cl - השטף הוא הקל על ידי Cl תאיים גבוה - ריכוז מתוחזק על ידי Cl היציב - ספיגה, סביר להניח באמצעות Na + / K + / Cl - NKCC1 cotransporter,Cl - / HCO3 - SLC4A1 מחליף, ומובילים עדיין להיות מזוהים אולי נוספים 6-8. יש נוירונים חוש הריח דו קוטביים אקסונים בודדים, unbranched שמקרינים ישירות לנורת חוש הריח, ודנדריט שמשתרע על פני השטח של האפיתל ומסתיים כתא מיוחד, הידית דנדריטים. מהכפתור הזה, 10-30 cilia, שיכול להגיע לאורך של עד 50-60 מיקרומטר, נובע לריר המכסה את פני השטח האפיתל 9. חלבונים של המפל הולך אותות הקנונים הם מקומיים בעיקר בקרום של cilia אלה. המשטח החושי המוגבר של האפיתל מגביר את היכולת לזהות odorants. עקב הצפיפות של עצב סנסורי, cilia המשתרע מידיות דנדריטים שכנות להתערבב. כך מצויים בתערובת אקראית של cilia מתאי עצב שונה, המבטאים סוגים שונים של קולטני ריח, על פני השטח של האפיתל. האיתור והתאהקצאת רגילה של חלבוני הריסים אשר נמצאים רק בתת-קבוצה של תאי עצב תחושתיים היא קשה ולכן בcryosections. בנוסף, האיתור המדויק של חלבונים כגון לאורך הריסים הוא בקושי אפשרי, שכן cryosections הוא בדרך כלל דק יותר מהאורך הממוצע של cilia. כדי לאפשר חקירה של לוקליזציה הריסים של חלבונים בממברנה עד כה uncharacterized בתאי עצב הרחה, אנו מותאמים en טכניקת הכנת פנים המאפשרת ניתוח מפורט של לוקליזציה חלבון בcilia. בקצרה, העכבר הוא הקריב והראש לפצל ליד קו האמצע. Turbinates, האף, ועצמות חזיתיות יוסרו כדי לחשוף את המחיצה. המחיצה עם חלק חוש הריח של האפיתל הבטנה הוא התיר על ידי חיתוך כל החיבורים לחלל האף. לאחר לשים את המחיצה לתוך צלחת פטרי מלא בפתרון של רינגר, האפיתל הוא קילף und הועבר לשקופיות זכוכית מצופים. בעקבות fixat קצרצעד יון, ניתן לבצע נהלי immunostaining אם הטיפול הוא עדין ככל האפשר, כדי למנוע נזק של רקמת הרירית. אנחנו מדגימים את הרזולוציה השגה על ידי השוואת ההכתמה של שני חלבוני קרום שונים בcilia חוש הריח בcryosections הקלאסי ובen הפנים ההכנה תיארה.

<table><tbody><tr><td>Spring scissors</td><td></td><td></td><td>straight tip, multiple suppliers</td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td></td><td></td><td>sharp and blunt end, multiple suppliers</td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td></td><td></td><td>curved tips, Dumont #7, multiple suppliers</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td></td><td></td><td>extra thin, multiple suppliers</td></tr><tr><td>Binocular with illumination</td><td></td><td></td><td>multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td></td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Liquid-blocker pen</td><td>Science Services</td><td>N71310</td><td></td></tr><tr><td>Polysine coated slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SPE</td><td></td></tr><tr><td>primary antibody Goat anti-Kirrel2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF2930</td><td>1:200</td></tr><tr><td>primary antibody Rabbit anti-mOR-EG</td><td>Baumgart et al., 2014</td><td></td><td>1:200</td></tr><tr><td>secondary antibodies</td><td>Life Technologies</td><td>A21206, A11057</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>toxic, work under fume hood</td></tr></tbody></table>

whole mount labeling of cilia in the main olfactory system of mice

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

אפיתל ריח en הכנות פנים יכול לשמש כדי לחקור לוקליזציה של חלבונים בcilia של תאי עצב תחושתיים, המאפשר חקירה מפורטת של חלבוני הלוקליזציה אינה ברורה לאחר ניתוח cryosections. בעיה זו יכולה להיות שהודגמה במקרה של ההכתמה לKin של חלבון כמו IRRE-2 (Kirrel2). Kirrel2 (המכונה גם Neph3) הוא חבר ?...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice at JoVE.com

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

הר תיוג כל צילה במערכת חוש הריח העיקרית של עכברים

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

whole-mount-labeling-of-cilia-in-the-main-olfactory-system-of-mice

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.1K Views.  Universitaetsklinikum Jena. Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

Video: Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

Simple and Computer-assisted Olfactory Testing for Mice

Olfaction is highly conserved among species and is required for reproduction and survival.
In humans, olfaction is also one of the senses that is affected with aging and is a strong predictor of neurodegenerative diseases. Thus, olfaction testing is used as a non-invasive diagnostic method to detect neurological deficits early on. In order to understand the mechanisms underlying olfactory network susceptibility, olfactory research in rodents has gained momentum in the past decade.
Here, we present a very simple, time efficient and reproducible olfactory testing method of innate odor perception and sensitivity in mice without the need of any prior food or water restriction. The tests are performed in a familiar environment to the mice, require only the scents and a 2 min session of odorant exposure. The analysis is performed, post-hoc, using computer-assisted commands on ImageJ and can be, therefore, carried out from start to end by one researcher.
This protocol does not require any special hardware or setup and is indicated for any laboratory interested in testing olfactory perception and sensitivity.

We present a simple and unbiased olfactory test in mice. With this protocol olfactory discrimination, preference, avoidance and sensitivity to a novel odor as compared to water can be assessed in single behavioral sessions. This method is indicated for a single experimenter and analysis is based on computer-assisted video processing.

פשוט וחוש ריח בדיקה לעכברים בסיוע מחשב

Olfaction is highly conserved among species and is required for reproduction and survival.
In humans, olfaction is also one of the senses that is affected ...

Behavior

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

הדמיה פרומון חישה ב תכשיר Vomeronasal עכבר רקמות חריפה Slice

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

פעילויות הדמיה ריח ועוררה הנורה חוש הריח באמצעות עכבר אופטי החזר אותות autofluorescence

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Quadunple Immunostaining של הנורה חוש הריח עבור ויזואליזציה של חוש הריח חושפת אקסון מולקולרית קודי זהות

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and parenting. Importantly, mice can be trained to associate novel odors with specific behavioral responses to provide insight into olfactory circuit function. This protocol details the procedure for training mice on a Go/No-Go operant learning task. In this approach, mice are trained on hundreds of automated trials daily for 2&#8211;4 weeks and can then be tested on novel Go/No-Go odor pairs to assess olfactory discrimination, or be used for studies on how odor learning alters the structure or function of the olfactory circuit. Additionally, the mouse olfactory bulb (OB) features ongoing integration of adult-born neurons. Interestingly, olfactory learning increases both the survival and synaptic connections of these adult-born neurons. Therefore, this protocol can be combined with other biochemical, electrophysiological, and imaging techniques to study learning and activity-dependent factors that mediate neuronal survival and plasticity.

Here, we train mice on an associative learning task to test odor discrimination. This protocol also allows for studies on learning-induced structural changes in the brain.

מבחן אובייקטיבי, לשחזור של למידה חוש הריח ואפליה בעכברים

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and ...

An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures. The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, respiratory, and squamous epithelia which differ markedly in anatomical locations, morphology, and functions. In adult mice, the nose is covered with various skull bones, limiting experimental access to internal structures, especially those in the posterior such as the main olfactory epithelium (MOE). Here we describe an effective method for obtaining almost the entire and intact nasal tissues with preserved anatomical organization. Using surgical tools under a dissecting microscope, we sequentially remove the skull bones surrounding the nasal tissue. This procedure can be performed on both paraformaldehyde-fixed and freshly dissected, skinned mouse heads. The entire deboning procedure takes about 20-30 min, which is significantly shorter than the experimental time required for conventional chemical-based decalcification. In addition, we present an easy method to remove air bubbles trapped between turbinates, which is critical for obtaining intact thin horizontal or coronal or sagittal sections from the nasal tissue preparation. Nasal tissue prepared using our method can be used for whole mount observation of the entire epithelia, as well as morphological, immunocytochemical, RNA in situ hybridization, and physiological studies, especially in studies where region-specific examination and comparison are of interest.

שיטה ידנית פירוק עצמות אפקטיבית להכין רקמות האף מאוס שלמות עם ארגון האנטומי משומר

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

Biology

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of available mating partners or threats. In mice, this task is executed primarily by the olfactory system and its underlying subsystems, including the main and accessory olfactory systems. Both have peripheral organs populated by sensory neurons expressing G-protein coupled receptors able to bind chemical cues that reach the nasal cavity. Even though the molecular characteristics of these receptors is well understood, little is known about their cognate specific ligands. The method described here combines in situ hybridization detection of olfactory or vomeronasal receptors with immunodetection of phosphorylated ribosomal protein S6 (pS6) - a marker of neuronal activation. This protocol was devised to identify neurons activated after a single event of exposure to purified or complex chemical stimuli detected by the olfactory organs. Importantly, this technique allows the investigation of neurons triggered in biologically relevant contexts. Ideally, this method should be used to probe the molecular biology of the olfactory system and to study olfactory behaviors.

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

This protocol combines in situ hybridization with immunofluorescence to identify olfactory and vomeronasal receptor genes expressed in olfactory sensory neurons after activation by chemical stimuli in the mouse.

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of ...

הר תיוג כל צילה במערכת חוש הריח העיקרית של עכברים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

פשוט וחוש ריח בדיקה לעכברים בסיוע מחשב

הדמיה פרומון חישה ב תכשיר Vomeronasal עכבר רקמות חריפה Slice

פעילויות הדמיה ריח ועוררה הנורה חוש הריח באמצעות עכבר אופטי החזר אותות autofluorescence

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

Quadunple Immunostaining של הנורה חוש הריח עבור ויזואליזציה של חוש הריח חושפת אקסון מולקולרית קודי זהות

מבחן אובייקטיבי, לשחזור של למידה חוש הריח ואפליה בעכברים

שיטה ידנית פירוק עצמות אפקטיבית להכין רקמות האף מאוס שלמות עם ארגון האנטומי משומר

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization