The authors would like to acknowledge Wensheng Liu for invaluable help with cell imaging. This work was supported by grants from the&#160;US National Institutes of Health (R01 CA182467), American Cancer Society (RSG-09-252-01-RMC), Lynn Sage Foundation, and A Sister&#8217;s Hope Foundation.

.1 תרבית תאים של EMT אינדוקציה הערה: EMT יכול להיגרם על ידי טיפול בTGFβ או ביטוי חוץ רחמי של טוויסט גורמי שעתוק, חילזון, או Zeb1 / 2 בתאי האפיתל. שתואר בפרוטוקול זה הוא מערכת EMT מושרה באמצעות ביטוי של חלבון היתוך טוויסט-ER בתאים הונצחו אנושיים החלב אפיתל (HMLE / טוויסט-ER, מתנתו של ד&quot;ר J יאנג, UCSD) 9,11,29. עם 4 hydroxytamoxifen טיפול (TAM), טוויסט-ER חלבון היתוך translocates לגרעין לנהוג שעתוק ותוצאות במעבר EMT מלא ב12-14 ימים 9,11,29. מערכות נוספות EMT מושרה, כגון HMLE / החילזון-ER, HMLE / TGFβ, וMCF10A / TGFβ, ניתן למצוא בפרסומים הקודמים שלנו 11,30. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאי HMLE / טוויסט-ER במדיום גידול של תאי אפיתל החלב סרום ללא (MEGM) ב37 מעלות צלזיוס חממה עם 5% CO 2. מעבר התאים כל 2-3 ימים שבם מגיעים למפגש 80%. דגירה תאים עם טריפסין 0.15% ב37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות, ולאחר מכן להשבית טריפסין עם עגל בסרום 5% / DMEM. ספין למטה תאי resuspend אותם בMEGM. פלייט תאים בצלחת תרבית רקמה חדשה ביחס של 1 עד 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר TAM באתנול כדי להפוך את פתרון 200 מיקרומטר. הגן על TAM מהאור והחנות ב -20 מעלות צלזיוס. לפני השימוש, טרי להוסיף TAM לתקשורת MEGM בדילול 1: 10,000 כדי להפוך את הריכוז סופי של 20 ננומטר TAM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאינדוקציה של EMT, תאי צלחת 1.6 x 10 6 HMLE / טוויסט-ER לתוך צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטר בשני עותקים. תרבות תאים עם 20 תקשורת ננומטר MEGM TAM המכיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי 1.6 x 10 6 HMLE / טוויסט-ER לתוך צלחת 10 סנטימטר בשני עותקים ולטפל בתאים עם אתנול 0.01% כביקורת שטופל הלא TAM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לאחר הדגירה, לצלם תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה 10x להקליט שינויים מורפולוגיים של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום מצלחת אחת של שליטה או שטופל TAMתאים. שטוף תאים עם PBS הקר, ותאי קציר על ידי מבטל מחצית מהצלחת במאגר תמוגה RNA לבידוד RNA ואת החצי השני בחיץ Ripa לניתוח חלבונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מעבר מהשליטה או המנות שטופלו על ידי TAM 1.6 x 10 6 תאי ציפוי מחדש בצלחת 10 סנטימטר בשני עותקים. רציפות טיפול בתאים עם 20 ננומטר TAM או רכב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5 עד 7 פעם אחת בכל יום אחר עד היום 14, בו בזמן, תאי טוויסט-ER טופל TAM להראות מורפולוגיה mesenchymal דמוי כישור, ואילו תאי שליטת רכב שטופל לשמור על מורפולוגיה אפיתל כמו מרוצפת-. </li></ol> .2 אפיון EMT הערה: השלמת EMT הוא הצביע על ידי: (1) תא שינויים מורפולוגיים ממורפולוגיה אפיתל כמו מרוצפת למראה דמוי כישור כמו fibroblastic-; הפסד של לוקליזציה E-cadherin בצמתים תאי תאים (2); ו (3) הביטוי עבר של סמני EMT, שהוגדר על ידי האובדןשל סמנים ורווח של סמני mesenchymal אפיתל. שינויים מורפולוגיים תא נתפסו על ידי מיקרוסקופ אור בהגדלה 10x במהלך האינדוקציה EMT הזמן, שתוארו בסעיף 1 זיהוי חיסוני הקרינה של E-cadherin בתא צמתים מתואר בסעיף זה. הביטוי של סמני EMT הוא זוהה על ידי immunoblotting. סמני אפיתל נפוצים הם E-cadherin, γ-catenin, וoccludin, וסמני mesenchymal כוללים פיברונקטין, N-cadherin וvimentin. נהלים כלליים של immunoblotting מתוארים בסעיף 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 12 טיפול TAM, זרע 1 x 10 5 תאים על coverslip מעגלי מ&quot;מ זכוכית 12 להציב גם צלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 שעות לאחר זריעת תאים, בינוניים לשאוב ולשטוף עם PBS המחומם מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים עם paraformaldehyde 4% מחוממים מראש במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם 0.2% טריטון X-100 בPBS ל15דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים בBSA / PBS 5% עבור שעה 1 ב RT לחסום הלא ספציפי מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם E-cadherin הנוגדן הראשוני ב01:50 דילול של 1% BSA / PBS בO תא humidified / N ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: הטווח לדילול נוגדן ראשוני הוא בדרך כלל בין 01:50 ו1: 200, והדילול האופטימלי עבור כל נוגדן צריך להיקבע באופן ניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את הנוגדן הראשוני ולשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם נוגדנים משני שכותרתו ניאון בדילול 1: 500 עבור שעה 1 ב RT. משלב זה על, להגן על התאים מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג נוגדנים משני ולשטוף שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי כתם עם 0.1-1 גר &#39;/ מ&quot;ל ​​DAPI או Hoechst עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאי פעמים עם PBS שלוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslips עם ירידה של מדיום הרכבה, וcoverslips חותם עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב תאים ולקחתתמונות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי 63X. </li></ol> צביעה עם נוגדנים נוספים ניתן לבצע על מנת לאשר את הפנוטיפ EMT. לדוגמא, N-cadherin ויקטינו שריר α-חלק יכולים להיות מוכתם ל29,31,32 פנוטיפ mesenchymal. ארגון מחדש של מבנה cytoskeletal יכול להיות במעקב על ידי צביעת תאים עם phalloidin לF-אקטין 11. בנוסף, ניתן לבצע מבחני לתנועתיות תא והתנגדות תא מוות לבחון את המאפיינים של 11 EMT. .3 איתור של isoforms Splice שימוש מבחני qRT-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב פריימר הערה: זוגות פריימר צריכים להיות מתוכננים בקפידה על מנת להגביר isoforms אחוי ברור. אקסון דילוג, אירוע שחבור החלופי הנפוצה ביותר שנצפה, מוצג כאן כדוגמא כדי להמחיש את האסטרטגיה של עיצוב פריימר. איור 1 א מציג מראש mRNA ארבעה אקסון, עם אקסון השלישי כאקסון משתנה. הכללת אקסון 3 תוצאות בהייצור של איזופורם אחוי יותר, ואילו דילוג של אקסון 3 יוצר איזופורם אחוי קצר יותר. Primers צריך להיות מתוכנן להבחין איזופורם כלול אקסון-3-ואיזופורם אקסון-3-לדלג עליו, וכדי לזהות את התמליל הכולל של mRNA זה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך זיהוי של הכללת אקסון, לעצב בקפידה פריימר קדימה בתוך אקסון משתנה 3, ופריימר הפוכה בתוך אקסון המכונן הסמוך 4, המאפשר להגברה הספציפית של איזופורם-כלול אקסון משתנה. הקפד לא לתכנן שני קדימה לאחור פריימרים בתוך אותו אקסון משתנה על מנת להימנע ממוצרי PCR מוגברים מהדנ&quot;א הגנומי או הרנ&quot;א ראשוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגביר באופן ספציפי אירועי דילוג אקסון, עיצוב אחד של פריימרים פורש הצומת של אקסון המכונן 2 ואקסון 4 שאחרת היה נהרס כאשר אקסון משתנה 3 כלול. עיצוב פריימר האחר בתוך אקסון המכונן .4 ככזה, מוצרי PCR נוצרים רק כאשר אקסון משתנה 3 הוא excludעורך ומכונן אקסון 2 ואקסון 4 לאחר מכן חברו יחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות את התמלילים הכולל של הגן, עיצוב פריימרים בתוך שני אקסונים מכוננים 1 ו -2 וכך, מוצרי PCR הם מוגברים מכל isoforms. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודאו את טמפרטורת ההתכה (TM) עבור כל פריימרים הוא כ 55 ° C, לאורכו של כל צבע יסוד הוא כ 18-22 נוקלאוטידים, ואת הגודל של מוצרי PCR הוא בין 80 ו150 זוגות בסיסים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיצוי RNA: חלץ RNA באמצעות כוללת ערכת בידוד RNA (ראה טבלה של חומרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים ב350 מאגר תמוגה RNA μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 350 μl של 70% אתנול לlysate ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את המדגם לעמודת טיהור RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 10,000 דקות 1 וזרימה דרך קלפים שנזרקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה פעם אחת עם 500 μl שלי לשטוף חיץ RNA ופעמים עם חיץ לשטוף RNA II. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חיץ לשטוף RNA שיוריתהשני מהטור על ידי צנטריפוגה במהירות המרבית למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הטור לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל חדש, להוסיף מים nuclease ללא 50 μl במרכז מטריצת העמודה וelute RNA על ידי צנטריפוגה במהירות המרבית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינתזה של cDNA הראשון הגדיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז ואיכות של RNA על ידי מדידת ספיגת UV. הערה: RNA באיכות טובה צריכה יחס הספיגה / 280 ננומטר 260 ננומטר של כ 2.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תגובות טרנסקריפטאז (RT) המכילות 250 RNA ng סך הכל, 0.05 מיקרוגרם פריימרים hexamer האקראי, 50 pmol MgCl 2, 10 dNTP pmol, 2 μl 5 × חיץ GoScript, ואנזים RT μl 1 בנפח סופי של μl 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע תגובות RT ב42 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, ואחריו דגירה ב70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להשבית את אנזים RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן אמת PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה 20 תגובות μl שמורכבות מתערובת הורים הירוקים SYBR 10 μl,.1-1.0 תבנית μl cDNA, וpmol 5 קדימה הפוך פריימרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל בזמן אמת PCR עם 40 מחזורים מהשלבים הבאים: 95 מעלות צלזיוס denaturation עבור 10 שניות, 58 ° C חישול עבור 10 שניות, ו60 ° C הארכה ל30 שניות. לבצע PCR תגובות בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו עקומות דיסוציאציה ולוודא ששיא יחיד הוא ציין עבור כל קבוצת פריימר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את ערכי מחזור כימות (CQ) על ידי חישוב הערכים נגזרים השני של עקומות הגברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הכמות היחסית (RQ) של mRNAs היעד בדגימות מושרה בהשוואה למדגם uninduced באמצעות &quot;דלתא הדלתא Cq (ΔΔCq) &#39;שיטה כפי שמוצג על ידי הנוסחא הבאה. השתמש בגני משק בית, כגון GAPDH או TBP, כנקודת התייחסות. </li></ol></li></ol><img alt="משוואת 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51845/51845eq1.jpg" /> כדי לחשב בצורה מדויקת יותר את הערכים יחסי של isoforms אחוי, tהוא משתמש בגני התייחסות מרובים, צריך להיחשב. ניתן לנתח את התוצאות באמצעות שיטת כימות ערך המוחלט שונה שתוארה על ידי אל Pfaffl et 33,34. .4 בחינת isoforms אחוי ברמת החלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים ב100 חיץ Ripa קר כקרח μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר lysates על קרח למשך כ 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 14,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C, ולאסוף את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד ריכוז חלבון על ידי מבחני ברדפורד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל דגימות חלבון בחיץ טעינת SDS ולטעון 20-40 מיקרוגרם של חלבונים לתוך ג&#39;לי SDS-PAGE 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ג&#39;לי SDS-PAGE ב20 mA ל1.5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלבונים לממברנות PVDF במערכת העברה רטובה על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות ב85 V. התאם את זמן העברה על פי המשקל המולקולרי של חלבוני יעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום בלוק ב5% חלב דל שומן ל30 דקות ל1 שעות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה wi קרוםth נוגדן ראשוני על 4 מעלות CO / N. הטווח לדילול נוגדן ראשוני הוא בדרך כלל בין 1: 200 ו1: 5,000, לקבוע את הדילול האופטימלי עבור כל נוגדן באופן ניסיוני. ניתן למצוא הדילול של נוגדנים המשמשים בפרוטוקול זה ב&quot; טבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים &quot;. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות isoforms אחוי, להשתמש בנוגדנים ספציפיים שיכירו איזופורם מסוים. לחלופין, להשתמש בנוגדן שמכיר אפיטופ באזור אקסון המכונן הקידוד ולזהות isoforms אחוי בו זמנית המבוסס על גדלי החלבון השונים שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בה בעת, לפקח EMT ידי immunoblotting לסמני EMT. השימוש E-cadherin, γ-catenin, וoccludin כסמני אפיתל, ופיברונקטין, N-cadherin וvimentin כסמני mesenchymal. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעמים קרום לשטוף שלוש עם TBS-T (50 מ&quot;מ טריס, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4) במרווח של 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה קרום עם נמלה משנית HRP-מצומדותibody בדילול 1: 10,000 לשעה 1 בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעמים קרום לשטוף שלוש עם TBS-T במרווח 5 דק &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין חלבון עם מערכת איתור chemiluminescence ולחשוף את הקרום לסרט autoradiography. </li></ol>

<ol>
	<li>Thiery, J. P., Sleeman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+networks+orchestrate+epithelial-mesenchymal+transitions.">Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).</li><li>Yang, J., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+at+the+crossroads+of+development+and+tumor+metastasis.">Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis.</a> Dev Cell. 14, 818-829 (2008).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+master+regulator+of+morphogenesis,+plays+an+essential+role+in+tumor+metastasis.">a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis.</a> Cell. 117, 927-939 (2004).</li><li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+is+a+repressor+of+E-cadherin+gene+expression+in+epithelial+tumour+cells.">The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.</a> Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).</li><li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression.">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).</li><li>Comijn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two-handed+E+box+binding+zinc+finger+protein+SIP1+downregulates+E-cadherin+and+induces+invasion.">The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion.</a> Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).</li><li>Bolos, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Slug+represses+E-cadherin+expression+and+induces+epithelial+to+mesenchymal+transitions:+a+comparison+with+Snail+and+E47+repressors.">The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors.</a> J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).</li><li>Eger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeltaEF1+is+a+transcriptional+repressor+of+E-cadherin+and+regulates+epithelial+plasticity+in+breast+cancer+cells.">DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells.</a> Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).</li><li>Shapiro, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+EMT-driven+alternative+splicing+program+occurs+in+human+breast+cancer+and+modulates+cellular+phenotype.">An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype.</a> PLoS Genet. 7, e1002218 (2011).</li><li>Warzecha, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ESRP-regulated+splicing+programme+is+abrogated+during+the+epithelial-mesenchymal+transition.">An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition.</a> EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).</li><li>Brown, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+splice+isoform+switching+in+human+and+mouse+epithelium+is+essential+for+epithelial-mesenchymal+transition+and+breast+cancer+progression.">CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression.</a> J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).</li><li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li><li>Liu, S., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+RNA+splicing+and+cancer.">Alternative RNA splicing and cancer.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).</li><li>Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+of+RNAs+transcribed+from+the+human+abl+gene+and+from+the+bcr-abl+fused+gene.">Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene.</a> Cell. 47, 277-284 (1986).</li><li>Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+HLA-A+and+-B+antigens+via+an+alternative+RNA+splicing+pathway.">Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway.</a> J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).</li><li>Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+a+Qa/Tla+class+I+major+histocompatibility+antigen+gene+is+a+general+feature+of+oncogenesis+in+the+mouse.">Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse.</a> Nature. 306, 756-760 (1983).</li><li>Barbaux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+splice-site+mutations+in+WT1+are+responsible+for+Frasier+syndrome.">Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome.</a> Nat Genet. 17, 467-470 (1997).</li><li>Charlet, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+muscle-specific+chloride+channel+in+type+1+myotonic+dystrophy+due+to+misregulated+alternative+splicing.">Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing.</a> Mol Cell. 10, 45-53 (2002).</li><li>Hutton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+missense+and+5'-splice-site+mutations+in+tau+with+the+inherited+dementia+FTDP-17.">Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17.</a> Nature. 393, 702-705 (1998).</li><li>Kohsaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+9+mutations+in+the+WT1+gene,+without+influencing+KTS+splice+isoforms,+are+also+responsible+for+Frasier+syndrome.">Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome.</a> Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).</li><li>Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+splicing+regulated+by+a+CUG-binding+protein+in+myotonic+dystrophy.">Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy.</a> Science. 280, 737-741 (1998).</li><li>Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+regulation+of+insulin+receptor+alternative+splicing+is+associated+with+insulin+resistance+in+myotonic+dystrophy.">Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy.</a> Nat Genet. 29, 40-47 (2001).</li><li>Spillantini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+the+tau+gene+in+familial+multiple+system+tauopathy+with+presenile+dementia.">Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotonic+dystrophy+evidence+for+a+possible+dominant-negative+RNA+mutation.">Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation.</a> Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).</li><li>Graubert, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+mutations+in+the+U2AF1+splicing+factor+in+myelodysplastic+syndromes.">Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Genet. 44, 53-57 (2012).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+SF3B1+mutation+in+myelodysplasia+with+ring+sideroblasts.">Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts.</a> N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).</li><li>Yoshida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+pathway+mutations+of+splicing+machinery+in+myelodysplasia.">Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia.</a> Nature. 478, 64-69 (2011).</li><li>Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial-mesenchymal+transition+generates+cells+with+properties+of+stem+cells.">The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.</a> Cell. 133, 704-715 (2008).</li><li>Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snail+represses+the+splicing+regulator+epithelial+splicing+regulatory+protein+1+to+promote+epithelial-mesenchymal+transition.">Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition.</a> J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).</li><li>Serini, G., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+myofibroblast+activity+and+phenotypic+modulation.">Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation.</a> Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).</li><li>Zavadil, J., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+and+epithelial-to-mesenchymal+transitions.">TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions.</a> Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).</li><li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, e45 (2001).</li><li>Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qBase+relative+quantification+framework+and+software+for+management+and+automated+analysis+of+real-time+quantitative+PCR+data.">qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data.</a> Genome Biol. 8, R19 (2007).</li><li>Boutz, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+post-transcriptional+regulatory+switch+in+polypyrimidine+tract-binding+proteins+reprograms+alternative+splicing+in+developing+neurons.">A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons.</a> Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).</li><li>Salomonis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+regulates+mouse+embryonic+stem+cell+pluripotency+and+differentiation.">Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).</li><li>Calarco, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vertebrate+nervous+system+alternative+splicing+and+development+by+an+SR-related+protein.">Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein.</a> Cell. 138, 898-910 (2009).</li><li>Grabowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+takes+shape+during+neuronal+development.">Alternative splicing takes shape during neuronal development.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).</li><li>Seol, D. W., Billiar, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+caspase-9+variant+missing+the+catalytic+site+is+an+endogenous+inhibitor+of+apoptosis.">A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis.</a> J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).</li><li>Srinivasula, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+endogenous+dominant-negative+short+isoform+of+caspase-9+that+can+regulate+apoptosis.">Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis.</a> Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).</li><li>Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+of+Bcl-2-related+genes+functional+consequences+and+potential+therapeutic+applications.">Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications.</a> Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).</li><li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements.">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37, 331-340 (2005).</li><li>Cheng, C., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CD44+alternative+splicing+by+SRm160+and+its+potential+role+in+tumor+cell+invasion.">Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ההליך המתואר כאן מאפשר זיהוי של שחבור חלופי במודל EMT מושרה. כשינויים כאלה, דינמיים ביטוי איזופורם אחוי יכולים לנפול בפח בכל המהלך של EMT הזמן. לשיטה זו יתרונות על פני השימוש בepithelial- שונה או שורות תאים המייצגים-mesenchymal להשוואה של שחבור חלופי בגלל רקע גנטי שונה משורות תאים ...

מעבר אפיתל-mesenchymal (EMT) הוא תכנית התפתחותית שמניעה המורפוגנזה איבר ושיפוץ רקמות במהלך embryogenesis. כאשר מופעלים באופן חריג, EMT מקדם גרורות סרטני ואיבר סיסטיק 1,2. מחקרים משכנעים שתיארו את החשיבות של רגולציה תעתיק במהלך התהליך של EMT, שהוגדרו על ידי כמה גורמי שעתוק, כגון טוויסט, חילזון, וZeb, שמדחיקים את הביטוי של חלבון צומת E-cadherin adherens, וכתוצאה מכך האובדן של cobble- אבן כמו מורפולוגיה ורווח של פנוטיפ mesenchymal דמוי כישור 3-8 אפיתל. מחקרים שנעשה לאחרונה באמצעות ניתוח הגנום של RNAs חשפו כי קיים קבוצה של גני שחבור שדפוסים קשורים גם עם פנוטיפים אפיתל או mesenchymal 9,10. עבודה מהמעבדה שלנו מבחינה תפקודית מחוברת שחבור חלופי וEMT. על ידי לימוד CD44 מולקולת הידבקות פני תא, הראינו כי altern CD44שחבור יצירתי מוסדר בחוזקה במהלך EMT, ויותר מכך, שאיזופורם אחוי CD44 מיתוג סיבתי תורם לEMT 11. שחבור חלופי מהווה מודל נפוץ ומשומר של ויסות הגנים, כעד 95% מהגנים רב אקסון אדם שחבור 12-14 לחלופין. על ידי יצירת מוצרי חלבון מרובים מגן יחיד, שחבור חלופי מהווה מנגנון חיוני לגיוון חלבון, הוספת שכבה נוספת של מורכבות לגנום האנושי. ככזה, חוסר ויסות של שחבור חלופי שעלול להוביל להשפעות ביולוגיות עמוקות גורמות למחלות בבני אדם. ואכן, שחבור חלופי חריג במחלות תועד במשך למעלה מעשור 15-25, כולל אחרונים ממצאים שמוטציות בגני מקודדי מכונות הספלייסוזום נמצאות בדרך כלל בתסמונות myelodysplastic 26-28. לכן, פיתוח שיטות אמינות לזיהוי של i שחבור החלופיsoforms הוא בעלת חשיבות רבה בחקר תהליכים ביולוגיים המגוונים כולל EMT. כאן אנו מספקים פרוטוקול כדי לזהות שינויים בשחבור חלופי באמצעות מודל EMT מושרה. השיטות לעיצוב פריימרים PCR וגילוי isoforms אחוי הן מתאימות לא רק למחקר של שחבור חלופי במהלך EMT, אלא גם למחקר של שחבור חלופי בתהליכים ביולוגיים אחרים. חוקר שחבור חלופי במהלך EMT הוא הכרחי על מנת להבין טוב יותר את המנגנונים של EMT וגרורות סרטניים, ובכך להקל את הפיתוח של אסטרטגיות יעילות לטיפול בגרורות סרטן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1167">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:123px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:564px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-hydroxytamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7904</td>
			<td>Make stock solution by dissolving in ethanol to 200&#956;M, and keep at -20&#8451; protected from light.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit</td>
			<td>Omega Bio-Tek</td>
			<td>R6731</td>
			<td>Total RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoScript Reverse Transcription System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A5001</td>
			<td>Reagent for qRT-PCR assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq qPCR Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6002</td>
			<td>Reagent for qRT-PCR assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LightCycler 480 Real-Time PCR System</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td>Equipment for qRT-PCR assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD44 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BBA10</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E-cadherin antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4065</td>
			<td>1:2500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#947;-catenin antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2309</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">occludin antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td>
			<td>sc-5562</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fibronectin antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610077</td>
			<td>1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-cadherin antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610920</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">vimentin antibody</td>
			<td>NeoMarkers</td>
			<td>MS-129-p1</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GAPDH antibody</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>MAB374</td>
			<td>1:10000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amasham ECL Western blotting detection reagent</td>
			<td>GE Health Life Science</td>
			<td>RPN2209</td>
			<td>Chemiluminescence system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

הנהלים שתוארו לעיל מספקים שיטה חזקה כדי לזהות שחבור חלופי במהלך EMT. תוצאות נציג של מיתוג איזופורם אחוי CD44 במהלך EMT-Induced טוויסט הן כדלקמן לדוגמא ירושלים. EMT-Induced טוויסט בתאי HMLE / טוויסט-ER התאפיין במעבר ממרצפות כמו פנוטיפ אפיתל לפנוטי?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition at JoVE.com

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

detection-alternative-splicing-during-epithelial-mesenchymal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

12.9K Views.  Northwestern University Feinberg School of Medicine. Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Video: Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

אור / חושך מעבר מבחן עכברים

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

זיהוי של חלבון Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

גילוי Metalloproteinases מטריקס פונקציונלית על ידי Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

זיהוי של שינויים היסטון בעלים הצמח

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

תרבויות אלטרנטיבי לפלוריפוטנטיים אנושיים לתאים גזע ייצור, תחזוקה וניתוח גנטי

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually untranslated &#8212; first exons. Bcrp1 (Abcg2), the murine orthologue of the ABC transporter Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), has at least four alternative promoters that are designated by the corresponding four alternative first exons produced: E1U, E1A, E1B, and E1C. Herein, in-silico protocols are presented to predict alternative promoter usage for Bcrp1. Furthermore, reporter assay methods are described to produce reporter constructs for alternative promoters and to determine the functionality of putative promoters upstream of the alternative first exons that are identified.

With the murine ABC transporter Bcrp1 (Abcg2) as an example, in-silico protocols are presented to detect alternative promoter usage in genes expressed in mouse tissues, and to evaluate the functionality of the alternative promoters identified using reporter assays.

שיטות לגלות אלטרנטיבי שימוש יזם ותקנת תעתיק של Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

גישה חלופית עבור הכנת דוגמאות עם מספר סלולרי נמוך עבור ניתוח TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...