Name: in vivo imaging of dauer-specific neuronal remodeling in c. elegans
Uploaded: 2014-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans at JoVE.com

I thank Dr. Maureen Barr, under whose supervision the dauer IL2 remodeling phenotype was initially characterized. Thanks to Dr. C. Britt Carlson for critical reading of the manuscript. Funding in the Barr lab was from the NIH (5R01DK59418) and postdoctoral fellowships from the USDA (2010-65106-20587) and the New Jersey Commission on Spinal Cord Research (CSCR12FEL004). Current funding for this work is from a University of Illinois Urbana-Champaign College of ACES FIRE grant.

.1 גולמי דאואר פרומון הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול OP50 E. coli מO מושבה אחת / N על 37 מעלות צלזיוס בזמן רועד בשל מרק LB 100 מ&quot;ל ב 200 סל&quot;ד. הערה: O / תרבות N זה יכול להתבצע מראש ולאחסן ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול N2 ג elegans על 15-20 יוני סנטימטר צלחות פטרי עם אגר NGM (ראה מתכון בטבלה 1) שנזרע עם 50 μl של OP50 E. coli עד החיידקים קרוב למיצוי 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 250 מ&quot;ל 5x של תקשורת S (ראה מתכון בטבלה 1) ב1 L Erlenmeyer צלוחיות 19. הערה: פתרון זה יכול להתבצע מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבות של OP50 E. coli ב4 L של O מרק LB / N על ידי יחסינו עם 1 מ&quot;ל של OP50 בE. coli ורועד ב37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את נמטודות מצלחות (שלב 1.2) עם 1 מ&quot;ל של תמיסת S הבסיסית (ראה מתכון בטבלה 1) ונמטודות העברת 4-5 צלחות לכל אחד מ4 1 צלוחיות L Erlenmeyer עם תקשורת S מוכנה בשלב 1.3 (4 5 צלחותלכל בקבוק) 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה OP50 משלב 1.4 ב650 XG עבור 10 דקות ולהסיר supernatant. Resuspend כל גלולה חיידקים ב10 מ&quot;ל של תמיסה בסיסית S. העבר את הכמויות שווה של חיידקי resuspended בקבוק אחד של נמטודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלוחיות על שייקר מסלולית בטמפרטורת חדר (20 - C ° 25) ו100 - סל&quot;ד 150 ל4 - 5 ימים עד הפתרון מתחיל לנקות, מה שמעיד על דלדול של מזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמזון יאזל, לגדול עוד תרבות O / N של OP50 E. coli ב4x 1 ליטר מרק LB. צנטריפוגה החיידקים ב650 XG עבור 10 דקות ולהוסיף גלולה מבקבוק אחד לכל אחד מצלוחיות תקשורת S עם נמטודות. החזר את צלוחיות תקשורת S לייקר מסלולית, כמו בשלב 1.7, ל3-4 ימים נוספים עד שהאוכל יגמר שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1 מ&quot;ל aliquot ~ של פתרון מכל בקבוק ולהעריך את ריכוז נמטודות על ידי תת דגימת μl 1 מכל aliquot 1 מ&quot;ל ולספור את המספר של נמטודות. הערה:אוכלוסיית נמטודות צריכה להיות 50,000 - 75,000 מ&quot;ל / נמטודות. בריכוז זה רוב נמטודות הוא dauers. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבטל את כל צלוחיות מזוהמות. הערה: זיהום לעתים קרובות בא לידי ביטוי כקורי פטרייה ראו במהלך צעד 1.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נמטודות צנטריפוגה ב 4,000 XG 10 דקות ב 4 ° C.. זורק את כדור נמטודות ולשמר את supernatant. לחלופין, ראה דיון על שימוש בבעלי חיים אלה כדי להפוך את פרומון נמוך עוצמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את supernatant דרך נייר סינון Whatman # 1. הערה: בקבוק ריק יהיה לזרז את התהליך הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן לסנן את supernatant באמצעות יחידות סינון ואקום סטרילי 0.45 מיקרומטר. הערה: אפשר לשמור התסנין O / N ב 4 מעלות צלזיוס או להמשיך ל1.14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את התסנין לכוס 2 L עם בר ומערבב. מניחים במנדף על צלחת ומערבבים חימום. מביא לרתיחה תוך כדי ערבוב ולהתאדות כ 200 מ&quot;ל. מעבירים את הפתרון לכוס 500 מ&quot;ל. המשך הרותח עד כ 50 מ&quot;ל הוא le. Ft הערה: יש להקפיד במהלך שלב זה כפי שהוא אפשרי לפתרון לרתוח. הצבע של 50 מ&quot;ל הסופי הוא חום כהה. בכל עת במהלך תהליך הבישול, החום יכול להיות כבוי והתסנין מאוחסן O / N ב RT או 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו מגניב ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב1,000 x גרם. יוצקים את supernatant לתוך מבחנה מ&quot;ל 100 וזורקים את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים את supernatant לקרום חום. מסירים מאש ולשבור את הקרום עם מרית. הוספת אתנול 200 הוכחה מספק כדי לכסות את הקרום. כסה את הכוס עם Parafilm ולתת לו לשבת O / N ב RT. יוצקים את אתנול לתוך מבחנה נקייה ולשים בצד. הוספת אתנול טרי כדי לכסות את הקרום. חזור על עקירות O / N 3 פעמים. בריכת התמציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במשאבת ואקום לייבוש תמציות אתנול. אם משאבת ואקום אינה זמינה, להוסיף את תמצית אתנול לכוס וחמה נקיים ל50 ° C תוך ערבוב במנדף. הערה: לאחר אתנול התאדה שאריות דביקות של ליטרצבע חום ight צריך להישאר. אם נעשה שימוש בחימום, יש להיזהר לא לשרוף את הפתרון על ידי חימום במשך זמן רב מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר שאריות ב10 מ&quot;ל של מים סטריליים מזוקקים. סנן לעקר את הפתרון הזה עם מסנן 0.22 מיקרומטר מזרק ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס ב1 aliquots מ&quot;ל. הערה: 1 מ&quot;ל של מים המשמש להמסת השאריות לתרבות נמטודות נוזל המקורית כל 100 מ&quot;ל. לדוגמא, אם אחד מצלוחיות התרבות הנוזלית נמחקת עקב זיהום, ואז להתאים את כמות מים המשמשת להמסת השאריות. </li></ol> .2 קביעת פרומון מנה התגובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פרומון dauer על ידי ביצוע 6x 5 מ&quot;ל של תקשורת NGM עם אגר נובל, ללא peptone, ותוספת 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל סטרפטומיצין סולפט ומגוון של פרומון dauer (ראה מתכון בטבלה 1) 4, 19. מערבבים את המרכיבים ב13x100 מ&quot;מ צינור תרבות זכוכית, לרתוח מבער בונזן, ולאחר מכן שופך לתוך 3 סנטימטר צלחות פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול בבוקרצינור icrocentrifuge. הוסף 1 מ&quot;ל של תרבות O / N של E. coli OP50 לצינור ו צנטריפוגות ב XG 17,000 ~ בצינור microcentrifuge. הסר את כל supernatant. לשקול את הצינור שוב ולקבוע את המשקל של גלולה החיידקים. Resuspend גלולה עם חיץ M9 (ראה מתכון בטבלה 1) לריכוז סופי של 4% (w / v). Aliquot 10 μl של ההשעיה חיידקים על גבי במרכז כל צלחת פרומון 4. O צלחות חנות / N ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק 10-15 הרמפרודיטים wild-type הרה להולדת N2 יום אחד לאחר הנשירה לבגרות לצלחות פרומון 4. אחסן את הצלחות ב25 מעלות צלזיוס במשך 3 - 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את כל הרמפרודיטים המבוגרים. רשום את מספר הביצים שהוטלו על כל צלחת. חותם את הצלחות עם Parafilm ולחזור ל25 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את אחוז dauers (איור 2). הערה: בשתי השיטות חשוב לציין כי dauers (ולשעבר פחותיםאוהל שאינו dauers) יטפס על הקירות ועל המכסה של צלחות פטרי. לכן חשוב לבחון את כל המשטחים של המנה לנמטודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את הנתונים לעקומת מנת תגובה ולהעריך את ריכוז EC 90 של פרומון (פרומון מספיק כדי לגרום 90% מבעלי החיים ליצירת dauers) כפי שמוצג באיור 3 הערה:. אנחנו בדרך כלל להשתמש במודל רגרסיה לוגיסטי כדי לאמוד את EC 90 , אבל ייתכן שיש לי חבילות תוכנה סטטיסטיות שונות שיטות חלופיות שמייצרות הערכות דומות. </li></ol> .3 הדמיה חיה של נוירונים IL2 דאואר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחות פרומון dauer כמו בפרוטוקול 2 באמצעות ערך EC 90 קבע בשלב 2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום dauers באמצעות השיטות בפרוטוקול 2 עם זן שנשא transgene כתב IL2 משולב (myIs13 [KLP-6 P :: GFP], myIs14 [KLP-6 P :: GFP], myIs16 [P <eמ &#39;&gt; KLP-6 :: tdTomato] או qIs56 [P פיגור 2 :: GFP]) 12, 20, 21 הערה:. אם q Is56 משמש, הביטוי של GFP לא יהיה גלוי בIL2Qs עד כמה שעות לתוך נשירת dauer וחלק מאירועי שיפוץ הראשוניים לא יהיה גלוי. בנוסף, בעוד שאות הניאון מtransgene הפיגור 2 :: GFP P סופו של דבר בהיר בIL2s במהלך dauer מאשר KLP-6 כתבי ניאון P, P הפיגור 2 :: transgene GFP מבטא גם חולשה בשרירי הראש ש יכול להסוות את סניפי IL2 בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הטלת ביצים, להסיר את הרמפרודיטים המבוגרים, לאטום את הצלחות עם Parafilm ודגירה של 34 שעות ב25 ° C 17. הערה: משך הזמן לנשירת dauer משתנה מעט בין יחידים. תקופה המהירה ביותר של arborization דנדריט מתחילה 4 - 5 שעות הבאות תחילת נשירת dauer (39-44ההודעה hr 25 מעלות צלזיוס) 12 נחת ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני ההדמיה, מרכיבים את פתרון של 10% (w / v) agarose במאגר M9 עם פרומון dauer בריכוז EC 90. Aliquot כ 100 μl של agarose לשקופית מיקרוסקופ ובמהירות, אך בעדינות, מקום שקופית אחרת על גבי כדי ליצור משטח agarose שטוח. לאחר agarose יש הקרושה, לעטוף את השקופיות בניילון נצמד וחנות בתא לחות (קופסא קצה פיפטה עם מגבות נייר רטובות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה 34 שעה, לבחון צלחות פרומון לנמטודות שהפסיקה שאיבת בלוע. שקופיות נפרדות כזה שרק אחד פני השטח של שקופית אחת יש agarose על זה. פיק נמטודות אחד או יותר על 10% משטח agarose ו1 μ l של 0.1 מיקרון חרוזי פוליסטירן 22. הערה: עם אוכלוסייה מסונכרנת היטב, רוב נמטודות על הצלחת תהיה להיכנס לנשירה מL2d לdauer. עם זאת, ייתכן שיש הבדלים בין individuals. לכן חשוב לציין תכונות נוספות (חסימת סטומה, שיפוץ בלוע) כדי להעריך את כמות הזמן שבעלי החיים היו בתוך נשירת dauer (ראה תוצאות נציג לדוגמא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הכיוון (ימין / שמאל, גב / הגחון) של נמטודות. צלמו תמונות Z-ערימה של דנדריט IL2Q בהגדלה 100x עם עוצמת הקרינה הנמוכה ביותר האפשרית כל 15 דקות או לפי צורך לניסוי הספציפי. המשך לכידת תמונות עד נמטודות הפרידה מציפורן L2d והקיבוע הוא בלתי אפשרי או אם בעל החיים מתאושש מdauer (לוע מתחיל שאיבה). כאשר לא באופן פעיל הדמיה, במקום להחליק בתא לחות. הערה: אנו משתמשים במיקרוסקופ epifluorescent עם ניגוד התערבות במה והפרש ממונע (DIC) אופטיקה. </li></ol>

<ol>
	<li>West-Eberhard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Developmental Plasticity and Evolution. , (2003).</li><li>Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dauerlarva,+a+post-embryonic+developmental+variant+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 46, 326-342 (1975).</li><li>Riddle, D. L., Albert, P. S., Riddle , D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans II. , 739-768 (1998).</li><li>Golden, J. W., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+dauer+larva:+developmental+effects+of+pheromone,+food,+and+temperature.">The Caenorhabditis elegans dauer larva: developmental effects of pheromone, food, and temperature.</a> Dev. Biol. 102, 368-378 (1984).</li><li>Riddle, D. L., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Nematode C. elegans. , 393-412 (1988).</li><li>Fielenbach, N., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+dauer+formation+and+the+molecular+basis+of+plasticity.">C. elegans dauer formation and the molecular basis of plasticity.</a> Genes Dev. 22, 2149-2165 (2008).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1-19 (2007).</li><li>Golden, J. W., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218, 578-580 (1982).</li><li>Butcher, R. A., Fujita, M., Schroeder, F. C., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+pheromones+that+control+dauer+development+in+Caenorhabditis+elegans.">Small-molecule pheromones that control dauer development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Chemical Biology. 3, 420-422 (2007).</li><li>Jeong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+structure+and+biological+activity+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer-inducing+pheromone.">Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone.</a> Nature. 433, 541-545 (2005).</li><li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans.">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454, 1115-1118 (2008).</li><li>Schroeder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dauer-Specific+dendrite+arborization+in+C.+regulated+by+KPC-1/Furin.">Dauer-Specific dendrite arborization in C. regulated by KPC-1/Furin.</a> Curr. Biol. 16, 1527-1535 (2013).</li><li>Procko, C., Lu, Y., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+delimit+shape+changes+of+sensory+neuron+receptive+endings+in+C.+elegans.">Glia delimit shape changes of sensory neuron receptive endings in C. elegans.</a> Development. 138, 1371-1381 (2011).</li><li>Albert, P. S., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+alterations+in+sensory+neuroanatomy+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer+larva.">Developmental alterations in sensory neuroanatomy of the Caenorhabditis elegans dauer larva.</a> J. Comp. Neurol. 219, 461-481 (1983).</li><li>Vowels, J. J., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+chemosensory+control+of+dauer+formation+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic analysis of chemosensory control of dauer formation in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 130, 105-123 (1992).</li><li>Vowels, J. J., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+chemosensory+defects+in+daf-11+and+daf-21+mutants+of+Caenorhabditis+elegans.">Multiple chemosensory defects in daf-11 and daf-21 mutants of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 138, 303-316 (1994).</li><li>Ailion, M., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dauer+formation+induced+by+high+temperatures+in+Caenorhabditis+elegans.">Dauer formation induced by high temperatures in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 156, 1047-1067 (2000).</li><li>Neal, S. J., Kim, K., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pheromone Signaling. , 273-283 (2013).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Ouellet, J., Li, S., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+is+required+for+both+dauer+maintenance+and+recovery+in+C.+elegans.">Notch signalling is required for both dauer maintenance and recovery in C. elegans.</a> Development. 135, 2583-2592 (2008).</li><li>Blelloch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gon-1+gene+is+required+for+gonadal+morphogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">The gon-1 gene is required for gonadal morphogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 216, 382-393 (1999).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, (2012).</li><li>Nelson, F. K., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+study+of+the+Caenorhabditis+elegans+secretory-excretory+system+using+laser+microsurgery.">Functional study of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system using laser microsurgery.</a> J. Exp. Zool. 231, 45-56 (1984).</li><li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode,+Caenorhabditis+elegans.">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li><li>Singh, R., Sulston, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+moulting+in+Caenorhabditis+elegans.">Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans.</a> Nematologica. 24, 63-71 (1978).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

בדיקה של neuroplasticity dauer ספציפי ושינויים מורפולוגיים הקשורים dauer אחרים דורשת מבוקרת והיווצרות אמינה של dauers או באמצעות מוטציה גנטית (מוטציות כלומר, daf-ג) או על ידי חשיפה של חיות בר מהסוג לפרומון. בעוד שהשימוש במוטציה גנטית כדי לגרום dauers הוא נוח, הוא עשוי לבלבל את התוצא?...

פלסטיות פנוטיפי, כוללים פלסטיות התפתחות והתנהגות, חשובה להסתגלות לתנאי סביבה שליליות ולנחשב לכוח מניע בהתפתחות 1. ג elegans הוא אורגניזם מודל המשמש לעתים קרובות ללימודים בפיתוח ונוירוביולוגיה. בתנאים אידיאליים, ג elegans מתפתח דרך ארבעה שלבי זחל לפני כניסת שלב הרבייה הבוגרת. עם זאת, בתנאים של זמינות נמוכה מזון וצפיפות אוכלוסייה גבוהה, ג elegans יכול לעבור מתג התפתחותיים ולהיכנס לשלב dauer חיים ארוך ועמידות לעקות 2. Dauers להציג כמה הבדלים מורפולוגיים והתנהגותיים מאינם dauers אשר צפוי לתווך התנגדות ללחץ הזה. הרמזים הסביבתיים ומסלולים גנטיים המסדירים כניסת dauer היו תיארו בהרחבה 3, 4, 5, 6, 7. עם זאת, המנגנונים המולקולריים שליטה שינויי פנוטיפי בודדים המתרחשים דהיווצרות dauer uring הם הבינו פחות טוב. הבדיקה של פנוטיפים dauer ספציפי דורשת הייצור של בעלי החיים dauer. זה יכול להיות מושלם בשלוש דרכים: 1) בחירה מתרבות מורעבת של ג elegans, 2) שימוש בהיווצרות dauer (daf-c המכונן) מוטציות, 3) אינדוקציה של היווצרות dauer באמצעות פרומון מטוהר. זה פשוט יחסית כדי לאסוף dauers מצלחת NGM סטנדרטית עם ג אוכלוסיית elegans שמיצתה את מזון אספקת החיידקים שלה. בידיים שלנו, צלחת NGM סטנדרטית במקור זרע עם 50 μl של Escherichia coli OP50, מותר לגדול במשך 3 ימים ולאחר מכן מחוסן עם 3 - הרמפרודיטים 4 מבוגרים המשיך ב25 ° C יתיש אספקת מזון בתוך שבוע אחד ולייצר כמה אלף dauers בתוך 3 ימים נוספים (בנוסף למים שאינם dauers מורעב רב). עם זאת, שיטה זו אינה מניחה את הדעת לתהליכי בחינה המתרחשים במהלך הנשירה לדאאואר. קשה לקבוע איזו מכמה אלף בעלי חיים על צלחת מורעבת טיפוסית נכנסים לdauer. יתר על כן, שימוש בצלחת מורעבת מציעה שום אפשרות לסנכרון. השימוש במוטציות daf-c מאפשרים סנכרון והדור אמין של dauers. עם זאת, אין ערובה לכך שמוטצית daf-c בפרט לא תשפיע פנוטיפים dauer ספציפי אחרים לבד או בשילוב עם מוטציות נוספות. הנוכחות של פרומון dauer נרמזה לראשונה על ידי Cassada וראסל ומאוחר יותר לידי הביטוי בזהב וחידה. פרומון dauer מאז מאופיין כימי 2, 8, 9, 10. פרומון המטוהר מורכב מתערובת מורכבת של ascarosides, אשר בצורות שונות להסדיר שני תהליכים התנהגותיים והתפתחותיים 9, 11. שימוש בתמצית פרומון dauer הגולמי מאפשרים אינדוקציה אמינה מבוקרת של dauers המסונכרן ברקע wild-type. </p&gt; מערכת העצבים ותאי גליה הקשורים לעבור שיפוץ במהלך זחל dauer היווצרות 12, 13, 14. חלק משינויים אלה הם בלתי הפיכים, כגון שיפוץ של תאי גליה במהלך dauer 13, 14. עם זאת אירועי שיפוץ אחרים הם הפיכים על שיבה לחיובית תנאים סביבתיים. לדוגמא, קבוצה של ארבעה נוירונים IL2Q לעבור שיפוץ עצבי מהיר והפיך במהלך היווצרות dauer כולל: arborization דנדריט, מתג מהדנדריטים יחידים לתאי עצב והאקסון multidendritic שיפוץ 12. השיטות בזאת לאפשר להדמית in vivo אמינה של neuroplasticity מתח מושרה באורגניזם מודל. השיטות שהוצגו לייצור והבדיקה של פרומון dauer גולמי שתוארו קודם לכן, ונאספו מכמה מקורות 4, 8, 15, 16, 17, 18.

<table><tbody><tr><td>N2 &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; Bristol strain</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PT2660 myIs13[P&lt;sub&gt;klp-6&lt;/sub&gt;::gfp] III</td><td>Upon request from Schroeder lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PT2762 myIs14[P&lt;sub&gt;klp-6&lt;/sub&gt;::gfp] V</td><td>Upon request from Schroeder lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JK2868 qIs56[P&lt;sub&gt;lag-2&lt;/sub&gt;::gfp] V</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Tritech Research</td><td>60 mm T3308, 35 mm T3501</td><td></td></tr><tr><td>NGM agar</td><td>Various</td><td></td><td>3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O autoclaved cooled to 55&amp;deg;C followed by 1 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 ml of 1 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; buffer (pH 6.0), 1 ml of 1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 ml of 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>S Media</td><td>Various</td><td></td><td>S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.5 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 250 ml. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 ml of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate&lt;sub&gt;, &lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 100 ml, autoclaved), 2.5 ml of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;bull;7 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.2 g MnCl2&amp;bull;4 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.29 g ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;bull;7 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.025 g CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;bull;5 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 ml of 1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, and 0.75 ml of 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.</td></tr><tr><td>Dauer pheromone plates for dose-response assay</td><td>Various</td><td></td><td>Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 ml of 0.513 M NaCl and 5 &amp;micro;l of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 ml culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to bring the volume to 4.725 ml.&amp;nbsp; Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 &amp;deg;C. Add 125 &amp;micro;l 1 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; buffer (pH 6.0), 50 &amp;micro;l 0.1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 50 &amp;micro;l 0.1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; and 50 &amp;micro;l of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.&amp;nbsp; Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).</td></tr><tr><td>Microsphere beads 0.1 micron</td><td>Polysciences Inc.</td><td>00876-15</td><td></td></tr><tr><td>M9 buffer</td><td>Various</td><td></td><td>Mix 3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 liter. Sterilize by autoclaving</td></tr></tbody></table>

in vivo imaging of dauer-specific neuronal remodeling in c. elegans

מנגנוני השליטה פלסטיות פנוטיפי שנגרם עקב מתח בבעלי חיים הם לעתים קרובות מורכבים וקשים ללמוד in vivo. דוגמא קלאסית של פלסטיות שנגרם עקב מתח היא שלב dauer של ג elegans. Dauers הוא שלב זחל התפתחותית חלופי נוצר בתנאים של ריכוזים נמוכים של חיידקים שבמזון וריכוזים גבוהים של פרומון dauer. Dauers להציג פלסטיות התפתחות והתנהגות נרחבת. לדוגמא, קבוצה של ארבעה רביע פנימי labial הנוירונים (IL2Q) עוברים שיפוץ הפיך נרחב במהלך היווצרות dauer. ניצול הכניסה הידועה dauer ויסות מסלולים סביבתיים, שיטה הוקמה בעבר לייצור פרומון dauer הגולמי מתרבויות נמטודות נוזל בקנה מידה גדולה הוא הוכיח. בשיטה זו, ריכוז של 50,000 - 75,000 / נמטודות מ&quot;ל של תרבות הנוזלית הוא מספיק כדי לייצר פרומון dauer הגולמי חזק מאוד. עצמת פרומון הגולמי היא determined ידי המבדק מנת תגובה. לבסוף, השיטות המשמשות בזמן לשגות הדמיה vivo של IL2Qs במהלך היווצרות dauer מתוארות.

הייצור של תוצאות פרומון dauer הגולמי בנוזל צהוב (איור 1) שהוא גם חום ויציב קר. Aliquots של פרומון גולמי מאוחסנים ב -20 ° C ללא הגבלת זמן ללא הפסד ברור בפעילות. בעקבות הייצור של פרומון, המבדק מנת תגובה אחת מספיק להערכה גסה של עוצמה. עם זאת, עבור רוב הניסויים יש צורך לחזור ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans at JoVE.com

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

In vivo ההדמיה של דאואר ספציפי עצבי שיפוץ בג elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

in-vivo-imaging-of-dauer-specific-neuronal-remodeling-in-c-elegans

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

11.2K Views.  University of Illinois Urbana-Champaign. Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer. 

Video: In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

התקני microfluidic פשוטים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt;,<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ודג זברה

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Bioengineering

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Biochemistry

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biology

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Quantifying Levels of Dopaminergic Neuron Morphological Alteration and Degeneration in Caenorhabditis elegans

Dopamine neuron loss is involved in the pathology of Parkinson&#39;s Disease (PD), a highly prevalent neurodegenerative disorder affecting over 10 million people worldwide. Since many details about PD etiology remain unknown, studies investigating genetic and environmental contributors to PD are needed to discover methods of prevention, management, and treatment. Proper characterization of dopaminergic neuronal loss may be relevant not only to PD research, but to other increasingly prevalent neurodegenerative disorders.
There are established genetic and chemical models of dopaminergic neurodegeneration in the Caenorhabditis elegans model system, with easy visualization of neurobiology supported by the nematodes&#39; transparency and invariant neuronal architecture. In particular, hermaphroditic C. elegans&#39; dopaminergic neuron morphological changes can be visualized using strains with fluorescent reporters driven by cell-specific promotors such as the dat-1 dopamine transporter gene, which is expressed exclusively in their eight dopaminergic neurons.
With the capabilities of this model system and the appropriate technology, many laboratories have studied dopaminergic neurodegeneration. However, there is little consistency in the way the data is analyzed and much of the present literature uses binary scoring analyses that capture the presence of degeneration but not the full details of the progression of neuron loss. Here, we introduce a universal scoring system to assess morphological changes and degeneration in C. elegans&#39; cephalic neuron dendrites. This seven-point scale allows for analysis across a full range of dendrite morphology, ranging from healthy neurons to complete dendrite loss, and considering morphological details including kinks, branching, blebs, and breaks. With this scoring system, researchers can quantify subtle age-related changes as well as more dramatic chemical-induced changes. Finally, we provide a practice set of images with commentary that can be used to train, calibrate, and assess the scoring consistency of researchers new to this method. This should improve within- and between- laboratory consistency, increasing rigor and reproducibility.

Quantifying Levels of Dopaminergic Neuron Morphological Alteration and Degeneration in Caenorhabditis elegans

In this article, we showcase how to use a seven-point scoring system to consistently quantify changes to dopaminergic neuron dendrite morphology in C. elegans. This system is intended for analyses of dopaminergic neurodegeneration assays utilizing genetic, chemical, and age-based models of neurodegenerative disorders.

כימות רמות של נוירון דופאמין שינוי מורפולוגי ניוון ב elegans Caenorhabditis

Dopamine neuron loss is involved in the pathology of Parkinson&#39;s Disease (PD), a highly prevalent neurodegenerative disorder affecting over 10 million ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

In vivo ההדמיה של דאואר ספציפי עצבי שיפוץ בג elegans

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

התקני microfluidic פשוטים עבור

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

כימות רמות של נוירון דופאמין שינוי מורפולוגי ניוון ב elegans Caenorhabditis

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo