המחברים מודים רנה Scriwanek לסיוע בהכנה של איור. FR נתמך על ידי ECHO (700.59.003), תכנית alw הפתוחה (821.02.017 ו822.02.014), שיתוף הפעולה DFG-NWO (DN82-303) וZonMW VICI (016.130.606) מענקים.

1. Spheroplast הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הלילה בשעה השמרים 30 מעלות צלזיוס ב10 מיליליטר של המדיום המתאים נקבע על ידי העיצוב של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום אחרי, למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות ב 600 ננומטר (OD 600) באמצעות פוטומטר, לדלל תאים באותו מדיום תרבות 600 OD של 0.2-0.4 ולגדל אותם לשלב גידול מעריכי, אלא אם כן את העיצוב של ניסוי דורש תנאים שונים. תאים נמצאים בשלב מעריכי כאשר התרבות יש OD 600 של 1-2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 10 OD 600 שווה של תאים על ידי צנטריפוגה ב3,500 XG במשך 5 דקות בצינור 50 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה, לבטל את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 5 מיליליטר של 100 צינורות מ&quot;מ (pH 9.6), 10 dithiothreitol מ&quot;מ וטופחו ב30 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף שוב את התאים על ידי צנטריפוגה ב3,500 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים in 5 מיליליטר של מדיום (שנקבע על ידי העיצוב של הניסוי) המכיל 1 M סורביטול ו5 מ&quot;ג של אנזים ממס, ודגירה את התערובת על 30 ° C עם הרעד עדין למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה תא XG 300 5 דקות כדי לאסוף את החלק יחסי גלולה, אשר תואם את spheroplasts. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend spheroplasts ב960 μl של תקשורת קרה כקרח (נקבע בינוני על ידי העיצוב של הניסוי) המכיל סורביטול 1 M ולהעביר את התערובת לקרה כקרח 2 מיליליטר צינור microcentrifuge. </li></ol> 2. Nanogold ספיגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, לערבב בעדינות spheroplast עם 4 nmol של חלקיקים בעלי מטען חשמלי חיוביים nanogold resuspended ב40 μl מים. הנפח הסופי של התערובת צריך להיות של 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ההשעיה התא שהושגה על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את ההשעיה בטמפרטורת חדר והדגירה אותו לזמן הנדרש כדי לאפשר הפנמת nanogold באמצעות דוארndocytosis. הערה: ספיגת 5 דקות בעיקר תוביל לתיוג של שלפוחית ​​endocytic ומדורי endosomal מוקדם, תוך ספיגת 15 דקות תאפשר לסמן את מערכת כולה endosomal (מוקדם וendosomes המאוחרת). פעמים דגירה ארוכות יותר (יותר מ 30 דקות) גם תאפשר לתייג vacuole. הערה: לא ניתן לבצע ניסויי תיוג Pulse-מרדף עם שיטה זו. לכן, כאשר התיוג לניתוח של LE, nanogold יהיה נמצא גם באתר ראש הממשלה וinEE. </li></ol> 3. קיבוע וחתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את ספיגת nanogold על ידי הוספת 1 מיליליטר של מקבע כפול כוח [paraformaldehyde 4% (PFA), glutaraldehyde 0.4% (GA) במאגר M 0.1 PHEM (20 צינורות מ&quot;מ, 50 HEPES מ&quot;מ, pH 6.9, 20 מ&quot;מ EGTA, 4 מ&quot;מ MgCl 2)] המכיל סורביטול M 1 עד ההשעיה התא. שמר את הצינור בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפוך ידני את צינורות micocentrifuge מספר פעמים במהלך 30 דקות (זה יאפשר לשמור spheroplasts בהשעיה) ואז צנטריפוגות אותו פעמיים ב1,700 XG במשך 25 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את מקבע על ידי השלכת supernatant ועל ידי הוספת 1 מיליליטר של מקבע כוח סטנדרטי טרי (2% PFA, 0.2% GA במאגר M 0.1 PHEM) מכיל 1 סורביטול M ו דגירה עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר על גלגל מסתובב באיטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את התאים לcryo-חתך כפי שתואר לעיל 6. הערה: לקבלת נהלי שיפור ספיגת nanogold וכסף, הטיפול בחומצה התקופתית שתוארה בפרוטוקול שצוין לא שיש לבצע. הטיפול בחומצה התקופתית הוא permeabilize דופן תא 26 טוב יותר אבל המבנה הזה כבר בוטל בדור של spheroplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 50 cryosections הדק ננומטר ב-C ° -120 עם סכין יהלום יבש באמצעות ultramicrotome UCT כפי שתואר בעבר 8 ומניח אותם על פחמן Formvar המצופה 50 משתלב רשתות ניקל. </li></ol> 4. כסף שיפור לNanogold החלקיקים visualization הערה: ההליך להכנת תערובות התגובה הוא בעצם אחד שצוין על ידי היצרן. עיבודים מעשיים באמצעות פרוטוקול זה, הופך את הליך שיפור הכסף יעיל ואמין על cryosections. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את ערכת שיפור כסף מהמקפיא ולהפשיר אותו ב37 מעלות צלזיוס חממה או אמבט מים. כשהפשיר, הנח את הערכה בחממה 24 ° C להציב לתוך חדר חשוך עד לשימוש (ראה 4.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת החימום בחדר החשוך ולחמם אותו לטמפרטורה הסופית של 24 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את החלק העליון של צלחת חימום עם מגן פני השטח, צד מבריק, ולאבטח אותו עם קלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את Parafilm על Benchkote ולסמן את הקצוות עם טוש שחור כדי להיות מסוגל לראות את קצות Parafilm בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת מדחום בחלק העליון של Benchkote לנטר את הטמפרטורה של פלטת החימום. בהדרגה להתאים את הטמפרטורה אם לא 24 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Plaלסה&quot;נ צינור 50 מיליליטר עם מים מזוקקים כפולים וערכת שיפור כסף בפנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את צלחות פטרי קטנות עם מים מזוקקים פעמיים, חימם מראש על 37 ° C. הנח את הרשתות במים, הדגימה צד למטה, ל30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עוד פעם אחת 4.7 שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הרשתות בקופסא האחסון ולהביא אותם לחדר החשוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הרשתות שוב על ידי עובר אותם (עם צד הדגימה למטה) על כמה טיפות של מים מזוקקים פעמיים ב24 ° C מונחות על Parafilm שתוקן על צלחת החימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי 9 טיפות מים נוספות מזוקקים כפולות מוכנות בParafilm, לשטיפה לאחר תגובת שיפור כסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את האור ולוודא שכל האורות כבויים. כבה את האור האדום על. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את פתרונות A ו-B של ערכת שיפור כסף מן החממה 24 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 6 טיפות הראשונות של הפתרון ולאחר מכן 6 טיפות של תמיסת B ב1.5 מ &#39;צינור l microcentrifuge, ולערבב היטב עם זכוכית פיפטה פסטר הימנעות לעשות בועות. הפתרון הוא די עבה ויש לו להיות מעורב באופן ידני עם טפטפת לפני סוף סוף vortexing את זה בקצרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את פתרונות A ו-B בחזרה בחממת 24 ° C ולהוציא את פתרון C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 טיפות של תמיסת C ל/ B התערובת. אז לערבב שוב ראשון עם פיפטה פסטר ולאחר מכן על ידי vortexing, להימנע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באופן מיידי את התערובת הסופית על ידי הצבת טיפות (~ 20 μl / ירידה) על Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם פינצטה נקייה, אנטי מגנטית, הנח את הרשתות על התערובת (לדוגמא., תגובת כסף שיפור) במשך 6 עד 15 דקות בהתאם לשיפור (כלומר. הגודל של חלקיקי זהב) ביקש להתקבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרשתות מהתערובת ולהעביר אותם בחלק העליון של המים מזוקקים פעמיים טיפות ב24 מעלות צלזיוס במשך שוטף. ראשית, להשתמש במהירות רצף טיפות 6 ולאחר מכן 3 טיפות עם 7 דקות זמן דגירה לכל טיפה, לפני שמפנה את האורות הדולקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לשלב הבא, בין אם תיוג חיסוני זהב או מכתים קרום 27 כדי להמחיש את התוצאה לחקירת EM. </li></ol>

<ol>
	<li>Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endocytic+pathway:+a+mosaic+of+domains.">The endocytic pathway: a mosaic of domains.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).</li><li>Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomes:+multipurpose+designs+for+integrating+housekeeping+and+specialized+tasks.">Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks.</a> Histochem Cell Biol. 117, 91-104 (2002).</li><li>Luzio, J. P., Pryor, P. R., Bright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomes:+fusion+and+function.">Lysosomes: fusion and function.</a> Nature Rev Mol Cell Biol. 8, 622-632 (2007).</li><li>Meel, E., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+imagination:+understanding+the+endo-lysosomal+system.">Imaging and imagination: understanding the endo-lysosomal system.</a> Histochem Cell Biol. 129, 253-266 (2008).</li><li>Bonangelino, C. J., Chavez, E. M., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+screen+for+vacuolar+protein+sorting+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Genomic screen for vacuolar protein sorting genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Biol Cell. 13, 2486-2501 (2002).</li><li>Griffith, J., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+analysis+of+nanogold-labeled+endocytic+compartments+of+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+using+a+cryosectioning+procedure.">Ultrastructural analysis of nanogold-labeled endocytic compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae using a cryosectioning procedure.</a> J Histochem Cytochem. 57, 801-809 (2009).</li><li>Babst, M., Katzmann, D. J., Estepa-Sabal, E. J., Meerloo, T., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESCRT-III:+an+endosome-associated+heterooligomeric+protein+complex+required+for+MVB+sorting.">ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting.</a> Dev Cell. 3, 271-282 (2002).</li><li>Griffith, J., Mari, M., De Maziere, A., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryosectioning+procedure+for+the+ultrastructural+analysis+and+the+immunogold+labelling+of+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">A cryosectioning procedure for the ultrastructural analysis and the immunogold labelling of yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Traffic. 9, 1060-1072 (2008).</li><li>Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+retrieval+of+the+exocytic+SNARE+Snc1p+from+early+yeast+endosomes.">Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes.</a> Mol Biol Cell. 11, 23-38 (2000).</li><li>Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+of+compartments+in+the+yeast+endocytic+pathway.">Ordering of compartments in the yeast endocytic pathway.</a> Traffic. 3, 37-49 (2002).</li><li>Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fab1p+PtdIns(3)P+5-kinase+function+essential+for+protein+sorting+in+the+multivesicular+body.">Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body.</a> Cell. 95 (3), 847-858 (1998).</li><li>Donselaar, E., Posthuma, G., Zeuschner, D., Humbel, B. M., Slot, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+labeling+of+cryosections+from+high-pressure+frozen+cells.">Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells.</a> Traffic. 8, 471-485 (2007).</li><li>Lah, J. J., Hayes, D. M., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neutral+pH+silver+development+method+for+the+visualization+of+1-nanometer+gold+particles+in+pre-embedding+electron+microscopic+immunocytochemistry.">A neutral pH silver development method for the visualization of 1-nanometer gold particles in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry.</a> J Histochem Cytochem. 38, 503-508 (1990).</li><li>Shah, N., Zhang, S., Harada, S., Smith, R. M., Jarett, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+visualization+of+insulin+translocation+into+the+cytoplasm+and+nuclei+of+intact+H35+hepatoma+cells+using+covalently+linked+Nanogold-insulin.">Electron microscopic visualization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 hepatoma cells using covalently linked Nanogold-insulin.</a> Endocrinol. 136, 2825-2835 (1995).</li><li>Weipoltshammer, K., Schofer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography.">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochem Cell Biol. 114, 489-495 (2000).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+for+ultracryotomy+of+cell+suspensions+and+tissues.">A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues.</a> J Cell Biol. 57, 551-565 (1973).</li><li>Cabrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+a+membrane+curvature-sensing+motif+switches+function+of+the+HOPS+subunit+Vps41+in+membrane+tethering.">Phosphorylation of a membrane curvature-sensing motif switches function of the HOPS subunit Vps41 in membrane tethering.</a> J Cell Biol. 191, 845-859 (2010).</li><li>Harner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+contact+site+complex,+a+determinant+of+mitochondrial+architecture.">The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture.</a> EMBO J. 30, 4356-4370 (2011).</li><li>Nair, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNARE+proteins+are+required+for+macroautophagy.">SNARE proteins are required for macroautophagy.</a> Cell. 146, 290-302 (2011).</li><li>Jacquier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+are+functionally+connected+to+the+endoplasmic+reticulum+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).</li><li>Karanasios, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipid+droplet+and+membrane+biogenesis+by+the+acidic+tail+of+the+phosphatidate+phosphatase+Pah1p.">Regulation of lipid droplet and membrane biogenesis by the acidic tail of the phosphatidate phosphatase Pah1p.</a> Mol Biol Cell. 24, 2124-2133 (2013).</li><li>Mari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Atg9-containing+compartment+that+functions+in+the+early+steps+of+autophagosome+biogenesis.">An Atg9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis.</a> J Cell Biol. 190, 1005-1022 (2010).</li><li>Nair, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Atg8-PE+deconjugation+in+autophagosome+biogenesis.">A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis.</a> Autophagy. 8, 780-793 (2012).</li><li>Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exit+from+the+Golgi+is+required+for+the+expansion+of+the+autophagosomal+phagophore+in+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).</li><li>Erpapazoglou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+role+for+K63-linked+ubiquitin+chains+in+multivesicular+body+biogenesis+and+cargo+sorting.">A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting.</a> Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).</li><li>Tuinen, E., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase,+hexokinase,+and+carboxypeptidase+Y+in+yeast+cells+at+the+ultrastructural+level.">Immunolocalization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, and carboxypeptidase Y in yeast cells at the ultrastructural level.</a> J Histochem Cytochem. 35, 327-333 (1987).</li><li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+and+immunolabeling.">Cryosectioning and immunolabeling.</a> Nat Protoc. 2, 2480-2491 (2007).</li><li>Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+the+yeast+endocytic+pathway.">Morphology of the yeast endocytic pathway.</a> Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).</li><li>Vida, T. A., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast.">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).</li><li>Hainfeld, J. F., Powell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+frontiers+in+gold+labeling.">New frontiers in gold labeling.</a> J Histochem Cytochem. 48, 471-480 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

חיסוני אלקטרונים מיקרוסקופית הוא טכניקה המאפשרת שילוב של לוקליזציה של חלבונים עם הרזולוציה ultrastructural של הנשאים ואברונים שבו חלבונים אלה מתגוררים. זה חיוני במיוחד כאשר לומד את מערכת השמרים endosomal כי התאים שלה מופיעים מבני פיסוק כמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי. לכן קשה להבח...

מערכת endosomal היא מנגנון קרום גדול שמיון משחק תפקידים סלולריים חיוניים רבים, כולל סחר בקולטנים מיון אנזים lysosomal והמחזור של קרום פלזמה (PM) קולטניים 1,2. Endosomes מחולקת בשלושה תאים שונים, כלומר. endosomes המוקדמת (EE), endosomes המאוחרת (LE) וendosomes המיחזור. סיווג זה מבוסס על המשך הזמן שלוקח לחומר endocytosed להגיע אליהם, על חלבוני סמן ספציפיים ועל המורפולוגיה שלהם. ממברנות, כלומר bilayers חלבונים ושומנים בדם, הפנימו מPM יכולים להיות מועברות לlysosomes באמצעות endosomes לשפלה או להיות ממוחזרות בחזרה. ממברנות גם מועברים לendosomes מGolgi ובאופן דומה, או להמשיך lysosomes או להאסף בחזרה לGolgi. יתר על כן, ניתן למיין חלבונים לתוך שלפוחית ​​luminal ניצנים פנימה מן קרום endosomal מגביל, תהליך שמוביל להיווצרות שלקטגוריית משנה של LE, גופי multivesicular. מערכת endosomal השמרים היא יחסית פחות מורכב מזו של תאי אוקריוטים גבוהים. endosomes שמרים מחולקות לEE ו LE. בניגוד לתאי יונקים הם אינם מכילים endosomes מחזור אלא גם אברונים הקשורות לליזוזום רקמות ספציפיות. כתוצאה מכך שיש להם רשת פחות מורכבת של נתיבי סחר endosomal 3,4. לכן שמרים ייצג ועדיין מייצג את מערכת ניסיונית יתרון ללמוד חלק מתנועת הממברנה הבסיסית העקרונות במערכת endosomal. יתרון זה מודגש על ידי העובדה כי גנים רבים המעורבים במסלולי endosomal היו מבודדים בתחילה עם מסכי גנטיים בשמרים 5. בעוד מערכת endosomal השמרים בסוג בר ותאים שעברו מוטציה, נחקרה בהרחבה שימוש בגישות מיקרוסקופית ביוכימי וקרינה, את חקירתה ברמת ultrastructural כבר רקמינימאלי. ניתוחים מורפולוגיים הם רלוונטיים במיוחד בשמרים, כי רוב האברונים endosomal מזוהים כמו מבני פיסוק על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אשר הופכים קשה זיהוי חד משמעי שלהם 6. למרבה הצער רק מספר מוגבל של נסיובי הכרת סמני חלבון השמרים endosomal הוא עובד באימונו אלקטרון מיקרוסקופיה הכנות (IEM) 7-10. לחלבונים מסוימים, בעיה זו כבר לעקוף על ידי התיוג אנדוגני של הגן של עניין והשימוש בנוגדן הכרת התג לזהות אותו 7,11,12. לעתים קרובות, לעומת זאת, חלבונים הם לגילוי על ידי IEM בגלל רמות הביטוי הנמוכה שלהם. ביטוי היתר שלהם הוא לא פתרון, כי גישה זו יכולה לגרום לאי - מגוירת ו / או שינויים במורפולוגיה / פונקציות אברון. כך התיוג של תאי endocytic עם בדיקה לזיהוי על ידי EM במיקרוסקופ אלקטרונים הוא אפשרות יעילה. זה פתרון אופטימלי במיוחד אם יחסי הציבורOBE הוא להיכנס למסלול endocytic באופן תלוי בזמן, המאפשר לדעת מתי זה יהיה סימן אברון ספציפי 6. הספיגה של nanogold הטעון חיובי על ידי spheroplasts שמרים (כלומר. שמרים שבו תא הקיר הוסר אנזימים) בהצלחה נעשתה שימוש כדי לזהות את שמרי endosomal מלתחות 10. חלקיקים אלה מאוד להיקשר לשומנים טעונים השלילי המרכיבים את הקרומים הביולוגיים. כך מקורבי nanogold הטעונים חיובי עם ראש הממשלה, חודרים את התא על ידי אנדוציטוזה ועוברים דרך EE וLE לפני שהגיע לvacuole. חלקיקי זהב הקטנים אלה, עם זאת, אין לי גודל מתאים כדי להיראות על ידי EM. כדי להבהיר להם גלויים, הגודל שלהם יכול להיות מוגדל על ידי תגובות כימיות שיובילו לתצהיר של כסף או זהב סביב חללית זהב 13-15. פיתחנו ויישמו בהצלחה גישת IEM מבוססים על שיטת Tokuyasu לבצע subcellularלוקליזציה לומדת 8,16. שיטה זו מאפשרת ביצוע תיוג immunogold על שמרי הכנות עם רזולוציה מצוינת של המורפולוגיה 8,17-24. יש לנו גם הקימו הליך שילוב פרוטוקול IEM זה עם תיוג nanogold של מערכת השמרים endosomal מלתחות 6. שימוש בגישה זו יש לי מורפולוגית מאופיינת subclasses שונה של endosomes וultrastructurally בדקה מוטנטים עם סחר endosomal פגם 6,25. יתר על כן, אנו מראים כי תיוג nanogold זה יכול להיות משולב עם labelings immunogold מתן האפשרות לחקור את ההפצה של חלבון של עניין באוכלוסיות endosome השונות. כאן אנו מציגים כיצד התיוג של מערכת השמרים endosomal עם nanogold מטען החשמלי חיובי מבוצע כמעט.

<table><tbody><tr><td>PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure)</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1,102,200,250</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>391,340</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1,058,330,250</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>Positively charged Nanogold</td><td>Nanoprobes, Yaphank, NY</td><td>2022</td><td>store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>HQ-silver&amp;trade; enhancement kit</td><td>Nanoprobes, Yaphank, NY</td><td>2012</td><td>store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 8% EM grade</td><td>Polyscience, Inc., Warrington, PA</td><td>216</td><td>store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Lytic enzyme</td><td>MP Biomedicals, Santa Ana, CA</td><td>153526</td><td>store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>50 meshes nickel grids&amp;nbsp;</td><td>Agar Scientific, Stansted, United Kingdom</td><td>G209N</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-immuno diamond knife 35&amp;deg;</td><td>Diatome AG, Biel, Switzerland</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>UCT ultramicrotome&amp;nbsp;</td><td>Leica, Solms, Germany</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 15/95 resine</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>50 meshes nickel grids&amp;nbsp;</td><td>Agar Scientific, Stansted, United Kingdom</td><td>AGG2050N</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Grids storage box</td><td>Leica, Solms, Germany</td><td>162-50</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur capillary pipettes 150 mm</td><td>Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands</td><td>10216234</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;mbrecht, Germany</td><td>72690001</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tube</td><td>Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands</td><td>210296</td><td></td></tr><tr><td>Benchkote surface protector</td><td>Whatman, Maidstone, United Kingdom&amp;nbsp;</td><td>1159201</td><td></td></tr></tbody></table>

nanogold labeling of the yeast endosomal system for ultrastructural analyses

Endosomes אחד של הקרום הגדול מיון מחסומים בתאי אוקריוטים והם מווסתים מחזור או הרס של חלבונים בעיקר מקרום הפלזמה וGolgi. כתוצאה מכך מערכת endosomal ממלאת תפקיד מרכזי בשמירה על הומיאוסטאזיס, ומוטציות בגנים השייכים לרשת זו של האברונים מחוברים על ידי תחבורת ועי, לגרום לפתולוגיות חמורות, כולל סרטן והפרעות הנוירוביולוגי. לכן זה רלוונטי ראש כדי להבין את המנגנונים העומדים בבסיס קיום החיים והארגון של מערכת endosomal. שמרי Saccharomyces cerevisiae היה מרכזי במשימה זו. לתייג באופן ספציפי ולנתח ברמת ultrastructural מערכת endosomal של אורגניזם מודל זה, אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט לספיגת nanogold הטעונה חיובי על ידי spheroplasts אחריו ההדמיה של חלקיקים אלה באמצעות תגובת שיפור כסף. שיטה זו מדי יקר היא גםl לבחינה מורפולוגית של מוטציות עם מומים בסחר endosomal. יתר על כן, זה לא ישים רק לבחינות ultrastructural אבל זה גם יכול להיות משולב עם labelings immunogold לחקירות לוקליזציה חלבון.

על פי הפרוטוקול שהוצג, את המורפולוגיה של מערכת השמרים endosome יכולה להיות גישה על ידי א.מ. שידור. איור 1 מציג סוגים שונים של תאי endosomal שכבר הגיעו ולכן כותרתו עם nanogold. Nanogold משופר הכסף ניתן לראות באופן ברור כחלקיקים צפופים אלקטרונים. ההגדרות אופטימליות שהוקמו לשיפו...

Watch this Scientific Journal Video about Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses at JoVE.com

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

שמרים, שמר האפייה, כבר אורגניזם מודל מפתח כדי לזהות וללמוד גנים המסדירים את קיום החיים ופונקציות של מערכת endosomal. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתיוג הספציפי של תאי endosomal ללימודי ultrastructural.

Nanogold תיוג של מערכת endosomal שמרים לניתוח Ultrastructural

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

nanogold-labeling-yeast-endosomal-system-for-ultrastructural

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Views.  University Medical Center Utrecht.  שמרים, שמר האפייה, כבר אורגניזם מודל מפתח כדי לזהות וללמוד גנים המסדירים את קיום החיים ופונקציות של מערכת endosomal. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתיוג הספציפי של תאי endosomal ללימודי ultrastructural. 

Video: Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

תיוג Immunogold לאחר הטבעה של חלבונים בתרבויות Synaptic Slice היפוקמפוס

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Neuroscience

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

יישום של פלורסנט חלקיקים לחקר שיפוץ של מערכת Endo-lysosomal על ידי חיידקים תאיים

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Immunology and Infection

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A mitochondrial genome of baker&#8217;s yeast encodes eight proteins: three subunits of the cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, and Cox3p), three subunits of the ATP synthase (Atp6p, Atp8p, and Atp9p), a subunit of the ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase enzyme, cytochrome b (Cytb), and mitochondrial ribosomal protein Var1p. The purpose of the method described here is to specifically label these proteins with 35S methionine, separate them by electrophoresis and visualize the signals as discrete bands on the screen. The procedure involves several steps. First, yeast cells are cultured in a galactose-containing medium until they reach the late logarithmic growth stage. Next, cycloheximide treatment blocks cytoplasmic translation and allows 35S methionine incorporation only in mitochondrial translation products. Then, all proteins are extracted from yeast cells and separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Finally, the gel is dried and incubated with the storage phosphor screen. The screen is scanned on a phosphorimager revealing the bands. The method can be applied to compare the biosynthesis rate of a single polypeptide in the mitochondria of a mutant yeast strain versus the wild type, which is useful for studying mitochondrial gene expression defects. This protocol gives valuable information about the translation rate of all yeast mitochondrial mRNAs. However, it requires several controls and additional experiments to make proper conclusions.

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Baker&#8217;s yeast mitochondrial genome encodes eight polypeptides. The goal of the current protocol is to label all of them and subsequently visualize them as separate bands.

תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב Cerevisiae שמרים של בייקר

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Biochemistry

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have constructed fluorescent protein-based markers for major organelles and endomembrane structures, including the nucleus, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes, vacuoles, mitochondria, peroxisomes, lipid droplets, and autophagosomes. The protocol presented here describes the procedures for using these markers in yeast, including DNA preparation for yeast transformation, selection and evaluation of transformants, fluorescent microscopic observation, and the expected outcomes. The text is geared toward researchers who are entering the field of yeast organelle study from other backgrounds. Essential steps are covered, as well as technical notes about microscope hardware considerations and several common pitfalls. It provides a starting point for people to observe yeast subcellular entities by live-cell fluorescent microscopy. These tools and methods can be used to identify protein subcellular localization and track organelles of interest in time-lapse imaging.

Here we describe the use of a set of fluorescent protein-based organelle markers in live-cell imaging of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

יישומים של pHluorin עבור כמותי, קינטי וניתוח תפוקה גבוהה של אנדוציטוזה שמרים הנצה

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

4D מיקרוסקופ של שמרים

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...