אנו מודים לאגודת מקס פלנק, תכנית Frontier אדם המדע (HFSP) וBoehringer Ingelheim Fonds למימון ותמיכה.

1. הכנת חומר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של צינורות FEP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את צינור FEP (איור 2 א) על ידי שטיפת נוזלים (בצעדים האמורים להלן) דרך הצינור ובאמצעות מזרק מצורף עם צינורית קצה קהה (איור 2) באור 1:.. להשתמש בכפפות בכל הליך הערה 2: אנו ממליצים חיתוך הצינור בחתיכות של CA. 1 מ &#39;אורך וניקוי אלה במקביל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית לשטוף את הצינור עם 1 M NaOH שוב ושוב. ואז להעביר את הצינור לצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר מלא 0.5 M NaOH וultrasonicate זה ל10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את צינור הפולימר לאגן קטן עם DDH 2 O. שטוף את הצינור ראשון עם DDH 2 O ולאחר מכן עם EtOH 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לכך להעביר את צינור FEP לצינור צנטריפוגות טרי עם EtOH 70%. שוב ultrasonicate צינור צנטריפוגות זה ל10 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את צינור FEP ניקה לחתיכותשל כ 3 סנטימטר (אורך אופייני לשימוש בהרכבה והדמיה דג הזברה) ויישר אותם במידת צורך. אחסן את צינורות FEP ניקו בצינור צנטריפוגות טרי 50 מיליליטר מלא DDH 2 O (איור 2 ג). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון מניות Tricaine <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.4% מניות פתרון Tricaine ידי המסת Tricaine 400 מ&quot;ג (MS-222) ב97.9 DDH מיליליטר 2 O. לאחר האבקה נמסה לגמרי, להתאים את ה-pH 7.0 באמצעות 2.1 מיליליטר 1M טריס (pH 9.0). הגן על הפתרון מן האור. aliquots חנות ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת methylcellulose 3% <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 3% פתרון methylcellulose לציפוי הפנימי של צינורות FEP כמתואר להלן. לחמם 11 E3 בבקבוק זכוכית של כ 60-70 מעלות צלזיוס ולהוסיף את הכמות המתאימה של אבקת methylcellulose. להוסיף סרגל ערבוב ומערבבים ב 4 ° C. ברגע שהפתרון הוא התקרר אל מתחת 30 מעלות צלזיוס, להוסיף פתרון Tricaine לג סופיoncentration של 100 מ&quot;ג / ל &#39; שמור ערבוב על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של .1.5% וagarose 0.1% בE3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את הכמות המתאימה של אבקת agarose נקודת התכה נמוכה בנפח מוגדר של E3 בבקבוק זכוכית. לחמם את התערובת במיקרוגל ולנער אותו פעם בכמה זמן, עד לפתרון agarose מופיע הומוגנית, ללא כל גבישים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מיליליטר aliquots של .0.1% פתרון agarose ב1.5 מיליליטר צינורות תגובה. ניתן לאחסן aliquots ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפתרון 1.5% למעייל צלחת פטרי פלסטיק. עובי שכבת agarose צריך להיות CA. 2 מ&quot;מ. לאחר agarose הוא התגבש, להוסיף בינוני E3 על גבי השכבה, כדי למנוע אותו מהתייבשות. הצלחת המצופה ניתן לאחסן ב 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של דג הזברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על דג הזברה מבוגר (Danio rerio) ועוברים על 28.5 מעלות צלזיוס ולטפל בהם בהתאם לפרוטוקולים שהוקמו 11,12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את דגי זכר ונקבה בשעתי אחר הצהריים ולהפריד ביניהם באמצעות מחיצה. הסר את המחיצה בבוקר שלמחרת לעת ההזדווגות של הדגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את העוברים בצלחת מלאה בE3 ולבחון אותם באמצעות סטראו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב24 hpf (או שלב התפתחותי העניין שלך), בחר בעובר דג הזברה לביטוי הקרינה ולהעביר את החיוביות לצלחת חדשה עם E3 הטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> dechorionate את העוברים בזהירות תוך שימוש בשני מלקחיים חדים (2D דמויות ו2E). השתמש במלקחיים הראשונים כדי לתפוס ולהחזיק את סיסי ומלקחיים שני לקרוע אותו פתוח ולמשוך אותה באור 1:. בצע את הצעד הזה עם העזרה של סטראו. </li></ol></li></ol> 2. הרכבה רב שכבתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי צינור FEP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צינורית קצה קהה למזרק. הכנס את הצינורית בזהירות במשך כ 3 מ&quot;מ לתוך קצה אחד של ניקה וחתך חתיכה. צינור FEP (2F דמויות ו2G) הערה 1: כפפות ולהימנע מכל שימוש או סחיט כיפוף של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את הקצה החופשי של צינור FEP לmethylcellulose 3% ולמלא את הצינור עם הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט לשחרר את methylcellulose על ידי לחיצה על המזרק. מחק את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלבים 2.1.2 ו 2.1.3 באמצעות E3 הערה 1:. הצינורות מצופים צריכים לשמש להרכבה באופן מיידי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דג הזברה לagarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם aliquot אחד agarose 0.1% ל70 מעלות צלזיוס בגוש חום. ורטקס בקצרה צינור התגובה ולהעביר אותו לגוש חום מוגדר 38 ° C (איור 2H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צינור התגובה מ הגוש החום ולתת לו להתקרר לזמן קצר. הוספת Tricaine לריכוז סופי של 133-200 מ&quot;ג / ליטר ומערבולת שוב (איור 2 ט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באחד מעוברי דג הזברה dechorionated וtransfe. R אותו לצינור התגובה עם agarose 0.1% שחומם מראש באמצעות פיפטה פסטר זכוכית (י 2 דמויות ו2K) הערה 1: נסה להעביר E3 נוסף קטן ככל האפשר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבה דג הזברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את העובר עם צינור FEP מצורף מזרק (איור 2L). . הצינור צריך להיות מלא לחלוטין עם agarose 0.1%, עם העובר ממוקם קרוב לקצה אחד של הצינור ועם הראש והצביע לעבר הפתח של צינור הערה 1: הקפד לקחת כמה agarose לפני תופס את הדגים. הערה 2: משוך בעדינות על המזרק כדי למנוע בועות באור 3:. שמור את הצינור בכיוון אופקי, כדי למנוע דליפה של התוכן שלה (איורים 2M ו2N). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור הצינור <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg"src = &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg&quot; /&gt; איור 2. רב שכבתי וגובר לעוברי דג הזברה.) אתילן Fluorinated פרופילן (צינורות FEP) על תוף כבל לפני הכנה. B) מזרק עם צינורית קצה קהה המצורפת. C) ניקה וחתך צינור FEP. D, E) dechorionation של 24 hpf עוברי דג הזברה. F) חיבור הצינור לצינורית הקצה הקהה. G) המזרק עם צינורית וצינור מחובר. H) aliquot של 0.1% agarose בתוך צינור תגובה בעת העברתו לגוש חום. אני) vortexing של נמס העברת agarose. J) ספיגה של עובר dechorionated באמצעות פיפטה זכוכית. K) של העובר לagarose נמס. L) צריך של העובר עם סובבי agarose לתוך צינור FEP. M, N) עובר דג הזברה בתוך צינור FEP . <strong&gt; O) חיתוך הצינור בין דגימה וצינורית. P) לחבר את הצינור על ידי השימוש בצלחת מצופה agarose. ש) העובר בתוך הצינור המחובר. הכנת המדגם הסופית במחזיק מתכת R). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי צפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את הצינור מהצינורית (איור 2 טו &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להיצמד סוף הצינור המכיל את הדגים דרך כל השכבה של agarose 1.5% בצלחת הפלסטיק לחבר את הצינור (איור 2P) הערה 1:. למנוע היווצרות של בועות ולנסות לקבל משטח ישר תקע על ידי ההחזקה . צינור בדיוק בניצב לפני השטח agarose הערה 2: סובב את הצינור מעט כדי להשיג התוספת נחמדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הדגימה רכוב בצינור תגובה 1.5 מיליליטר עם E3, כדי למנוע התייבשות. המדגם הוא now מוכן להיות צילם. לפני ההדמיה, לבדוק אם הדגים יושבים ממש על גבי התקע (2Q דמויות ו2R). ודא גם להוסיף Tricaine למדיום בתוך חדר ההדמיה באותו הריכוז כמו בהרכבה בינונית. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+functional+imaging+at+cellular+resolution+using+light-sheet+microscopy.">Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy.</a> Nat. Methods. 10 (5), 413-420 (2013).</li><li>Swoger, J., Muzzopappa, M., L&#243;pez-Schier, H., Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+retrospective+lineage+tracing+using+SPIM+for+zebrafish+organogenesis+studies.">4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies.</a> J. Biophoton. 4 (1-2), 122-134 (2011).</li><li>Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+phototoxicity+during+the+development+of+a+zebrafish+craniofacial+bone+using+confocal+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+techniques.">Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques.</a> J. Biophoton. , 1-11 (2012).</li><li>Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+for+real-time+developmental+biology.">Light sheet microscopy for real-time developmental biology.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 566-572 (2011).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+scanned+laser+light+sheet+fluorescence+microscopy.">Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harb. Prot. 2010 (5), (2010).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+imaging+of+entire+embryos+with+Digital+Scanned+Laser+Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy.">Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).</li><li>Desmaison, A., Lorenzo, C., Rouquette, J., Ducommun, B., Lobjois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+sample+holder+for+single+plane+illumination+microscopy.">A versatile sample holder for single plane illumination microscopy.</a> J. Microsc. 10, (2013).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Nusslein-Volhard, C., Zebrafish Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2002).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J. Vis. Exp. (69), (2012).</li><li>Jin, S. -. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. -. N., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).</li><li>Pauls, S., Geldmacher-Voss, B., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+histone+variant+H2A.F/Z+and+a+transgenic+H2A.F/Z:GFP+fusion+protein+for+in+vivo+studies+of+embryonic+development.">A zebrafish histone variant H2A.F/Z and a transgenic H2A.F/Z:GFP fusion protein for in vivo studies of embryonic development.</a> Dev. Genes Evol. 211 (12), 603-610 (2001).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Frazier, D. T., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricaine+(MS-222):+effects+on+ionic+conductances+of+squid+axon+membranes.">Tricaine (MS-222): effects on ionic conductances of squid axon membranes.</a> Eur. J. Pharmacol. 33 (2), 313-317 (1975).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data.">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

שיטות מיקרוסקופיה מתקדמות כגון מיקרוסקופיה גיליון אור תאפשר לנו להקליט את נתוני תמונה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה במשך כמה ימים, אבל גם דורשות מדגם טכניקות הרכבה כדי לשפר. אנו מציגים פרוטוקול מפורט של multilayer הרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור של פיתוח דג הזברה. השיטה היא פשוטה ליישום ואנו משתמשים בו במעבדה שלנו על בסיס יומי. צינורות FEP רכיבים מרכזיים באסטרטגיית ההרכבה שלנו הם צינורות עשויים אתילן Fluorinated פולימר פרופילן (FEP). החלטנו להשתמש FEP בעיקר בשל מדדה השבירה של 1.338, שהוא דומה למים ולכן מתאים באופן אידיאלי למיקרוסקופיה גיליון אור עם מטרות מים טבילה ודגימה הדורשת תקשורת מימית. הצינורות עם 0.8 מ&quot;מ קוטר פנימי ו0.4 עובי דופן מ&quot;מ יתאים לדג הזברה מתפתח יפה מאוד, ניתן להשתמש בם עם מחזיקי מדגם טיפוסיים המתאימים ל1.6 מ&quot;מ<html> נימים והם הבחירה הראשונה שלנו לשיטת ההרכבה הציגה. בדקנו אותם ביסודיות בהגדרות בבנייה העצמית שלנו, כמו גם במערכת המסחרית &quot;Lightsheet Z.1&quot; על ידי Carl Zeiss מיקרוסקופית ומצאנו כי צינורות FEP מציעים יציבות לטווח ארוך, יש השפעה מינימאלית בלבד על ביצועים אופטיים ו10 nonfluorescent. הם, לעומת זאת, אינם מתאימים ליישומים עם דגימות שדורשות מקדם שבירה שונה, למשל פינה דגימה. צינורות, כמו גם שקפים עשויים FEP זמינים במגוון רחב של קטרים ​​ועוביים. בנוסף, ניתן להמס FEP ב 260 ° C ובכך מציע אפשרויות אינסופיות כמעט למדגם תומך הרכבה בהזמנה אישית. צינורות הפולימר נוטים להיות מסופקים לא סטרילי, ולכן פרוטוקול הניקוי משלב מספר צעדים על מנת להבטיח האיכות אופטית הטובה ביותר. הציפוי עם methylcellulose מבטיח ששום חלק של עובר דג הזברה גדל מקלות לפולימר. התחת =&gt; ההרכבה בינונית &quot;jove_step&quot; ההחלטה לagarose 0.1% מבוססת על בדיקות מקיפות של שיעור צמיחה וחוסר תנועה בריכוזים שונים של agarose וmethylcellulose 10. ריכוזי agarose מעל 0.1% כבר הראו השפעה חמורה על קצב הצמיחה של 24 דג הזברה hpf. בנוסף אנו משתמשים במינונים נמוכים של תרופות ההרדמה Tricaine. פוטנציאל פעולה בלוקים Tricaine, ובכך מעכב את העברת האותות בין המוח ושרירים ומדכא התכווצויות שרירים 16. ריכוז של 133-200 מ&quot;ג / ליטר מבטיח חוסר תנועה מספקת של דג הזברה בין 24-72 hpf. עם זאת, Tricaine וסמים הרדמה אחרים שבדקו מינון מופע תופעות לוואי תלוי כגון בצקת לב. בנוסף המינון הנדרש של Tricaine משתנה עם השלב ההתפתחותי של העובר. לכן אנו ממליצים להקטין את ריכוז Tricaine לסכום הדרוש לשלבי ההתפתחות שהם צילמו. כדי להבטיח performan הטוב ביותרce ולמנוע היווצרות של תוצרי לוואי רעיל, יש להשתמש בפתרון מניות Tricaine מוכן או מופשר טריים, מוגן מפני אור ולא מחומם מעל 30 ° C. ההטבעה בצינורות FEP גם מאפשרת שינוי קל של ההרכבה בינונית לתת דין וחשבון לצרכי ספציפיים. עבור זמן לשגות הדמיה של הלב, מומלץ להשתמש methylcellulose 3% ו100 מ&quot;ג / ליטר Tricaine במקום agarose 0.1% ו200 מ&quot;ג / ליטר להרכבה. Methylcellulose הוא צמיג יותר מ -0.1% agarose ובכך לספק חוסר תנועה גבוהה יותר בעצמה ופחות Tricaine צריך לשמש כדי להבטיח כליאה של העובר. Tricaine רגיש לטמפרטורות מעל 30 מעלות צלזיוס, ויכול גם להיות מדולל על ידי הבינוני בחדר ההדמיה, מה שמוביל לירידה בביצועים ומתעוות האפשרית של העובר. לפיכך, הקפד גם להשתמש Tricaine במדיום ההדמיה שבדגימה רכוב היא שקועה. אם הניסויים שלך דורשים שימוש גבוה יותרטמפרטורות, אנו ממליצים להחליף את המדיום בחדר ההדמיה או כל הזמן על ידי שימוש במערכת זלוף או ידני עם צינור ומזרק בין שתי נקודות זמן. שלבים קריטיים השלבים הקריטיים בתהליך של הרכבת מדגם הם הצריכה של הדגימה לתוך הצינור וההחדרה של תקע agarose. הצריכה מגדירה את עמדתו הראשונית של העובר, שהוא מסורבל לשנות לאחר מכן. דגימות מרובות צריכה להיות זמינות לעלות וצריכה להיות במעקב באיכות ההרכבה עם סטראו. אם כיוון המדגם אינו משביע רצון, לשנות את המהירות של ציור את הדגימה והימנעות התנועות הבאות של הבוכנה עשוי לעזור כמו זה לעתים קרובות מסובב את העובר. 1.5% תקע agarose הוא הכרחי כדי למנוע דליפה של agarose .0.1%. פני השטח של התקע בתוך הצינור צריך להיות שטוחים לא להשפיע על הנטייה המדגם במהלך פיתוח. כדי להשיג גלישה טובהאס, בעוביים שונים של שכבות agarose צריכים להיבדק והצינור צריך להיות הכניס לתוך agarose הרגיל אל פני השטח. מסתובב הצינור קצת ומוציא את הצינור משחרר בזהירות את התקע מהצלחת. איכות ההרכבה יש לבדוק עם סטראו לפני ההדמיה. הדמיה Multiview אחד יתרונות גדולים של מיקרוסקופיה גיליון אור הוא ההדמיה Multiview, היכולת לסובב את הדגימה, לרכוש Z-ערימות מזוויות מרובות ולאחר מכן להירשם ולמזג אותם. שיטה הוקמה לרשום Z-הערימות בחלל 3D היא רישום מבוסס חרוז באמצעות חרוזי ניאון המקיפים את המדגם כסמני אמונים 17. שיטה זו אך מסתמכת על הרכבה בינונית מוצקה כגון agarose 1.5% ונראה אפוא להיות בקנה אחד עם multilayer הרכבה שהוצג כאן. אבל כמה פתרונות חלופיים לעבוד בהתאם ליישום. ראשית, חרוזי הניאון יכוליםישולב בתקע agarose, שצריך להיות בשדה הראייה במהלך הרכישה. שנית, יכולות להיות מכוילים עמדות השלב שלפני הניסויים בפועל באמצעות טור agarose 1.5% עם חרוזי ניאון. שלישית, ניתן להשתמש בם סמנים חלופיים כגון גרעיני ניאון כדי לזהות את המיקום של Z-הערימות יחסית זה לזה. התאדות setups מיקרוסקופיה גיליון האור אופייני להשתמש מדגם חדר פתוח, מה שמוביל לאידוי הבלתי נמנע של המדיום. מאז המדיום הוא חיוני להישרדותה של הדגימה, כדי להגביל את האידוי של מדיום ההרכבה ולמקדם השבירה הנכונה בין אופטיקה ומדגם, אנו ממליצים לקחת אחד או יותר מהאמצעים הבאים כדי למנוע אידוי. ראשית, בינוני בתא ניתן להחליף כל הזמן על ידי מערכת זלוף. שנית, המדיום יכול להיות ומילא באופן ידני. שלישית, התא יכול להיות מכוסה במכסה או בנייר כסף גמיש. <pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; אספקת חמצן FEP הפולימר פותח כדי לעמוד במגוון רחב של חומרים כימיים ולכן הוא חזק, אינרטי מבחינה כימית וnonpermeable לגז. במקרה של חמצן רב שכבתי הרכבה יכולה רק לחדור דרך תקע agarose וממשק agarose באוויר, אבל זה עדיין לא הראה אם ​​אספקת החמצן בהרכבה רב שכבתית היא בחומרה נמוכה יותר בהשוואה להתקנה ב1.5% agarose מבלי לתמוך בצינור פולימר. עם זאת, כמו בהרכבת agarose 1.5% יכולים לשמש רק כשעתיים לפני מורפולוגיה דג הזברה מושפעת הרכבה רב שכבתית נראה שיש הפתרון מעולה הכולל הדמיה לטווח ארוך. הדמיה בשלבים מוקדמים יותר של פיתוח רב שכבתי והרכבה הפכה כעת טכניקת ההטבעה סטנדרטית שלנו למיקרוסקופיה גיליון אור הזמן לשגות של hpf מבוגרת מ24 דג הזברה. חוץ מזה, אנחנו גם להשתמש בצינורות הפולימר להדמיה של עוברי שלב מוקדם יותר. הדוארmbryos להישאר בchorions והם רכובים בצינור FEP עם קוטר פנימי של 1 מ&quot;מ ומלא E3. דג הזברה יכולה לפתח בחופשיות בתוך סיסית ועדיין יכולה להיות צילמה גם באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור. השקפה הרכבת המדגם רב שכבתי הציגה משחררת את מלוא הפוטנציאל של מיקרוסקופיה גיליון אור לביולוגיה התפתחותית בזמן אמת עם דג הזברה. זה יכול בקלות להיות מאומץ על שיטות מיקרוסקופיה אחרות כגון טומוגרפיה אופטית הקרנה (OPT) ואורגניזמים אחרים. אנו מאמינים כי צינורות FEP בגודל הסטנדרטי הם רק הצעדים הראשונים לקראת מדגם טכניקות הרכבה המותאמת לצרכי ספציפיים.

כדי להבין את האירועים המורכבים ויחסי גומלין בעובר, במחקר בביולוגיה התפתחותית הוא יותר ויותר עוברים ממיקרוסקופי של תאים ואיברים בודדים להדמית vivo של כל האורגניזמים. שיטות מיקרוסקופיה מסורתיות בדרך כלל לא מצליחות להציע פתרון מרחב ובזמן לעקוב אחר אירועים מהירים על פני תקופה ארוכה של זמן ולעתים קרובות גורמות להלבנה או תופעות phototoxic במדגם 1. אנחנו ואחרים מצאו מיקרוסקופיה גיליון אור (איור 1) להיות הטכניקה האידיאלית עבור ההדמיה vivo של דג הזברה 2-4. התאורה של המדגם עם סדין דק של אור הלייזר, מאונך לציר זיהוי, מציעה חתך אופטי מהיר עם רזולוציה מרחבית גבוהה, כמו גם למזער צילום רעילות 5. במקביל, בשל הסדר אופטי ייחודי זה, טכניקות הרכבת מדגם מסורתיות באמצעות צלחות פטרי או תאי תרבות אינן מתאימות. באור טיפוסישלושה מנועים translational מיקרוסקופ הגיליון ומנוע סיבובי להחזיק את המדגם, כך שזה יכול להיות ממוקם בדיוק, הסתובב ומבט מכל כיוון. בדגימות האחרונות למיקרוסקופיה גיליון אור יש לעתים קרובות היה משובץ ב1-2% agarose בתוך נימי זכוכית 6,7. במקרה זה הצילינדר agarose הקרושה עם הדגימה מוטבעת הנמתח מנימי הזכוכית לתוך תא המדגם מלא בינוני כמו מים להדמיה. יש agarose מקדמת שבירה קרובה למים, ולכן הוא מתאים באופן מושלם למיקרוסקופיה גיליון אור in vivo המאפשרת אופטיקה תאורה וזיהוי תיקן מים. המדגם מוגבל בagarose הנוקשה וניתן הדמיה גם לתקופה קצרה של זמן, אבל שינויים וצמיחה של העובר morphogenetic הם מאוד לקויים כאשר הדמיה במשך כמה שעות 7,8. למרות שפתרונות עבור יישומים אחרים פותחו 9, דג הזברה הזמן לשגות לטווח ארוך לא פולשנית<html> יכולת צילום במיקרוסקופ אור גיליון לא ניתן לנצל באמצעות הטבעת agarose 1.5% הקונבנציונלית. לפיכך, אנו פיתחנו אסטרטגית הרכבה חדשה למיקרוסקופיה גיליון אור vivo של עוברי דג הזברה 10. המדגם הוא רכוב ב0.1% agarose עם Tricaine 200 מ&quot;ג / ליטר בתוך צינור עשוי מפולימר אתילן Fluorinated ברור אופטי פרופילן (FEP). העובר המוטבע מתפתח בדרך כלל עקב צמיגות נמוכה של המדיום. במקביל, צינור FEP מגביל את המדיום ואת המדגם עבור משך הניסוי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט של הטכניקה החדשה ההרכבה ומציג נתונים המשקפת את היתרונות שלה על פני הפרוטוקול הקונבנציונלי. אנו מראים כי עם התפתחות דג הזברה השיטה שלנו ניתן הדמיה ברציפות עם רזולוציה מרחבית ובזמן גבוה על פני תקופה של יותר מיומיים. 5in &quot;עבור: src =&quot; &quot;/&gt; /&quot; = src &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg איור 1. העיקרון של מיקרוסקופיה גיליון אור. דג הזברה רכוב בצינור עשוי אתילן Fluorinated פרופילן (FEP) יכול להיות מתורגמת ומסובב דרך מישור המוקד של מטרת זיהוי. סדין דק של אור הלייזר (גיליון אור) צפוי על ידי מטרת התאורה למישור המוקד של מטרת האיתור ומאיר סעיף אופטי דק בלבד של הדגימה. אות הקרינה הנפלטת נאסף על ידי מטרת האיתור ונרשמה על שבב מצלמה.

<table><tbody><tr><td>Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes</td><td>Bola</td><td>S 1815-04</td><td>0.8/1.6 mm inner/outer diameter, other sizes available</td></tr><tr><td>Omnifix-F Solo 1 ml Syringe</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9161406 V</td><td></td></tr><tr><td>Sterican Single-Use Cannula, blunt</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9180109</td><td>0.8 mm x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube</td></tr><tr><td>50 ml Polypropylene Centrifuge Tube</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M NaOH&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td>supplied as powder</td></tr><tr><td>E3 medium (for zebrafish embryos)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Reaction Tube</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, low gelling temperature</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td>supplied as powder</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Greiner</td><td>633180</td><td>plastic, 94 mm x 16 mm</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>synonyms:&amp;nbsp; Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10X/0.3 W Microscope Objective Lens</td><td>Leica</td><td>HCX APO L</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Andor Technology</td><td>iXon 885 EMCCD</td><td></td></tr></tbody></table>

multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish

מיקרוסקופיה גיליון אור היא טכניקת הדמיה האידיאלית ללמוד התפתחות עוברית דג הזברה. בשל צילום רעילות והלבנה מינימליות, הוא מתאים במיוחד לזמן לשגות הדמיה לטווח ארוך על פני שעות רבות עד מספר ימים. עם זאת, יש צורך במדגם אסטרטגית הרכבה מתאימה, אשר מציעה גם כליאה והתפתחות תקינה של המדגם. רב שכבתי וההרכבה, טכניקת הטבעה חדשה באמצעות agarose ריכוז נמוך בצינורות ברורים אופטי, החברה מתגברת על מגבלה זו ומשחררת את מלוא הפוטנציאל של מיקרוסקופיה גיליון אור לביולוגיה התפתחותית בזמן אמת.

ההדמיה multiday של דג הזברה כלי דם פיתוח אנו משתמשים ב1 DPF Tg (kdrl: GFP) 13 דג הזברה כדי להדגים את היתרונות של אסטרטגית הרכבה רב שכבתית למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך. המטרה היא תמונת ההתפתחות של כלי הדם בכל דג הזברה על קורס של 2 ימים. עובר דג הזברה היה רכוב ב0.1% agarose בתוך צינור פולימר methylcellulose מצופה. הנה, דג הזברה אינה מוגבל על ידי ההרכבה בינונית ויכולה להתפתח באופן נורמלי. ראשו מעלה, הזנב מרחיב כלי דם וההנבטה מופיעה באין מפריעה (איור 3). <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" /> איור 3. הדמיה multiday של פיתוח כלי הדם דג הזברה. כלי הדם של multilayer רכוב 1 DPF Tg (kdrl: GFP) 13 דג הזברה מתפתחת באין מפריע במיקרוסקופ גיליון אור במשך יומיים. גיליון אור הלייזר 488 ננומטר הלהיב את הקרינה ואת האות זוהתה באמצעות 10X/0.3 אובייקטיבי W ומצלמה EMCCD. Z-ערימות נרכשו על ארבעה עמדות סמוכות כל 10 דקות ולאחר מכן תפרו עם 15 פיג&#39;י. תחזיות בעוצמה מקסימלית של קבוצת משנה של נקודות זמן מוצגות. בר סולם:. 500 מיקרומטר <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> הדמיה של דג הזברה מוקדם עובר הנה, אנחנו מדגימים את היכולת של צינורות FEP כתמיכה גוברת למיקרוסקופיה גיליון אור של עובר דג הזברה מוקדם ביום הראשון לאחר הפריה. Hpf Tg 8 (H2A: GFP) 14 עובר דג הזברה היה רכוב עם סיסי בשלמותה בתוך צינור מלא-E3 עם iקוטר nner של 1 מ&quot;מ. כי תוצאות בהידוק קל של סיסית. כל התהליכים התפתחותיים בעובר אינם מושפעים על ידי ההרכבה וניתן דמיינו בצורה אופטימלית באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור. בדוגמא זו, אנו צילמו את הדגימה מעל במהלך שעות 12 (איור 4). אופייני צורת שינויים בעובר מוקדם, כגון התארכות הגוברת של החלמון והעיבוי של רקמות לאורך קו האמצע, יהיו מדוכאים בעת שימוש בהרכבה המסורתית ללא סיסי בagarose 1.5%. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" /> . איור 4 הדמיה של עובר דג הזברה המוקדם Tg (H2A: GFP). דג הזברה 14 עוברת עובר מוקדם. GFP נרגש גיליון אור הלייזר 488 ננומטר ואות הקרינה זוהועם מטרת W 10X/0.3 ומצלמה EMCCD. Z-ערימות משתי זוויות נרכשו כל 3 דקות במהלך של שעות 12. תחזיות בעוצמה מקסימלית מנורמלות של קבוצת משנה של הזמן לשגות מוצגות. טשטוש גלוי תנועה ב19 תוצאות hpf מהרעד העובר במהלך רכישה, שכן אין הרדמה היו בשימוש. בר סולם:. 150 מיקרומטר <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish at JoVE.com

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

ההתפתחות של דג הזברה יכולה להיות אחרי על פני ימים עם מיקרוסקופיה גיליון אור כאשר עוברים מוטבעות בצינורות פולימר ברורים אופטי עם agarose ריכוז נמוך.

רב שכבתי וההרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך של דג הזברה

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

multilayer-mounting-for-long-term-light-sheet-microscopy-of-zebrafish

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

18.7K Views.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics.  ההתפתחות של דג הזברה יכולה להיות אחרי על פני ימים עם מיקרוסקופיה גיליון אור כאשר עוברים מוטבעות בצינורות פולימר ברורים אופטי עם agarose ריכוז נמוך. 

Video: Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Actually what I'm gonna do, mount it in here first and then swap out You. So now I'm gonna aspirate try and be as gentle as possible.Okay. A few seconds just holding.Okay.Alright.So the important features of our lifestyle imaging grid are that, so it's an inverted scope, which means the objective, the samples here in the objective is underneath. So the objective is pointing up and the whole scope, or practically the whole, practically the whole scope, including the objectives and the sample are at 37 degrees. So everything in this plastic box is at 37 degrees.And right on top of the stage we have an air and CO2 mix. That is 5%CO2. So the idea is that the sample is actually in a cell, it's like a cell incubator.And so we have, this is our mixer for the air and the CO2 and, and it gets humidified and heated and then piped onto the, the sample on the stage.Okay. And today we're just gonna be doing fluorescence one channel GFP fluorescence. This is the hose that the CO2 and 5%CO2 goes in and it just fits into the stage holder.That's important. And then we can close these, take these down, and then we go to our first position. And what I'm gonna do is go to the first field, which is my control sample, and I'll pick positions based on what I see on the screen.So I just make sure I actually look into the microscope in each new, well, because the focal plane for each of the wells is different, the, the dish is not perfectly flat on the bottom. So you will need to make fine adjustments when you move from well to the well. So right now I'm on the first, well, what I'll do is I'll focus, so I just hit, I just told, I just turned on the light, the transmitted light for the microscope.And I have make sure all the light is going to the eye pieces. And so I just look in, make sure I get a nice clean field. And then what I'll do is turn that light off, turn the fluorescence light on, make sure the cells that I'm looking at look healthy and they're not apoptotic.And, and I turn that off. And what I do next is send, so now I'm gonna start picking positions, which means I have to te send the light path to the camera. This is the camera right here.So I tell the microscope to send all the camera, they don't see anything in the eye pieces. What I'll do is in the software controlling the microscope, I'll choose the right filter set, which for our purposes is psy. And then set an exposure time.And I know these cells very well and I know that they take a 0.2 second exposure time. So I tell, that's what I tell the software to do. And what I'll do is hit focus.This is, and it's basically just alive. The, A light will turn on and you can, oh, I don't know if you can see cells, but the reason this is a good field is because there's, all the cells are, even in terms of their fluorescence, There are no apoptotic cells. Apoptotic cells tend to be very bright and there's no dirt or schmutz in the field.And you can see that they're actually, this is a metaphase cell and that's a metaphase cell, that's a cell that's probably just exited mitosis. And I can just tell that because it looks like those are, those two sets of chromatin are very nicely oriented to each other. Like they just exited an face.So that's a good field. So, and now that I know that the exposure time and the filter set is correct, and this is gonna be software specific, I'll go and I'll take positions and now the software has memorized the X, Y, Z position of that field. And then when I do pick another field, it's, and I'll, so when I'm picking, when I'm picking new fields, but in the same, well, I'll use the, I'll move the i'll, I'll turn the shutter, I'll open the shutter and I'll look to see what I see on the screen and I'll pick fields based on that versus looking in the field.So I don't see any of my tonics in there. But again, even nicely centered, these cells will go through my PS I continue, here's a good example. Here's a good example of what I would avoid that, see how bright that is?That's very bright. That's probably remnants of an apoptotic cell. And the reason I would avoid that is because since it's so bright, when the software auto focuses, it will autofocus just on that and it won't be in the same plane as all these other cells.And so I won't get any information from that field. That looks nice. There's a, this is a pro metaphase right here, That's A metaphase.So, and I'm gonna take three positions per well. So that was three positions and now I'm going to go to my next Well, so you can, so what I will probably do is take images every 10 minutes. So it's a compromise.Lifestyle imaging is always a compromise, right? You have to image, you have to keep the cells healthy, especially if you're interested in mitosis. So you have to minimize their exposure to the fluorescent line.And, but you wanna get information. So you have to take images, you have to, so you have to compromise, you have to make a choice about what you want to capture, what kind of information you wanna capture. For our purposes, mitosis tends to take about an hour.So if we're taking 10 minute intervals, that's pretty good. We see prophase, we see metaphase, we see anaphase, and we can, we can see when there are, there are treatments or drugs or siRNAs that affect those specific cell cycle stages. So for our purposes, that's enough, but we always want more.We always want more positions or finer time and interval or something like that. So it's a compromise. So, and then I'll hit start.And so our software, it does an autofocusing pass on the first pass. So once I hit start, it should start auto autofocusing and you'll see the shutter open, open and close between auto focusing. So I'll hit start.So that's the shutter opening and closing. The Z motor is engaging and it's actually trying to find the plane with the most contrast, which will be the most in focus. You can actually see on the screen going in and out of finding the best plane of focus that might be worrisome.So what it does is it, it drives the Z motor to find the best, the most in focus plane focus, well the most in image. And then it acquires picture there and then it learns that Z position. And then we'll use that Z position for the next 12 passes.And then we'll do the auto focusing pass again. What Kind of experiments do they do? Okay, so our lab is mostly interested in understanding what regulates mitic progression, or at least I'm most interested in understanding that.So with live cell imaging and especially our multi position, long-term imaging scope, you can take, you can film cells for two or three days entering anding mitosis, and you can image multiple rounds of mitosis so you can understand. And then you can put drugs or RNAs or any kind of perturbations on the cells that you would like to study. So you can understand how, how those drugs or, or genes are, are important in regulating mitotic progression.Because it's not fixed cell work and live cell work, you can understand what, when you need to have a perturbation to affect mitosis or what stage of mitosis is affected. So it's really powerful in that respect. What, what are the main technical elements of this experiments?What are the possible problems? Well, the biggest problem besides getting the rig set up, getting the rig set up is not trivial. A lot of people have the rig, but just making sure it works well for your application.The financial element is not, you know, is not small. So there's the setting up of the apparatus and then, and then once you gather the data, there's a real data analysis issue. It takes these movie, if, so, if you're gathering 40 movies each with 30 cells, so you have 40 in 40 fields that you just filmed and each of those fields has 30 cells, then you have to sit down with each one of those movies and look at each one of those cells in that movie.So it takes a really long time to do data analysis. And that's, so it takes a week to analyze data that it took you two days to collect. So there's a, that's a very big obstacle in terms of gathering lots of data.So it's not, while it's high throughput data collection, it's not high throughput analysis. So what would you make to make this experiment really high throughput? So our lab is in the process of developing a program that does the data analysis automatically.And it's a pretty decent program. It's not perfect. The human eye is always better, but it's getting there.So What are the interesting application of this experiment? Maybe other fields you can mention? Besides cell division?You mean for the, oh, for the live cell imaging? Yes.Well, you can do cell motility assays. You can, depending on the, the microscopy that's involved, you can, you know, look at how cells, you could look at tumor development if you really wanted to.But there, you, you're, if as long as you have the right imaging set up, you can, you're pretty much not limited in terms of anything. Our scope happens to be just a wide field and we use 20 by 20 x objective. So it's a pretty low resolution set up, but that's sufficient for what we need to see.So there are, but there definitely aren't, you wouldn't be limited. Anything that has any dynamic kind of experiment, which is biology, it would be, would really benefit from lifestyle imaging. So calcium imaging, although you couldn't do it on our apparatus, that's a live cell.You definitely need live cell imaging for that. Like I said, patient assays, motility assays, those kinds of things would really benefit from live cell imaging. Would you like to tell a few words about your previous experience?How long do you work on these techniques? What do you you work on before? Wow.So in my PhD I didn't work.I did a lot of confocal microscopy, but no lifestyle imaging. And so during my postdoc I was, I helped Dr.King get this apparatus that, that we just used to set up these fragment, get that up and running. And, and so during my postdoc, I had a lot of experience with both widefield with TimeLapse imaging on our scope, which is the widefield and also TimeLapse imaging with confocal microscopy.And I would say that it's really powerful. You get a lot of information, but it's not easy to get working perfectly. So it really requires a lot of attention and a lot of attention to details at every little step of the process.And, and then you still have problems. So it's a tough application, but you can really get, if, if it's what you need to have to, to study your problem, your scientific problem, then it, it's invaluable in that respect, but it's tough. So find someone who knows what they're doing and use them.That's my advice. So good.

לטווח ארוך הדמיה בתאי יונקים באמצעות מיקרוסקופית שדה רחב

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

יישום של שרף אור נרפא, דבק שיניים אלקטרודות הרכבה או בדיקות Microdialysis בניסויים כרונית

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Developmental Biology

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

הכנת תסיסנית תאים S2 עבור במיקרוסקופ אור

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

<meta charset="utf8"></head><body>פרוטוקול מיקרוסקופיה מרובת תצוגות מעודנת עבור עוברים של דגי זברה

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר Spotlight: אסטרטגיות להרכבת עוברים של דגי זברה עבור מיקרוסקופ גיליון אור מרובה תצוגות ברזולוציה גבוהה — טכניקות להדמיה ושחזור תמונה

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.

רב שכבתי וההרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך של דג הזברה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

לטווח ארוך הדמיה בתאי יונקים באמצעות מיקרוסקופית שדה רחב

יישום של שרף אור נרפא, דבק שיניים אלקטרודות הרכבה או בדיקות Microdialysis בניסויים כרונית

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

הכנת תסיסנית תאים S2 עבור במיקרוסקופ אור

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

מיקרוסקופיה קלה של דינמיקת לב מהירה בעוברי דגי זברה