עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (U54CA143906 לKGP, OJTM וR01HL101972 לOJTM) וקרן מחקר רפואית אורגון פרס חוקר מוקדם קליני (KGP). OJTM הוא חוקר של איגוד לב האמריקאי שהוקם (13EIA12630000). אנו מודים לד&quot;ר אריק אנדרסון של אביר מכון הסרטן להכנת דגימות תאים המשמשות בעבודה זו.

1. מפרט מיקרוסקופ כדי לבצע את ההדמיה בצורה הנכונה את המיקרוסקופ צריך את המפרט הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש גם התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) וbrightfield ניגוד (BF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש תנועת Z-ציר מבוקרת מחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש תחנת צמצם מתכוונן להשתנות הצמצם מספרי עדשת הקבל. צמצם עם שלטון מדורג או קריאת נתונים אלקטרוניים נדרש לדעת את הערך של הצמצם המספרי. הצמצם המספרי צריך לנוע בין 0.1 לNIQPM עד 0.9 (או יותר) לHTDIC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ צריך מסנן צבע פס צר כדי להיות מנוצל עבור הדמיה בתחום בהירה. מסנן זה נדרש על מנת לתקן את התוספת השבירה, facture אורך גל תלוי המשמש להמרת שלב לצפיפות מסה לNIQP. </li></ol> 2. התערבות ההפרש לעומת זאת רכישת Z-מחסנית (DIC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת SlideBooknd ליצור שקופית חדשה לאוסף תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, לפתוח את חלון הפוקוס. תחת סעיף סט סינון, בחר דסק&quot;ש. בכרטיסייה היקף, תחת סעיף הקבל, להתאים את סרגל שקופיות צמצם לעמדה הימנית הרחוקה (לפתוח את כל הדרך). זה מספק תאורת צמצם מספרית גבוהה ומשפר את חתך אופטי של הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס על המדגם באמצעות מטרת דסק&quot;ש. התאם את עוצמת מנורת הלוגן עד המדגם הוא לעין בקלות. כדי להבטיח שהמצלמה לא להיות רוויה, בחר בכרטיסייה המצלמה בחלון הפוקוס ולבדוק כי היסטוגרמה של עוצמות פיקסל נמצאת בטווח הדינמי של המצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את החלון לכידת תמונה. במקטע סוג לכידת, סמן את תיבת 3D. בסעיף לכידת 3D, בחר את טווח סביב מרכז וחזור למיקום הנוכחי </strong&gt; תיבות ולציין את טווח Z-הכיוון, מספר המטוסים, וגודל צעד. טווח Z-הכיוון צריך לשלב את המדגם כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקטע הגדר סינון של החלון לכידת תמונה, סמן את תיבת דסק&quot;ש ולציין זמן חשיפה. במקטע פרטי תמונה, שם תמונה (אופציונלית), ובחר התחל ליזום ההדמיה. </li></ol> 3. שדה מואר (BF) רכישת Z-מחסנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע מיקרוסקופ סיים איסוף Z-מחסנית דסק&quot;ש של המדגם, פתח את חלון הפוקוס ובחר פתיחה תחת סעיף הסט המסנן. התאם את המחוון צמצם למצב הרחוק משמאל (סגר את כל הדרך) כדי לספק תאורת NA נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את מסנן אור נתיב מיקרוסקופ כדי ירוק. התאם את עוצמת מנורת הלוגן עד המדגם הוא גלוי לעין. להבטיח שאין רוויה של המצלמה על ידי בחירה <strong&gt; כרטיסיית מצלמה בחלון הפוקוס ובדיקה שהיסטוגרמה של עוצמות פיקסל היא בטווח שצוין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את החלון לכידת תמונה. ההגדרות לכידת 3D מרכישת Z-מחסנית דסק&quot;ש יוצגו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקטע הגדר סינון של החלון לכידת תמונה, סמן את התיבה הפתוחה ולציין את זמן חשיפה. במקטע פרטי תמונה, שם תמונה (אופציונלית), ובחר התחל ליזום רכישת תמונת Z-מחסנית. </li></ol> 4. יצוא Z-מחסנית תמונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח לכידת Z-מחסנית. לשנות את התצוגה ל100%. התאם את היסטוגרמה של ערכי פיקסל שיוצג בין 0 לבין ערך פיקסל המקסימאלי של המצלמה (4,095 ל12 מצלמות קצת, 65,535 ל16 קצת.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר סדרת תצוגה&gt; יצוא&gt; TIFF. זו תייצא את Z-המחסנית כסדרה של תמונות TIFF(אחד לכל מטוס Z). שמור את סדרת TIFF בתיקייה נפרדת עם שם שיש לו קו תחתון בסוף (כלומר &quot;סטאק 1_ דסק&quot;ש&quot;). חזור על פעולה זו עם כל דסק&quot;ש או BF Z-מחסנית. </li></ol> 5. מדידות נפח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תכנית HTDIC MATLAB שכותרתו &quot;JoVE_HTDIC_v1.m&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפי סעיף 0 של תכנית HTDIC, לעדכן את משתנה ספריית תלות. העתק והדבק את הספרייה המכילה את hilbert_transform_dic.m וקבצי sobel_edge_detect.m מExplorer (PC) שבבין הגרשיים בודדים הבאים &quot;dependencies_directory =&quot;. ExecuteSection 0 של תכנית JoVE_HTDIC_v1.m. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסעיף 1, עדכן את &quot;images_directory&quot;. שוב, להעתיק ולהדביק את הספרייה המכילה את התמונות באמצעות פוקוס ב. צורת tif בין המרכאות בודדות. רק לרוץ סעיף 1 פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישור וסיבוב של תמונות להילברט להפוך הפעלת סעיף 2 לקוד. תיבת הדו שיח שכותרתו &quot;הגדרת פרמטרי HTDIC&quot; תופיע. חמישה numbers נדרש מהמשתמש: מספר מטוס המוקד שבו תמונת DIC של המדגם היא בפוקוס, ברזולוציה לרוחב (מיקרומטר / פיקסל בתמונה), ברזולוציה צירית (זה 0.1 לרכישת תמונה ב0.1 מיקרומטר צעדים צירי), זווית הסיבוב של תמונת דסק&quot;ש דרושה כדי לבצע את הילברט לשנות, ערכים אופייניים הם 45 ו-135. לבסוף, להיכנס לאזור בגודל ריבית, פרמטר זה מגדיר את אורכו של הצד השני של תיבה שלאחר מכן תופיע - ערך טיפוסי הוא 400. לחץ על אישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה של מטוס מוקד דסק&quot;ש צוין במספר מישור המוקד תופיע עם קופסא כחולה. מקם את התיבה על התכונה של עניין, לדוגמא: תא. התיבה לא צריכה להיות מרובעת. לאחר שהתיבה כבר ממוקמת מעל האזור הרצוי, לחץ לחיצה כפולה בתוך הקופסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתון נוסף יופיע כעת: נתון זה מכיל תמונה חתוכה ומסובבת של האזור של העניין בחר בשלב הקודם. הניגודיות של התמונה צריכה להיות כזהתכונות שכהות מופיעות בצד השמאל ואילו תכונות בהירות מופיעות בצד הימין. גרור את התיבה הכחולה מעל האזור של עניין, לעצב מחדש לפי צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף 3 יוצר מסכה לקוביית Z-המחסנית. ישנם שני סוגים של מסכות זמינות: מסכה מלבנית כדי ליצור מלבן מסביב לתא ויד חופשית כלי להתוות את התא של עניין ביד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור מסכה מלבנית, קו uncomment 167 וקו התגובה 170 (הערה את קו על ידי הנחת &quot;%&quot; בתחילת השורה). ביצוע סעיף 3 לתכנית. לחץ בתמונה וגרור את העכבר כדי להתחיל להגדיר את המסכה מלבנית. לחץ לחיצה כפולה על התיבה כדי לקבל את זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור מסכה המצוירת ביד, קו התגובה 167 וקו uncomment 170 ולבצע סעיף 3. לחץ ולצייר את המסכה הרצויה עם העכבר. לחץ לחיצה כפולה על המסכה לקבל אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף הפעל 4to לבנות הילברט הפך ערימת תמונת DIC וערימת תמונת DIC המקבילה של השטח של עניין.המסכה שנבנתה בסעיף 3 תחול על הילברט להפוך ערימת דסק&quot;ש וערימת דסק&quot;ש הרגילה כאשר &quot;maskON&quot; מוגדרת 1 בשורה 179. הגדרה &quot;maskON&quot; ל0 יהיה לבנות ערימות תמונה מבלי להחיל את המסכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל סעיף 5 כדי לייעל את פילוח התמונה של תמונות חתך רוחב XZ של האזור של עניין. איור 500, המיוצר על ידי התכנית, מופיע בו מוצגות שלושה סוגים שונים של ניגוד. ההצלחה של האלגוריתם כדי למצוא את הגבולות של התא היא סומך על שילוב של המסכה המשמשת ואת הערך של &quot;סף&quot; בשורה 229 של התכנית. תתחיל עם ערך של 0.5. התאם את הערך של סף ולהפעיל מחדש את החלק הזה של התכנית עד לגיבוש הנכון מושגת באחד העמודים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הגיבוש היה הטוב ביותר בטור 1, השתמש בסעיף 6 כדי לקבוע את עוצמת הקול באמצעות פילוח תמונת DIC. אם העמודה 2 נתנה תוצאות אופטימליות, להפעיל סעיף 7 כדי לקבוע נפח תא מדימויי דסק&quot;ש שינו-הילברט. אם עמודת 3 גבדואר התוצאות אופטימליות, סעיף 8 להפעיל כדי לקבוע עוצמת קול באמצעות מסונן פורייה דימויי דסק&quot;ש שינו-הילברט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנפח הנמדד של המדגם, דיווח במיקרומטר מעוקב (FL) מוצג בכותרת של 600 איור, 700, או 800 המיוצרת על ידי את התכנית בהתאם למדידת נפח נבחרה. </li></ol> 6. מדידות מסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תכנית NIQPM MATLAB שכותרתו &quot;JoVE_NIQPM_v1.m&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפי סעיף 0 של תכנית NIQPM, לעדכן את המיקום של שלוש ספריות הדרושות כדי להפעיל את התכנית. אלה הם &quot;dependencies_directory&quot;, &quot;brightfield_directory,&quot; ואת &quot;dic_directory&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להפעיל סעיף 1. חלק זה של קוד יוצר קוביית תמונת שדה בהירה של השדה המלא של כל הסט של תמונות. רק לרוץ סעיף 1 פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להפעיל סעיף 2. תיבת הדו שיח שכותרתו &quot;הגדרת פרמטרי NIQPM&quot; תופיע. ארבעה מספרים נדרשים מהמשתמש: מספר מטוס המוקד שבו התמונה של השדה הבהירמדגם הוא בפוקוס, ברזולוציה לרוחב (מיקרומטר / פיקסל בתמונה), ברזולוציה צירית (זה 0.1 לרכישת תמונה ב0.1 מיקרומטר צעדים צירי), ובאזור של גודל ריבית, פרמטר זה מגדיר את אורכו של צד של תיבה שלאחר מכן תופיע - ערך טיפוסי היא 200. לחץ על אישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה של מטוס מוקד השדה הבהיר שצוין במספר מישור המוקד תופיע עם קופסא כחולה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התמונה לא בפוקוס, לחיצה כפולה בקופסא הכחולה וסעיף 2 בשידור חוזר, כדי להיות בטוחה כדי להתאים את מספר מטוס המוקד בתיבת הדו שיח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התמונה היא בפוקוס, גרור את התיבה הכחולה מסביב לתמונה ולשנות את גודלו על ידי בחירת צמתים של התיבה וגרירתם במידת צורך. מקם את התיבה סביב התכונה של עניין, לדוגמא: תא. התיבה לא צריכה להיות מרובעת. לחץ לחיצה כפולה בתוך הקופסה כדי לקבל את זה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להפעיל סעיף 3 לבניית ערימה של תמונות שדה בהירות קצוץ לאזור בterest. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפקת מפת השלב, תמונת DIC פסאודו, והשוואות להדמיה בתחום בהירה ותמונת DIC הנכון, להפעיל את הסעיף 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם פסאודו דסק&quot;ש ותמונות דסק&quot;ש אמיתיים דומות ככל האפשר את מפת צפיפות מסה, מסה כוללת, והיסטוגרמה של צפיפות התאים ניתן לקבוע על ידי הפעלת סעיף 5 א או 5 ב. סעיף 5 א מבצע את זיהוי דייר אוטומטי של שדה - &quot;הסף&quot; מטב בשורה 300 - ערכים אופייניים נעים בין 0.1-1. שידור חוזר סעיף זה כנדרש כדי למטב את ערכו של סף. סעיף 5 ב מבצעים נחישות המונית, וכו &#39;לאחר שהמשתמש מתאר את התא של עניין. </li></ol>

<ol>
	<li>Zernike, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Das+Phasenkontrastverfahren+bei+der+mikroskopischen+Beobachtung.">Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung.</a> Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).</li><li>Zernike, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+contrast,+a+new+method+for+the+microscopic+observation+of+transparent+objects.">Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects.</a> Physica. 9 (42), 974-986 (1942).</li><li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+Phase.">Finding Phase.</a> Nat. Cell Biol. 11, (2009).</li><li>Smith, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).</li><li>Nomarski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinterf&#233;rom&#232;tre+diff&#233;rentiel+&#224;+ondes+polaris&#233;es.">Microinterf&#233;rom&#232;tre diff&#233;rentiel &#224; ondes polaris&#233;es.</a> J. Phys. Radium. 16, (1955).</li><li>Lang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomarski+differential-interference+contrast+microscopy.">Nomarski differential-interference contrast microscopy.</a> Zeiss Inform. 70, 114-120 (1968).</li><li>Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-enhanced+contrast,+differential+interference+contrast+(VEC-DIC)+microscopy:+a+new+method+capable+of+analyzing+microtubule-related+motility+in+the+reticulopodial+network+of+Allogromia+laticollaris.">Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris.</a> Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).</li><li>Inou&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+image+processing+greatly+enhances+contrast,+quality,+and+speed+in+polarization-based+microscopy.">Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy.</a> J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).</li><li>Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+shape+change+and+spreading.">Platelet shape change and spreading.</a> Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).</li><li>Barer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+microscopy+and+mass+determination.">Interference microscopy and mass determination.</a> Nature. 169, 366-367 (1038).</li><li>Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractometry+of+living+cells.">Refractometry of living cells.</a> Nature. 171, 720-724 (1953).</li><li>Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+development+and+experimental+evaluation+of+imaging+models+for+differential+interference+contrast+microscopy.">Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).</li><li>Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+phase+imaging+using+differential+interference+contrast+microscopy.">Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy.</a> J. Microsc. 214, 7-12 (2004).</li><li>Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+optical+pathlength+distributions+from+images+obtained+by+a+wide&#8208;field+differential+interference+contrast+microscope.">Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide&#8208;field differential interference contrast microscope.</a> J. Microsc. 188, 149-157 (1997).</li><li>Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport-of-intensity+approach+to+differential+interference+contrast+(TI-DIC)+microscopy+for+quantitative+phase+imaging.">Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging.</a> Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).</li><li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scattering-phase+theorem:+anomalous+diffraction+by+forward-peaked+scattering+media.">Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media.</a> Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).</li><li>Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Carr&#233;+differential+interference+contrast+microscopy+to+assess+phase+and+amplitude.">Quantitative Carr&#233; differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).</li><li>Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+optical+phase+microscopy.">Quantitative optical phase microscopy.</a> Opt. Lett. 23, 817-819 (1998).</li><li>Paganin, D., Nugent, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-interferometric+phase+imaging+with+partially+coherent+light.">Non-interferometric phase imaging with partially coherent light.</a> Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).</li><li>Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. o. n. -. i. n. t. e. r. f. e. r. o. m. e. t. r. i. c. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=non-iterative+phase+retrieval+by+Green&#8217;s+functions.">non-iterative phase retrieval by Green&#8217;s functions.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).</li><li>Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+quantification+of+cellular+mass,+volume,+and+density+of+circulating+tumor+cells+identified+in+an+ovarian+cancer+patient.">Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient.</a> Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).</li><li>Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+single+cell+refractive+index,+dry+mass,+volume,+and+density+using+a+transillumination+microscope.">Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).</li><li>Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+index+maps+and+membrane+dynamics+of+human+red+blood+cells+parasitized+by+Plasmodium+falciparum.">Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum.</a> , 105-13730 (2008).</li><li>Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurement+of+cycle-dependent+cell+growth.">Optical measurement of cycle-dependent cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).</li><li>Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurement+of+cell+membrane+tension.">Optical measurement of cell membrane tension.</a> Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).</li><li>Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffraction+phase+microscopy+for+quantifying+cell+structure+and+dynamics.">Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics.</a> Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).</li><li>Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+phase+microscopy.">Tomographic phase microscopy.</a> Nat. Methods. 4 (9), 717-719 (2007).</li><li>Charri&#232;re, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+refractive+index+tomography+by+digital+holographic+microscopy.">Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy.</a> Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).</li><li>Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral-domain+optical+coherence+phase+microscopy+for+quantitative+phase-contrast+imaging.">Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging.</a> Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).</li><li>Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+light+interference+microscopy.">Spatial light interference microscopy.</a> SLIM). Opt. Exp. 19, 1016-1026 (2011).</li><li>Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hilbert+phase+microscopy+for+investigating+fast+dynamics+in+transparent+systems.">Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems.</a> Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).</li><li>Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-interference-channel+quantitative-phase+microscopy+of+live+cell+dynamics.">Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics.</a> Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).</li><li>Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics.">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).</li><li>Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Hilbert+transform+for+3D+visualization+of+differential+interference+contrast+microscope+images.">Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images.</a> J. Microsc. 199, 79-84 (2001).</li><li>Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+label-free+imaging+technique+for+the+quantification+of+thrombus+formation.">Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).</li></ol>

יש המחברים אין אינטרסים כלכליים בעבודה שהוצגה.

באופן כללי, NIQPM היא טכניקה עקיפה מוגבל תוקף על נתיב אורכים אופטיים הנעים 0.25-44.7. אימות בוצעה על n = 1.596 תחומים קלקר הנעים בקוטר .11-9.8 מיקרומטר המושעה בFluoromount G (מידע לא מוצגים). תאים בעלי נתיב אורכים אופטיים הנעים בין כמעט 0-7. כאשר מודד את...

השימוש במיקרוסקופ אופטי הוא בכל מקום בחקירה של אורגניזמים סלולריים עכשיו. בשל מאפייניהם נמוכים אנדוגני הספיגה ופיזור חלש על פני הספקטרום האופטי לעין, תאים אינם בתוקף להשפיע על המשרעת של גלים אופטיים חוצים אותם ובכך מופיעים שקוף למחצה כאשר צילמו עם מיקרוסקופים שדה בהיר סטנדרטיים. דגימות נייד, לעומת זאת, להאט את הגלים אופטיים נסיעה דרכם באופן שקשור באופן ליניארי לכמות צפיפות מסה המקומית באזור מסוים של מרחב שדרכו האור עובר. ניצול של הפיגור הזה הטרוגנית זמן או פרופיל &quot;שלב&quot; של גלים אופטיים מועברים באמצעות דגימות מיקרוסקופיות תואר לראשונה בשנת 1935 ידי פריץ Zernike 1 והבין באופן ניסיוני על ידי Zernikein 1942 2. Zernike זכה בפרס נובל ב -1953 להישג זה. Zeiss ממוסחר שיטה זו בשנת 1945 3. ב1955, סמית וNomarskהייתי להציג את עבודתם הראשונית בשימוש 4 והתאוריה 5 של התערבות ההפרש לעומת זאת מיקרוסקופיה (DIC), שיטה המשתמשת בשיפוע המרחבי של שלב כמנגנון הניגודיות. דסק&quot;ש היה ממוסחר על ידי Zeiss ב1965in שיתוף פעולה הדוק עם Nomarski 6. ב1981, שתי מעבדות הפגינו הדימויים הראשונים נרשמו תא חי דסק&quot;ש עם שילוב של מצלמות וידאו לתוך רכבת האופטיקה של המיקרוסקופ דסק&quot;ש 7, 8. העידן של הדמיה תא חי נולד. מאז הפעם, הביצוע של שניהם בניגוד השלב ודסק&quot;ש במיקרוסקופים מסחריים היה ללא שינוי במידה רבה. שיטות אלה מנוצלים בעיקר על ידי ביולוגים כדי להפיק תמונות של תאים למטרות איכותיות: ניטור של מורפולוגיה, מעקב של מבני subcellular, וחקירות של דינמיקת קרום 9. טכניקות אלו הן איכותיות בתצורה שלהם &quot;ה-off-המדף&quot; כשתי שלב וDIתמונות C הן פונקציות שרירותיות של עוצמת מקור האור, אופטיקה הגדרות תאורה, ועלייה במצלמת CCD, גמא, והגדרות חשיפה. לגיון קטן של פיסיקאים ומהנדסים אופטיים השתדל להפוך את שיטות הדמיה מסחריות כמותית. בין המאמצים הראשונים היו שני מכתבים לטבע ב1952 ו1953 שברופא שהפך biophysicist רוברט Barer הפגין את השימוש במיקרוסקופ שלב לקביעת מסה יבשה סלולרית של תאים על ידי אומדן שלב משמרות באמצעות סוגים אלה תא באמצעות מיקרוסקופ שלב זמין מסחרי 10, 11. השדה פיתח מספר רב של טכניקות במהלך השנים שלאחר מכן התבססו סביב שלושה מנגנונים בסיסיים ללא תווית ניגוד: מיקרוסקופיה שלב 10,11, מיקרוסקופיה DIC 12-17, ושדה בהיר 18-22 כדי לקבוע אופטית נתיב באורך, שלב, מסה צפיפות, מקדם שבירה, ונפח תא. בפסקהllel, אוסף גדול של מכשירים אופטיים מותאמים אישית יש גם פותחו מאז 1950s, והפך את מרחיקת לכת מדידות אופטיות הנעות בין יישומים בצמיחת טפיל 23, לתיעוד מחזור 24 התא לחקירת דינמיקת קרום של תאי דם אדומים 25. בפרט, בעשר השנים האחרונות ראו שפע של מיקרוסקופיה כמותית ללא תווית בצורת מיקרוסקופית שלב עקיפה 26, מיקרוסקופיה שלב טומוגרפית 27, מיקרוסקופיה הולוגרפית הדיגיטלית 28, מיקרוסקופיה קוהרנטיות אופטית רגישה שלב 29, מיקרוסקופיה הפרעות אור מרחבי 30, הילברט שלב 31 במיקרוסקופיה, ומיקרוסקופיה שלב הכמותי 32. למרות ההצלחות הקולקטיביות שלהם, מכשירים אלו לא היו מופצים לשדה הגדול יותר של חוקרים ביולוגיים בשל, בעיקר, למכשור המורכב שלהם ודרישות חישובית. במסמך זה אנו דescribe השימוש במיקרוסקופ אופטי סטנדרטי לבצע מדידות כמותיות של מסה, נפח וצפיפות על דגימות סלולריות באמצעות שילוב של שדה בהיר ודימויים דסק&quot;ש. שתי גישות עיקריות מוצגות: מיקרוסקופיה השלב הכמותי noninterferometric (NIQPM), כדי לבצע מדידות של מסת תא מוחלטת והפצת צפיפות subcellular, והילברט להפוך מיקרוסקופיה התערבות ההפרש לעומת זאת (HTDIC), כדי לקבוע את עוצמת קול. היתרונות העיקריים של NIQPM וHTDIC שכבו בנגישות הטכנולוגית שלהם. תנאי ההדמיה הנדרשים לביצוע המוצלח שלהם במסגרת פעולה הרגילה של רוב המיקרוסקופים זמינים מסחרי. בנוסף, האלגוריתמים שלאחר העיבוד הם יציבים, מהירים, וחזקים - שיושם בMATLAB באמצעות פורייה מהיר להפוך אלגוריתמים מבוססים (FFT) בכל ההזדמנות אפשרית. NIQPM היא שיטה לשחזר שלב וצפיפות המסה המשולבת axially של celדגימות lular מדימויי שדה בהירים. סיכום של צפיפות מסה משולבת axially זה על פני השטח של הדגימה נותן תוכן המסה היבש הכולל של הדגימה. פרוטוקול NIQPM מבוסס על היסודות שהונחו על ידי הניסיוניים Paganin ו18 נוג&#39;נט, 19 - שבו הוכיח כי פרופיל השלב של תא יכול להיות משוחזר מדימויי שדה בהיר דרך הפוקוס של המדגם - והעבודה התיאורטית של פרנק , Altmeyer, ו20 רניקה - בפתרון המודלים גל הפרקסיאלית באופן מבוסס FFT יעיל. החיבור של שלב לצפיפות המסה היבשה מבוסס על העבודה על ידי 10 Barer, 11 ופופסקו 33. ניתן לקבל מידע נפחית מדימויי דסק&quot;ש באמצעות פוקוס בתנאי תאורת NA גבוהים המאפשרים חתך אופטי של הדגימה לאורך הציר האופטי. הילברט להפוך עיבוד על ערימות תמונת דסק&quot;ש משפר באופן משמעותיאלגוריתמי גילוי קצה ללוקליזציה של גבולות דגימה בשלושה ממדים על ידי הפרדת הערכים האפורים של עוצמת דגימה מאלה של הרקע. עבודה זו מקורו בArinson et al. 34 למרות שאנחנו הצגנו שני שיטות הסינון פורייה כדי לשפר את הניגודיות ושיטת גילוי קצה מבוססת סובל לניתוח נפח אוטומטי של המדגם. גם יש לנו תוקף HTDIC בעבר בתחומי קלקר החל בגודל גבול ההשתברות עד 20 מיקרומטר בקוטר 36. בעוד שני NIQPM וHTDIC הם מבחינה טכנולוגית נגישים בשל התפתחותם במיקרוסקופים מסחריים, השיטות מוגבלות ביסודה על ידי תצורת החומרה של המיקרוסקופים עצמם. המגבלות העיקריות של טכניקות אלה הן כפולה: זמן רכישת Z-מחסנית איטית בטווחים מסחריים, הנובע מתרגום של שלב המדגם כולו בניגוד לסתם העדשה האובייקטיבית, כיום מגביל את החקירה של תופעות מהר יותר מאשר בערך 1 מסגרת / דקה, ושנית, השפעות עקיפה להגביל את התועלת של NIQPM וHTDIC לאובייקטים הנעים בגודל 0.2 עד 10 ו20 מיקרומטר בקוטר, בהתאמה. לפיכך, את הדגימה ודינמיקת הזמן הקשור של ריבית חייבת לעמוד בגודל מסוים ואילוצים של זמן כדי לאפשר את השימוש בשיטות אלה על מכשירים טיפוסיים &quot;ה-off-המדף&quot;. בהתלהבות, רוב הדגימות סלולריות קבועות נחקרות בקלות עם שיטות אלה. סקירה של NIQPM ופרוטוקולי HTDIC ניתנת באיור 1. באיור 2 אנו מדגימים הדמיה באמצעות פוקוס אופטימלי והכי מוצלחת בתנאי תאורת NA הן נמוכים וגבוהים עבור שניהם בשדה בהיר ודימויים דסק&quot;ש. איורים 3 ו -4 להדגים את תלות הפרמטר של אלגוריתם NIQPM הדגשת מימושים מוצלחים ולא מוצלחים. <strong&gt; איור 5 מדגים את השלבים כרוכים באלגוריתם עיבוד התמונה HTDIC ומדגים את היישום האופטימלי של האלגוריתם כדי לקבוע נפח סלולארי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager 2 microscope</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>Axio Imager D2</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green filter (&#955; = 540 &#177; 25 nm)</td>
			<td>Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont</td>
			<td>D540/25x</td>
			<td>Green filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 5.5 software</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado</td>
			<td></td>
			<td>Image acquistion software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
			<td>Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN</td>
			<td>PS06N</td>
			<td>Polystyrene spheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech, Birmingham, Alabama</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative optical microscopy: measurement of cellular biophysical features with a standard optical microscope

אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופ אופטי סטנדרטי לבצע מדידות כמותיות של מסה, נפח וצפיפות על דגימות סלולריות באמצעות שילוב של שדה בהיר ודימויים התערבות ההפרש לעומת זאת. שתי גישות עיקריות מוצגות: מיקרוסקופיה השלב הכמותי noninterferometric (NIQPM), כדי לבצע מדידות של מסת תא מוחלטת והפצת צפיפות subcellular, והילברט להפוך מיקרוסקופיה התערבות ההפרש לעומת זאת (HTDIC) כדי לקבוע את עוצמת קול. NIQPM מבוסס על מודל פשוט יותר של התפשטות גל, כינה הקירוב הפרקסיאלית, עם שלוש הנחות יסוד: תאורת צמצם מספרי נמוך (NA), פיזור חלש, וקליטה חלשה של אור על ידי הדגימה. למרבה המזל, דגימות סלולריות בלא כתם לספק את ההנחות הללו ותאורת NA נמוכה מושגת בקלות על מיקרוסקופים מסחריים. HTDIC משמש כדי להשיג מידע נפחית מדימויי דסק&quot;ש באמצעות פוקוס תחת illumin NA הגבוהתנאי ation. תאורת NA גבוהה מאפשרת חתך משופר של הדגימה לאורך הציר האופטי. הילברט להפוך עיבוד על תמונת דסק&quot;ש ערימות משפר באופן משמעותי אלגוריתמי גילוי קצה ללוקליזציה של גבולות דגימה בשלושה ממדים על ידי הפרדת הערכים האפורים של עוצמת דגימה מאלה של הרקע. היתרונות העיקריים של NIQPM וHTDIC שכבו בנגישות הטכנולוגית שלהם באמצעות מיקרוסקופים &quot;ה-off-המדף&quot;. ישנן שתי מגבלות בסיסיות של שיטות אלה: זמן רכישת Z-מחסנית איטית בטווחים מסחריים כיום מבטל את החקירה של תופעות מהר יותר מאשר 1 מסגרת / דקה, ושנית, השפעות עקיפה להגביל את התועלת של NIQPM וHTDIC לאובייקטים מ0.2 עד 10 (NIQPM) ו20 מיקרומטר (HTDIC) בקוטר, בהתאמה. לפיכך, את דינמיקת הדגימה והזמן הקשורים אליו עניין לעמוד בגודל מסוים ואילוצים של זמן כדי לאפשר את השימוש בשיטות אלה. מרגש cellula, הקבוע ביותרדגימות r נחקרות בקלות עם שיטות אלה.

תאורת מדגם נכונה במהלך רכישת תמונה באמצעות פוקוס היא קריטית ליישום המוצלח של NIQPM אלגוריתמי HTDIC nd. באיור 2 אנו מדגימים תאורת NA נמוכה וגבוהה תחת שני דסק&quot;ש ולעומת זאת בשדה בהיר לכדור קלקר ושורת תאי אדנוקרצינומה המעי הגס האנושית SW620. איורים 2 א, 2 ג, ט 2, ו ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope at JoVE.com

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

מיקרוסקופיה אופטית כמותי: מדידה נייד Biophysical תכונות עם תקן מיקרוסקופ אופטי

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

quantitative-optical-microscopy-measurement-cellular-biophysical

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.5K Views.  Oregon Health & Science University, School of Medicine. We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Video: Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

הכנת מטריצות תלונה לכימות התכווצות נייד

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

Cre-P לקס גישה רקומבינציה לצורך זיהוי של Fusion Cell In vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

בסינתזת מבחנה של ריווח ילידים, סיבי קולגן וארך ריווח המגזרי

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל<em&gt; In vivo</em&gt; דימות אופטי

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

ססגוניות קרינת איתור עבור מיקרופלואידיקה אגל באמצעות סיבים אופטיים

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

משלוח הממברנה ממוקד על Encapsulated מטענים הידרופובי בנושאת Nanoparticle קריסטל נוזלת

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By replicating the imaging environment, costly animal experiments to validate a technique may be circumvented. Predicting and optimizing the performance of in vivo and ex vivo imaging techniques requires testing on samples that are optically similar to tissues of interest. Tissue-mimicking optical phantoms provide a standard for evaluation, characterization, or calibration of an optical system. Homogenous polymer optical tissue phantoms are widely used to mimic the optical properties of a specific tissue type within a narrow spectral range. Layered tissues, such as the epidermis and dermis, can be mimicked by simply stacking these homogenous slab phantoms. However, many in vivo imaging techniques are applied to more spatially complex tissue where three dimensional structures, such as blood vessels, airways, or tissue defects, can affect the performance of the imaging system. 
This protocol describes the fabrication of a tissue-mimicking phantom that incorporates three-dimensional structural complexity using material with optical properties of tissue. Look-up tables provide India ink and titanium dioxide recipes for optical absorption and scattering targets. Methods to characterize and tune the material optical properties are described. The phantom fabrication detailed in this article has an internal branching mock airway void; however, the technique can be broadly applied to other tissue or organ structures.

Optical tissue phantoms are essential tools for calibration and characterization of optical imaging systems and validation of theoretical models. This article details a method for phantom fabrication that includes replication of tissue optical properties and three-dimensional tissue structure.

ייצור ואפיון רקמות אופטי הפאנטומים המכיל למפלגות

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות לחקר הלב מאתר

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

ניצוח מספר מצבי הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה אחת

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

מיקרוסקופיה אופטית כמותי: מדידה נייד Biophysical תכונות עם תקן מיקרוסקופ אופטי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video