עבודה זו מומנה בחלקה על ידי קרן PhRMA ופרס מחקר ומלומד מאוניברסיטת מרילנד, קולג ' פארק. אנו מודים לפרופ' דארל אירווין על התמיכה בעבודה הראשונית שנערכה בהשלמת " בהנדסתsitu של microenvironment בלוטות הלימפה באמצעות הזרקה תוך-נודאלית של חלקיקי פולימר משחררי אדג'ובנט". 5

כל המחקרים בבעלי חיים בפרוטוקול זה הושלמו בהתאם להנחיות הפדרליות, המדינתיות והמקומיות, ובאמצעות פרוטוקולים שנבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מרילנד (IACUC).
1. סינתזה של מיקרו וננו-חלקיקים מיוצבות שומנים
<ol><li>בבקבוקון זכוכית 7 מ"ל(ים), לשלב DOPC, DSPE-PEG, ושומנים DOTAP ביחס טוחנת 60:20:20 להכין תערובת שומנים הורים.<ol>
<li>כדי לסנתז מדגם יחיד: העבר 242.9 μl, 287.4 μl, ו 71.9 μl, של DOPC, DSPE-PEG, ו DOTAP בהתאמה, לתוך הבקבוקון באמצעות 2 מיליליטר זכוכית פיפטות סרולוגיות.</li>
		<li>כדי לסנתז דגימות מרובות: להכפיל כל נפח השומנים לעיל על ידי מספר הדגימות ולשלב לתוך בקבוקון אחד, ולאחר מכן להעביר aliquots שווה של תערובת שומנים זה לתוך בקבוקונים המתאימים לכל מדגם כדי להיות מוכן.</li>
		<li>שומנים יבשים תחת זרם עדין של גז חנקן במשך 10 דקות, או מקום בתנור ואקום לילה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בבקבוקון זכוכית יחיד, ריק 20 מ"ל, להמיס 80 מ"ג של PLGA ב 5 מ"ל של dichloromethane עבור כל מדגם חלקיקים כדי ליצור פתרון 16 מ"ג / מ"ל מלאי פולימר.</li>
	<li>מוסיפים 5 מ"ל של תמיסת פולימר לבקבוקונים המכילים שומנים מיובשים, כובע ומערבולת למשך 30 שניות.</li>
	<li>לסנתז מיקרו-חלקיקים:<ol>
<li>התחל sonicating השלב האורגני המכיל פולימר, שומנים, ומטען מסיס במים אחרים על קרח ב 12 W באמצעות sonicator.</li>
		<li>צור את תחליב המים בשמן (w/o) באמצעות פיפטה כדי להוסיף 500 μl של H2O מזוקק, או H2O המכיל 1 מ"ג של פפטיד, חלבון, או מטען מסיס במים אחרים.</li>
		<li>המשך sonicating במשך 30 שניות ב 12 W על קרח, בעדינות נדנדה הבקבוקון למעלה ולמטה מצד לצד סביב קצה sonicator כדי להבטיח אמולסיה מלאה.</li>
		<li>צור את אמולסיה מים בשמן במים (w / o / w) על ידי שפיכת אמולסיה w / o לתוך 40 מל של H2O ב 150 מל.</li>
		<li>הומוגניזציה במשך 3 דקות ב 16,000 סל"ד באמצעות הומוגניזר דיגיטלי.</li>
		<li>מוסיפים מוט ערבוב מגנטי, מעבירים את הכף לצלחת ערבוב, ומאפשרים לאמולסיה w/o/w לבחוש בן לילה כדי להסיר את הממס העודף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לסנתז חלקיקים:<ol>
<li>התחל sonicating השלב האורגני המכיל פולימר, שומנים, ומטען מסיסים אחרים על הקרח ב 14 W.</li>
		<li>צור את אמולסיה w/o באמצעות פיפטה להוסיף 500 μl של Hמזוקק 2O, או H2O המכיל 1 מ"ג של פפטיד, חלבון, או מטען מסיס במים אחרים.</li>
		<li>המשך sonicating במשך 30 שניות ב 14 W על קרח.</li>
		<li>צור את אמולסיה w / o / w על ידי שפיכת אמולסיה w / o ל 40 מל של H2O ב 150 מל sonicating במשך 5 דקות ב 16 W על הקרח. בעדינות לנענע את הבקבוקון למעלה ולמטה מצד לצד סביב קצה sonicator כדי להבטיח אמולסיה מלאה.</li>
		<li>מוסיפים מוט ערבוב מגנטי, מעבירים את הבקבוק לצלחת ערבוב ומאפשרים לאמולסיה w/o/w לבחוש בן לילה כדי להסיר את הממס העודף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למחרת בבוקר, לשטוף ולאסוף חלקיקים:<ol>
<li>יוצקים אמולסיה דרך מסננת תאי רשת ניילון 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מ"ל.</li>
		<li>חלקיקי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 5,000 x גרם עבור חלקיקים זעירים או 5 דקות ב 24,000 x גרם עבור חלקיקים.</li>
		<li>Decant supernatant ולשטוף חלקיקים על ידי שימוש חוזר ב 1 מ"ל של H2O.</li>
		<li>העבר חלקיקים תלויים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.</li>
		<li>צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 5,000 x גרם עבור חלקיקים זעירים או 5 דקות ב 24,500 x גרם עבור חלקיקים.</li>
		<li>לשטוף חלקיקים פעמיים יותר על ידי הסרת supernatant, שימוש חוזר 1 מיליליטר H2O, וצנטריפוגות כמו בשלב 1.6.5. לאחר הכביסה, להשעות חלקיקים 1 מיליליטר H2O לשימוש מיידי, או lyophilize לאחסון מורחב.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. מדידת תשואת סינתזה
<ol><li>לפני בקבוקון זכוכית ריק 20 מ"ל. הוסף 100 μl של השעיית חלקיקים לבקבוקון preweighed לאחר pipetting למעלה ולמטה עם micropipette לערבב.</li>
	<li>Lyophilize החלקיקים או יבש תחת זרם עדין של חנקן.</li>
	<li>שוקלים את הבקבוקון המכיל את הפולימר המיובש. לקבוע את תשואת החלקיקים בבקבוקון על ידי חיסור המשקל המקורי של הבקבוקון ממסת הבקבוקון המכיל את החלקיקים היבשים.</li>
	<li>קבע את תפוקת החלקיקים הכוללת על-ידי הכפלת מסת החלקיקים בבקבוקון על-ידי גורם הדילול. כדי לקבוע את התשואה באחוזים, חלק את מסת החלקיקים במסת הקלט התיאורטית המרבית והכפל ב- 100%.</li>
</ol>3. קביעת גודל החלקיקים
<ol><li>נקו את תא שבר הזכוכית בסגנון קובט שסופק על ידי מילוי במים שעברו דה-יון וניגוב עם ספוגית כותנה. להעביר 10 מ"ל של H2O מזוקק לתא הסיעה ניקה, להוסיף מוט ערבוב מיקרו מגנטי, ולטעון את תא השבר לתוך הרכבה התא של מנתח גודל החלקיקים.</li>
	<li>כוונן את מהירות הערבוב המגנטית במנתח החלקיקים כדי להשיג ערבוב מלא בתא השבר ולסגור את דלת התא.</li>
	<li>יישר את הלייזרים לתא השבר באמצעות ממשק תוכנת המכשיר.</li>
	<li>השתמש בממשק תוכנת המכשיר כדי להקליט קריאה בסיסית כאשר תא השבר מכיל H2O מזוקק בלבד.</li>
	<li>פיפט השעיית החלקיקים המקורית למעלה ולמטה עם מיקרופיפט לערבב.</li>
	<li>פיפטה 10 μl של השעיית חלקיקים (בדרך כלל כ 0.5 מ"ג) לתוך תא השבר. ודא שנפח דגימת החלקיקים שנוספה לתא מספיק כדי ליצור עוצמת אות בטווח המתאים כפי שצוין בממשק תוכנת המכשיר. המסה בפועל של החלקיקים הנדרשת תלויה בתפוקת האחוזים ובתכונות האופטיות של דגימת החלקיקים.</li>
	<li>סגור את דלת תא מנתח גודל החלקיקים ומדוד את גודל החלקיקים באמצעות אינדקס שבירה של 1.60 עבור PLGA.</li>
	<li>השתמש בממשק התוכנה כדי לחשב קוטר חלקיקים באמצעות בסיס מספר.</li>
</ol>4. הדמיה של חלקיקים
<ol><li>השעיית חלקיקי פיפט למעלה ולמטה עם מיקרופיפט לערבב. מדללים את השעיית החלקיקים ל-1 מ"ג/מ"ל במים שעברו דה-יון.</li>
	<li>הכינו שקופית מיקרוסקופ על ידי הוספת 3 מיקרומטר של מתלה חלקיקים מדולל והרכבת כיסוי בזווית של 45° כדי למנוע היווצרות בועה. מקם את השקופית על במת המיקרוסקופ והתמונה באמצעות ערכות המסננים המתאימות לכל מטען פלואורסצנטי.</li>
</ol>5. הכנת עכברים עבור i.LN. זריקה
<ol><li>הכן פתרון צבע מעקב:<ol>
<li>הכן 0.1% (w / v) פתרון של צבע מעקב על ידי המסת 10 מ"ג של אבקת צבע עם 10 מ"ל של H2O מזוקק.</li>
		<li>לעקר את פתרון הצבע לתוך בקבוקון זכוכית באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>יום אחד לפני ההזרקה, יש למרדים את העכבר באמצעות isoflurane על פי פרוטוקול בעלי חיים שאושר על ידי IACUC. כדי להעריך את עומק ההרדמה, בצע בדיקת רפלקס קמצוץ בוהן וניטור קצב הנשימה כדי להבטיח קצב נשימה של כ 100-140 נשימות לדקה.</li>
	<li>לגלח את השיער בבסיס הזנב ואת hindquarter באמצעות קוצץ בעוד העכבר הוא מורדם. הסר את השיער מהצד הגחוני של החיה לרוחב סביב לצד הגבי ממש מעל המפרק של הרגל האחורית (הירך).</li>
	<li>להזריק צבע מעקב.<ol>
<li>עבור כל הזרקת צבע, להשתמש micropipette להעביר 10 μl של פתרון צבע לתוך צינור microcentrifuge, ולשאוף את כל 10 μl לתוך מחט 31G מחובר מזרק 1 מ"ל.</li>
		<li>להזריק 10 μl של פתרון צבע תת עורית בכל צד של בסיס הזנב שבו השיער נחתך, טעינה מחדש בין זריקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הסר את השיער הנותר על ידי החלת קרם depilatory מתון באמצעות צמר גפן. הקפד לצפות את האזור בין הירך האחורית והבטן.</li>
	<li>אפשר קרם depilatory לדגר על העור במשך 3 דקות. לאחר הדגירה, יד כפפות רטובות עם H2O חם בעדינות לשפשף קרם depilatory לתוך העור.</li>
	<li>הסר מיד קרם depilatory על ידי הרטבת יד כפפה עם חם H2O ובסיס זנב שפשוף ו hindquarter. חוזרים על הפעולה עד להסרת עודפי דפילציה, מקפידים לשמור על יד רטובה כדי למנוע גירוי.</li>
	<li>הסר שאריות depilatory מן העכבר על ידי הרטבת מטלית רכה או מגבת נייר עם H2O חם בתנועה אחת, ניגוב החלק התחתון של העכבר. הימנע תנועת שפשוף כדי למנוע שחיקה או נזק לעור לעכבר.</li>
	<li>אפשר לעכבר להתאושש תחת מנורת חום ולחזור להחזקה.</li>
</ol>6. i.LN. הזרקת חלקיקים
<ol><li>ביום שלמחרת, יש למרדים את העכבר באמצעות isoflurane על פי פרוטוקול בעלי חיים שאושר על-ידי IACUC.</li>
	<li>בדוק את העכבר כדי לאשר ניקוז של צבע tracer לתוך כל בלוטת הלימפה מפשעתי. הצומת הלימפה צריך להיות גלוי כנקודה כהה ליד הירך האחורית והבטן.</li>
	<li>הכן פתרון הזרקת חלקיקים:<ol>
<li>Resuspend חלקיקים Hמזוקק 2O בריכוז הזרקה הרצוי. עבור כל זריקה, להשתמש micropipette להעביר 10 μl של פתרון חלקיקים לתוך צינור microcentrifuge.</li>
		<li>לשאוף את כל 10 μl לתוך מחט אינסולין 31G מחובר מזרק 1 מ"ל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הזרקת מינון חלקיקים:<ol>
<li>לאחר הדמיה של LN, הדקו את העור סביב LN באמצעות אגודל, אצבע המורה והאצבע האמצעית כדי למשוך את ההתגרות בעור ולאפשר מיקום מבוקר של נפח ההזרקה.</li>
		<li>התקרבו ל-LN עם המחט בזווית של 90° לעור וחדרו את העור מעל ה-LN הצבוע לעומק של 1 מ"מ.</li>
		<li>הזרק לאט את כל הנפח. במהלך ההזרקה, להתבונן נפח LN דרך העור כדי לאשר הזרקה על ידי הגדלת LN גלוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אפשר לעכבר להתאושש תחת מנורת חום ולחזור להחזיק או לבצע בדיקות נוספות.</li>
</ol>לטכניקות ניתוח רלוונטיות (למשל היסטולוגיה, ציטומטריית זרימה) ראו מאמרי JoVE 265, 1743 ו- 3054 ופרוטוקולים נוכחיים באימונולוגיה, פרקים 5 ו- 2115-22.

<ol>
	<li>Swartz, M. A., Hirosue, S., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Approaches+to+Immunotherapy.">Engineering Approaches to Immunotherapy.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Adamina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranodal+immunization+with+a+vaccinia+virus+encoding+multiple+antigenic+epitopes+and+costimulatory+molecules+in+metastatic+melanoma.">Intranodal immunization with a vaccinia virus encoding multiple antigenic epitopes and costimulatory molecules in metastatic melanoma.</a> Mol. Ther. 18, 651-659 (2010).</li><li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-Lymph+Node+Prime-Boost+Vaccination+against+Melan+A+and+Tyrosinase+for+the+Treatment+of+Metastatic+Melanoma:+Results+of+a+Phase+1.">Intra-Lymph Node Prime-Boost Vaccination against Melan A and Tyrosinase for the Treatment of Metastatic Melanoma: Results of a Phase 1.</a> Clinical Trial. Clin. Cancer Res. 17, 2987-2996 (2011).</li><li>Senti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intralymphatic+allergen+administration+renders+specific+immunotherapy+faster+and+safer:+a+randomized+controlled+trial.">Intralymphatic allergen administration renders specific immunotherapy faster and safer: a randomized controlled trial.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 17908-17912 (2008).</li><li>Jewell, C. M., Lopez, S. C. B., Irvine, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+engineering+of+the+lymph+node+microenvironment+via+intranodal+injection+of+adjuvant-releasing+polymer+particles.">In situ engineering of the lymph node microenvironment via intranodal injection of adjuvant-releasing polymer particles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15745-15750 (2011).</li><li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+kinetics+determines+immune+reactivity.">Antigen kinetics determines immune reactivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5189-5194 (2008).</li><li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels.">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 617-628 (2005).</li><li>Irvine, D. J., Jewell, C. M., Ducheyne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+132.">Ch. 132.</a> Comprehensive Biomaterials. , (2011).</li><li>Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Nano-+and+Microparticles+to+Tune+Immunity.">Engineering Nano- and Microparticles to Tune Immunity.</a> Adv. Mater. 24, 3724-3746 (2012).</li><li>Reddy, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+lymphatic+transport+and+complement+activation+in+nanoparticle+vaccines.">Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines.</a> Tissue Eng. Part A. 14, 734-735 (2008).</li><li>Bershteyn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-supported+lipid+shells,+onions,+and+flowers.">Polymer-supported lipid shells, onions, and flowers.</a> Soft Matter. 4, 1787-1791 (2008).</li><li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+intralymphatic+injection+of+peptide+vaccines+enhances+immunogenicity.">Direct intralymphatic injection of peptide vaccines enhances immunogenicity.</a> Eur. J. Immunol. 35, 568-574 (2005).</li><li>Mohanan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+routes+affect+the+quality+of+immune+responses:+A+cross-sectional+evaluation+of+particulate+antigen-delivery+systems.">Administration routes affect the quality of immune responses: A cross-sectional evaluation of particulate antigen-delivery systems.</a> J. Controlled Release. 147, 342-349 (2010).</li><li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+mapping+in+the+mouse.">Lymph node mapping in the mouse.</a> J. Immunol. Methods. 332, 170-174 (2008).</li><li>He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Flow+Cytometry+Analyses+of+Cellular+Immune+Response+in+Rhesus+Macaques.">Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques.</a> J. Vis. Exp. , 1743 (2010).</li><li>Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+2-Photon+Imaging+of+Peripheral+Lymph+Nodes+in+Mice.">Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice.</a> J. Vis. Exp. e265. , 265 (2007).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Imaging+of+T+Cells+in+Murine+Lymph+Node+Slices+with+Widefield+and+Confocal+Microscopes.">Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes.</a> J. Vis. Exp. , 3054 (2011).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Current Protocols in Immunology: Immunofluorescence Staining. , (2001).</li><li>Hofman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Current Protocols in Immunology: Immunohistochemistry. , (2001).</li><li>Holmes, K., Lantz, L. M., Fowlkes, B. J., Schmid, I., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Current Protocols in Immunology: Preparation of Cells and Reagents for Flow Cytometry. , (2001).</li><li>Sharrow, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Current Protocols in Immunology: Overview of Flow Cytometry. , (2001).</li><li>Sharrow, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Current Protocols in Immunology: Analysis of Flow Cytometry Data. , (2001).</li><li>Anderson, J. M., Shive, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+and+biocompatibility+of+PLA+and+PLGA+microspheres.">Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 28, 5-24 (1997).</li><li>Danhier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLGA-based+nanoparticles:+an+overview+of+biomedical+applications.">PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications.</a> J. Controlled Release. 161, 505-522 (2012).</li></ol>

עלויות ייצור ודמי גישה עבור מאמרים אלה היו ממומנים חלקית על ידי HORIBA, בע"מ.

הטכניקה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת אספקה מבוקרת של חיסונים ל- LNs ולאנטיגן תושב LN המציג תאים. מטען אנקפסולציה ביו-חומרית יכול להיות מקומי בתוך LN, המאפשר מניפולציה של מינונים של סוג אחד או יותר של מטען מועבר microenvironment LN. לוקליזציה ושחרור מבוקר של חלקיקי פולימר הוכח ליצור תגובה חיסונית תאית הומוריסטית חזקה במינונים נמוכים משמעותית מאשר גישות קונבנציונליות. יתר על כן, באמצעות מניפולציה של גודל המוביל הביו-חומרי, ניתן לווסת את המצב העיקרי של עיבוד סלולרי בין ספיגה ישירה של חלקיקים או שחרור מטען חוץ-תאי ממיקרו-חלקיקים גדולים יותר5. תוצאות אלו קובעות את ההיתכנות של מסירה ביו-חומרית של i.LN. כפלטפורמה לאספקת חיסונים טיפוליים.
הסינתזה של חלקיקי PLGA על ידי אידוי אמולסיה /ממס הועסקה באופן נרחב ביישומי אספקת תרופות23,24. לפיכך, אתגרים פוטנציאליים הקשורים לטכניקה זו מתייחסים בעיקר לזיהוי מוצלח ותצהיר של חיסונים באתר היעד של LN. למרות שהשימוש בצבע מעקב מקל על הדמיה של LNs מפשעתי ממוקד, גודל היעד ועומק מתחת לעור הם קטנים. לכן, המחברים ממליצים הקצאה זמן ועכברים לתרגול הכנה וזריקות של עכברים. במהלך הכנת בעלי חיים(כלומר גילוח ויישום של depilatory), יש להקפיד לא לחתוך את העכברים בצד הגחוני של החיה שבו זווית הרגל עם הבטן עושה את העור נוטה יותר לפציעה מן הקוצץ. בנוסף, יש להסיר את כל depilatory עם מים חמים כדי למנוע מבעלי חיים לבלוע את השמנת במהלך התנהגות טיפוח נורמלית. כדי לתרגל זריקות LN, ריכוז צבע מעקב גבוה יותר יכול להינתן ולתרגל בעלי חיים ניתן המתת חסד, ולאחר מכן מוזרק מספר פעמים. עכברי הזרקה הבאים ניתן necropsied ואת הגודל של LNs מבעלי חיים מוזרקים ניתן להשוות עם LN שליטה לא מופקרת. מגבלה אחת של טכניקה זו היא המגבלה הפיזית של נפח ההזרקה שניתן לטעון לתוך מבנה LN. הפרוטוקול שלנו מציע נפח הזרקה של 10 μl בעכברים, אם כי מחקרים אחרים דיווחו על נפחי הזרקה גדולים יותר לפחות עד 20 μl.13 עם זאת, אספקה ישירה של חיסונים באמצעות i.LN. הזרקה מאפשרת דרמטית מינון חוסך כך הפונקציה של חיסונים אלה בדרך כלל לא צריך להיות מוגבל על ידי אילוצי נפח.
כאמור, שינוי המאפיין הפיזי של החלקיקים(כלומר גודל) הוא מנגנון יעיל לשינוי המסלול או התוצאות הנגרמות על ידי ביו-חומרים ומטענים עטופים ברקמת LN. פרוטוקול אידוי אמולסיה / ממס ניתן לשנות בקלות כדי לשנות תכונות פיזיקליות או כימיות כגון מטען פני השטח או פונקציונליות, ואת קצב ההתכלה / שחרור מטען23,24. לדוגמה, קינטיקה שחרור ניתן לכוונן באמצעות קומפוזיציות פולימר חלופיות, ואת תפקוד פני השטח ניתן לשנות באמצעות הרכבים השומנים שונה או פולי (אלכוהול ויניל). המטען טעון בחלקיקים ניתן לתפעל בקלות כדי להכיל אנטיגנים שונים או אדג'ובאנטים עבור פתוגנים היעד. היתרון של גישה זו מושגת באמצעות שילוב של משלוח i.LN. עם מקומי, שחרור מבוקר של מטען מ biomaterials. סינרגיה זו מקימה פלטפורמה שניתן לנצל כדי ליצור ביעילות תגובות חיסוניות אדפטיביות באמצעות מינונים זעירים ועם תופעות לוואי לא ספציפיות/מערכתיות מופחתות.

בלוטות הלימפה (LNs) הם מרכזי הפיקוד של המערכת החיסונית. באתר אימונולוגי זה, תאים המציגים אנטיגן פריים לימפוציטים נאיביים נגד אנטיגנים זרים ספציפיים כדי להפעיל תגובות חיסוניות הסלולר הומוריסטי. LNs הפכו אפוא למטרה אטרקטיבית לאספקת חיסונים ואימונותרפיות. למרבה הצער, רוב אסטרטגיות החיסון לגרום לא יעיל, משלוח חולף של אנטיגן ואדג'ובאנטים לרקמת הלימפה1. גישות המשפרות את המיקוד והשימור של רכיבי חיסון ב- LNs יכולות אפוא להשפיע באופן משמעותי על העוצמה והיעילות של חיסונים חדשים.
אסטרטגיה אחת לעקוף את האתגר של פילוח LN שהוכיח עניין רב בניסויים קליניים חדשים היא ישירה, תוך LN (i.LN.) הזרקה2-4. ניסויים אלה השתמשו הדרכה אולטרסאונד כדי לספק חיסונים LNs כהליך אשפוז פשוט. בהשוואה למסלולי הזרקה היקפיים מסורתיים, גישה זו הביאה לחסכוך משמעותי במינון וליעילות משופרת בהקשרים טיפוליים כולל אלרגיות וסרטן2-4. מחקרים אלה השתמשו בהזרקת חיסונים מסיסים(כלומר נטולי ביו-חומרים) אשר נוקו במהירות על ידי ניקוז לימפתי. לכן, זריקות מרובות- או מחזורים של זריקות מרובות - ניתנו כדי להשיג את ההשפעות הטיפוליות המרשימות האלה. שמירה משופרת ב- LN יכולה לשפר את האינטראקציה בין אנטיגן ו/או אדג'ובנטי לתאי החיסון, ולשפר עוד יותר את העוצמה של הפרימינג של תאי החיסון. פוטנציאל זה נתמך על ידי מחקרים אחרונים המראים קינטיקה של משלוח אנטיגן ואדג'ובנטי לשחק תפקיד קריטי בקביעת התגובה החיסונית הספציפיתשנוצרה 5-7. יתר על כן, לוקליזציה ומזעור מינונים של תרופות וחיסונים יכולים להפחית או למנוע השפעות מערכתיות, כגון דלקת כרונית.
ביו-חומרים נחקרו בהרחבה כדי לשפר את העוצמה והיעילות שלחיסונים 1,8,9. אנקפסולציה או ספיחה על נושאות ביו-חומריות יכולות להגן פיזית על המטען מפני השפלה ולהתגבר על מגבלות המסיסות. תכונה בולטת נוספת של נושאות מטוסים ביו-חומריות, כגון מיקרו פולימרי או חלקיקים, היא היכולת לטעון מספר סוגים של מטענים, ולאחר מכן לשחרר מטענים אלה על פני מרווחי זמן מבוקרים. עם זאת, מגבלה משמעותית שממשיכה לעכב חיסונים ביו-חומריים ואימונותרפיות ב- vivo אינה יעילה לפילוח של תאים חיסוניים וסחר מוגבל לבלוטות לימפה. לדוגמה, הזרקה היקפית של חיסונים ביו-חומריים דרך מסלולים קונבנציונליים(למשל תוך-עורית, תוך שרירית) מציגה בדרך כלל פילוח LN לקוי, כאשר עד 99% מהחומר המוזרק נותר באתר ההזרקה4,10. לאחרונה, הגודל של נשאי חיסון ביו-חומריים כבר מכוון כדי לשפר סחר מועדף או ניקוז של חיסונים אלה LNs באמצעות זרימה ביניים8,10. התקדמות זו הובילה לתגובות חיסוניות משופרות תאיות והומוריסטיות, והדגישה את החשיבות של מיקוד והנדסת סביבת LN לחיסונים חדשים.
נייר זה מציג פרוטוקול חיסון המשלב חלקיקי פולימר מיוצבים שומנים ומשלוח i.LN. כדי ליצור מחסני חיסון בשחרור מבוקר5,11. בונים על מחקרים שנעשו לאחרונה באמצעות טכניקות כירורגיות עבור i.LN. בעכברים6,7,12,13, פיתחנו אסטרטגיה מהירה, לא כירורגית להזרקת חיסונים ביו-חומריים בבעליחייםקטנים 5 . שילוב של משלוח i.LN. עם נשאי חיסון ביו-חומריים שיפרה בעוצמה את תגובת תאי CD8 T תוך 7 ימים לאחר זריקה אחת של מחסני חיסון בשחרור מבוקר5. תגובה הומוריסטית חזקה(כלומר טיטר נוגדנים) נוצרה גם היא; שני השיפורים היו קשורים לשימור מוגבר של רכיבי חיסון בלוטות הלימפה כי היה בתיווך על ידי שחרור מבוקר מן המובילים biomaterial. באופן מעניין, גודלם של חלקיקי החיסון שינה את גורלם של חומרים אלה פעם אחת ב- LNs: חלקיקים ננומטריים הראו ספיגה ישירה מוגברת על ידי תאים, בעוד חלקיקים זעירים גדולים יותר נשארו בסביבת LN חוץ תאית ומטען משוחרר(למשל אדג'ובאנט) שנלקח על ידי אנטיגן תושב LN המציג תאים5. נתונים אלה מצביעים על שני מסלולים שניתן לנצל לחיסונים חדשים על ידי שליטה בגודל של ביו-חומרים מוזרקים i.LN.
במאמר זה חלקיקי פולימר מתכלים לייצוב שומנים (מיקרו וננומטריים) מסונתזים באמצעות אסטרטגיית אמולסיה כפולהשונה 5,11. תכונות החלקיקים מתאפיינות בעקיפת לייזר ומיקרוסקופיה. חלקיקים אלה מוזרקים ישירות לתוך LNs מפשעתי מזוהה באופן לא כירורגי באמצעות נפוץ, צבע מעקב nontoxic14. ניתוח שלאחר הזרקה של LNs על ידי היסטולוגיה או cytometry זרימה ניתן להשתמש כדי לאמת את ההתפלגות של חלקיקים בתוך סביבת LN, כמו גם כדי לפקח על ספיגת הסלולר ושמירה של חלקיקים לאורך זמן. עבור פרוטוקולים המפרטים עיבוד היסטולוגי ו cytometry זרימה, הקוראים מופנים מאמרים JoVE האחרונים ודוחות יומן15-22. תוצאות אופייניות להדגים מיקוד LN מקומי של מחסנים אלה שניתן לנצל כדי להשיג חזק, תגובות חיסוניות יעילות או כדי להתאים חסינות עבור פתוגנים היעד.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850375</td>
			<td style="width:167px;">10 mg/ml stock in chloroform</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">880128</td>
			<td style="width:167px;">10 mg/ml stock in chloroform</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">890890</td>
			<td style="width:167px;">10 mg/ml stock in chloroform</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Polylactic-co-glycolic acid (PLGA)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2191</td>
			<td style="width:167px;">Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dichloromethane (DCM)</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH1113</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:71px;">Vetone</td>
			<td style="width:119px;">502017</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nair</td>
			<td style="width:71px;">Nair</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Evans blue tracer dye</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">AAA16774-09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD328418</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD305167</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD309628</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 &#181;m</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-949</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vybrant DiD Cell-Labeling Solution</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">V-22887</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 &#181;m</td>
			<td style="width:71px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">17149</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 &#181;m</td>
			<td style="width:71px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">17156</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Ovalbumin, Purified</td>
			<td style="width:71px;">Worthington Biochemical</td>
			<td style="width:119px;">LS003056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125</td>
			<td style="width:71px;">Qsonica</td>
			<td style="width:119px;">Q125</td>
			<td style="width:167px;">1/8 in diameter microtip probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer</td>
			<td style="width:71px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;">YO-04739-22</td>
			<td style="width:167px;">10 G dispersing element</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX-83</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer</td>
			<td style="width:71px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">LA-950</td>
			<td style="width:167px;">Including provided cuvette-style glass fraction cell</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Professional 8685 Peanut Classic Clippers</td>
			<td style="width:71px;">Wahl</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-lymph node injection of biodegradable polymer particles

הדור של תגובה חיסונית אדפטיבית מסתמך על ניקוז יעיל או סחר של אנטיגן לבלוטות הלימפה לעיבוד והצגת מולקולות זרות אלה לימפוציטים T ו- B. בלוטות הלימפה הפכו אפוא למטרות קריטיות עבור חיסונים חדשים immunotherapies. אסטרטגיה עדכנית למיקוד רקמות אלה היא הזרקת בלוטות לימפה ישירה של רכיבי חיסון מסיסים, וניסויים קליניים הקשורים לטכניקה זו היו מבטיחים. מספר אסטרטגיות ביו-חומריות נחקרו גם כדי לשפר את פילוח בלוטות הלימפה, למשל, כוונון גודל החלקיקים לניקוז אופטימלי של חלקיקי חיסון ביו-חומריים. במאמר זה אנו מציגים שיטה חדשה המשלבת הזרקת בלוטות לימפה ישירה עם חלקיקי פולימר מתכלים שיכולים להיות עמוסים ברכיבי אנטיגן, אדג'ובנט או חיסון אחר. בשיטה זו מיקרו-חלקיקים פולימריים או חלקיקים מסונתזים על ידי פרוטוקול אמולסיה כפול שונה המשלב מייצבי שומנים. תכונות חלקיקים(למשל גודל, טעינת מטען) מאושרות על ידי עקיפת לייזר ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית, בהתאמה. בלוטות לימפה עכבר מזוהים לאחר מכן על ידי הזרקה היקפית של צבע מעקב nontoxic המאפשר הדמיה של אתר הזרקת היעד ותצהיר הבא של חלקיקי פולימר בלוטות הלימפה. טכניקה זו מאפשרת שליטה ישירה על המינונים והשילובים של ביו-חומרים ורכיבי חיסון המועברים לבלוטות הלימפה וניתן לרתום אותם בפיתוח חיסונים חדשים מבוססי ביו-חומרים.

את התוצאות הצפויות לפרוטוקולים המוצגים בכתב יד זה ניתן לחלק לשלוש קטגוריות: סינתזת חלקיקים, הכנת בעלי חיים והזרקת חלקיקים.
איור 1 מתאר את הסינתזה והאפיון של חלקיקי פולימר מתכלים, המתייצבים על ידי שומנים אמפיפיליים. תוצאות פרוטוקול סינתזת האידוי אמולסיה/ממס (איור 1A) ניתן להעריך באופן איכותי על ידי בדיקה חזותית של אמולסיות הסופי שנוצר; אצוות חלקיקים צריכות להיות אמולסיות הומוגניות ויציבות עם מראה אטום. סיבוכים כוללים אמולסיות כי שמנת או flocculate, לעתים קרובות בשל אחסון לא תקין של מייצבי השומנים. כדי למנוע חוסר יציבות זה, שומנים צריך להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס במצב מיובש או בקבוקון אטום מטוהר עם חנקן. הערכה כמותית של סינתזת חלקיקים יכולה להתבצע באמצעות עקיפת לייזר או פיזור אור דינמי כדי לנתח התפלגות גודל (איור 1B). התוצאות הצפויות כוללות גדלי חלקיקים מונומודאליים מופצים היטב, המצביעים על אוכלוסייה אחידה של חלקיקים. פרמטרי הסינתזה המתוארים בכתב יד זה מייצרים התפלגויות ממוצעות של מספר שבמרכזן כ-100 ננומטר או 3 מיקרומטר עבור חלקיקים ומיקרו-חלקיקים, בהתאמה. הערכה איכותית נוספת של סינתזת חלקיקים ניתן להשיג באמצעות שינוי של הפרוטוקול לעיל לשלב סוגים מרובים של מטען פלואורסצנטי. באיור 1C, תמונות מיקרוסקופיות של מיקרו-חלקיקים עמוסים בפפטיד פלואורסצנטי (FITC, ירוק), צבע ליפופילי (DiD, אדום) ותמונת כיסוי (צהובה) מאשרות יצירת חלקיקים בטווח הגודל הרצוי ואנקפסולציה של פפטיד בתוך נפח החלקיק.
שני הלוחות הראשונים של איור 2 מסכמים את התוצאות הצפויות של הכנת בעלי חיים לאסטרטגיית הזרקת i.LN המתוארת במאמר זה. המתודולוגיה כוללת סימון LNs מפשעתי על ידי הזרקה היקפית של מעקב לא-רעלים כדי לזהות את המיקום להזרקת חלקיקים(איור 2A)5. כאמור, ניקוז צבע המעקב לאחר הזרקה תת עורית בבסיס הזנב יאפשר הדמיה של LNs מפשעתי (איור 2B)5. בליעה של קרמים depilatory שאושרו יכול להוות סכנות לעכברים. לכן, יש להקפיד להסיר ביסודיות את כל הקרם מיושם, לשים לב במיוחד כפות, ואת הצד הגחוני של העכברים. יש להסיר depilatory באמצעות מטלית רטובה, רכה או מגבת נייר רטובה בתנועה אחת, חלקה. הימנע שפשוף כדי להסיר שמנת, כמו זה יכול להוביל שפשופים על העור החשוף של העכברים.
ניתן להעריך אישור מקומי של מסירה ל- LN המפשעה באמצעות תצפית או היסטולוגיה. ניתן לנטר את עוצמת ה- LN באופן חזותי במהלך ההזרקה כאינדיקטור להזרקה מוצלחת. התוצאות הצפויות כוללות חלוקת מטענים יעילה בכל מבנה ה-LN, ללא דליפה משמעותית לרקמות או לתאים סמוכים. יתר על כן, כמו נוזל מוזרק תזוזות /מדלל את tracer ב LN, ריכוז צבע / צביעה צריך להיות פחות אינטנסיבי לאחר הזרקה. תצפית של הרקמה צריכה לחשוף LN שלם, אבל מוגדל עקב הזרקת נוזלים. אתגרים פוטנציאליים כוללים הזרקה מהירה מדי או חסר LN, שניהם יכולים לגרום elution של נפח לתוך הרקמה התת עורית שמסביב. תוצאות לא רצויות אלה ניתן לאשר על ידי necropsy או היסטולוגיה, שם השעיית החלקיקים תיצפה מתפשטת לתאים ורקמות מרוחקים מצמתים המיועדים להזרקה. לעומת זאת, תוצאה צפויה תהיה זיהוי של LN מפשעתי מוגדל עקב בלימת חלקיקים בתוך מבנה LN. עיבוד היסטולוגי של LNs מגורש יכול לאשר באופן סופי משלוח של מטען לרקמת הלימפה, כפי שמוצג איורים 2C ו 2D. שימו לב שהחלקיקים באיור 2 משלבים מטען פלואורסצנטי כדי לאפשר הדמיה של מטען במהלך ההזרקה, כמו גם במהלך עיבוד היסטולוגי ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50984/50984fig1.jpg" width="600px"> איור 1. סינתזה ואפיון של חלקיקים מיוצב השומנים. A) דיאגרמה סכמטית המתארת את הסינתזה של חלקיקים מיוצב השומנים שהוכן על ידי אידוי אמולסיה / ממס. B) חלוקות גודל של מיקרו-חלקיקים (קו מוצק, קוטר = 2.8 מיקרומטר) וננו-חלקיקים (קו מקווקו, קוטר = 113 ננומטר). C) תמונות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות של חלקיקים עמוסים בפפטיד בעל תווית פלואורסצנטית וצבע חלקיקים פלואורסצנטי. תוויות: פפטיד (ירוק) וחלקיקים (אדום). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50984/50984fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50984/50984fig2.jpg" width="600px"> איור 2. איי.אל.אל.ן. הזרקה והפצה של חלקיקים מתכלים בתוך LN. A)מתודולוגיה להזרקת i.LN. B) תצוגה חזותית של LNs בעכבר דרך העור (תמונה עליונה) ובעקבות necropsy (תמונה תחתונה)5. C) כתמים היסטולוגיים של LN המאשר תצהיר והפצה של חלקיקי פולימר בעלי תווית פלואורסצנטית (חלקיקים, ירוק; תאי T, אדום; תאי B, כחול). D) חלקיקים בעלי תווית פלואורסצנטית (50 ננומטר, תמונה שמאלית) ומיקרו-חלקיקים (6 מיקרומטר, תמונה ימנית) ב- LNs 24 שעות לאחר ההזרקה. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50984/50984fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר</a>.

Watch this Scientific Journal Video about Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles at JoVE.com

Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles

בלוטות הלימפה הן הרקמות החיסוניות המתזמרות את התגובה החיסונית והן יעד קריטי לחיסונים. Biomaterials הועסקו כדי למקד טוב יותר בלוטות הלימפה כדי לשלוט על משלוח של אנטיגנים או אדג'ובנטים. מאמר זה מתאר טכניקה המשלבת רעיונות אלה כדי להזריק חלקיקי פולימר תואמים ביולוגית לתוך בלוטות הלימפה.

הזרקת בלוטות תוך-לימפתיות של חלקיקי פולימר מתכלים

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these ...

intra-lymph-node-injection-of-biodegradable-polymer-particles

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.3K Views.  University of Maryland, College Park. בלוטות הלימפה הן הרקמות החיסוניות המתזמרות את התגובה החיסונית והן יעד קריטי לחיסונים. Biomaterials הועסקו כדי למקד טוב יותר בלוטות הלימפה כדי לשלוט על משלוח של אנטיגנים או אדג'ובנטים. מאמר זה מתאר טכניקה המשלבת רעיונות אלה כדי להזריק חלקיקי פולימר תואמים ביולוגית לת?...

Video: Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science. Methods for particle trapping based on optical, magnetic, electrokinetic, and acoustic techniques have led to major advancements in physics and biology ranging from the molecular to cellular level. In this article, we introduce a new microfluidic-based technique for particle trapping and manipulation based solely on hydrodynamic fluid flow. Using this method, we demonstrate trapping of micro- and nano-scale particles in aqueous solutions for long time scales. The hydrodynamic trap consists of an integrated microfluidic device with a cross-slot channel geometry where two opposing laminar streams converge, thereby generating a planar extensional flow with a fluid stagnation point (zero-velocity point). In this device, particles are confined at the trap center by active control of the flow field to maintain particle position at the fluid stagnation point. In this manner, particles are effectively trapped in free solution using a feedback control algorithm implemented with a custom-built LabVIEW code. The control algorithm consists of image acquisition for a particle in the microfluidic device, followed by particle tracking, determination of particle centroid position, and active adjustment of fluid flow by regulating the pressure applied to an on-chip pneumatic valve using a pressure regulator. In this way, the on-chip dynamic metering valve functions to regulate the relative flow rates in the outlet channels, thereby enabling fine-scale control of stagnation point position and particle trapping. The microfluidic-based hydrodynamic trap exhibits several advantages as a method for particle trapping. Hydrodynamic trapping is possible for any arbitrary particle without specific requirements on the physical or chemical properties of the trapped object. In addition, hydrodynamic trapping enables confinement of a "single" target object in concentrated or crowded particle suspensions, which is difficult using alternative force field-based trapping methods. The hydrodynamic trap is user-friendly, straightforward to implement and may be added to existing microfluidic devices to facilitate trapping and long-time analysis of particles. Overall, the hydrodynamic trap is a new platform for confinement, micromanipulation, and observation of particles without surface immobilization and eliminates the need for potentially perturbative optical, magnetic, and electric fields in the free-solution trapping of small particles.

In this article, we present a microfluidic-based method for particle confinement based on hydrodynamic flow. We demonstrate stable particle trapping at a fluid stagnation point using a feedback control mechanism, thereby enabling confinement and micromanipulation of arbitrary particles in an integrated microdevice.

Microfluidic מבוססי הידרודינמית מלכודת חלקיקים יחיד

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

A Chitosan Based, Laser Activated Thin Film Surgical Adhesive, 'SurgiLux': Preparation and Demonstration

Sutures are a 4,000 year old technology that remain the 'gold-standard' for wound closure by virtue of their repair strength (~100 KPa). However, sutures can act as a nidus for infection and in many procedures are unable to effect wound repair or interfere with functional tissue regeneration.1 Surgical glues and adhesives, such as those based on fibrin and cyanoacrylates, have been developed as alternatives to sutures for the repair of such wounds. However, current commercial adhesives also have significant disadvantages, ranging from viral and prion transfer and a lack of repair strength as with the fibrin glues, to tissue toxicity and a lack of biocompatibility for the cyanoacrylate based adhesives. Furthermore, currently available surgical adhesives tend to be gel-based and can have extended curing times which limit their application.2 Similarly, the use of UV lasers to facilitate cross-linking mechanisms in protein-based or albumin 'solders' can lead to DNA damage while laser tissue welding (LTW) predisposes thermal damage to tissues.3 Despite their disadvantages, adhesives and LTW have captured approximately 30% of the wound closure market reported to be in excess of US $5 billion per annum, a significant testament to the need for sutureless technology.4
In the pursuit of sutureless technology we have utilized chitosan as a biomaterial for the development of a flexible, thin film, laser-activated surgical adhesive termed 'SurgiLux'. This novel bioadhesive uses a unique combination of biomaterials and photonics that are FDA approved and successfully used in a variety of biomedical applications and products. SurgiLux overcomes all the disadvantages associated with sutures and current surgical adhesives (see Table 1).
In this presentation we report the relatively simple protocol for the fabrication of SurgiLux and demonstrate its laser activation and tissue weld strength. SurgiLux films adhere to collagenous tissue without chemical modification such as cross-linking and through irradiation using a comparatively low-powered (120 mW) infrared laser instead of UV light. Chitosan films have a natural but weak adhesive attraction to collagen (~3 KPa), laser activation of the chitosan based SurgiLux films emphasizes the strength of this adhesion through polymer chain interactions as a consequence of transient thermal expansion.5 Without this 'activation' process, SurgiLux films are readily removed.6-9 SurgiLux has been tested both in vitro and in vivo on a variety of tissues including nerve, intestine, dura mater and cornea. In all cases it demonstrated good biocompatibility and negligible thermal damage as a consequence of irradiation.6-10

The fabrication of a novel, flexible thin film surgical adhesive from FDA approved ingredients, chitosan and indocyanine green is described. Bonding of this adhesive to collagenous tissue through a simple activation process with a low-powered infra-red laser is demonstrated.

Chitosan מבוסס, דבק הליזר הופעל סרט דק כירורגים, &#39;SurgiLux&#39;: הכנה והפגנה

Sutures are a 4,000 year old technology that remain the 'gold-standard' for wound closure by virtue of their repair strength (~100 KPa). However, sutures ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

פרוטוקול להערכה הידרודינמית יחסית של הפולימר שסתום Tri-עלון

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, heart attack or peripheral arterial diseases. Direct delivery of angiogenic growth factors has the potential to stimulate new blood vessel growth, but is often associated with limitations such as lack of targeting and short half-life in vivo. Gene therapy offers an alternative approach by delivering genes encoding angiogenic factors, but often requires using virus, and is limited by safety concerns. Here we describe a recently developed strategy for stimulating vascular growth by programming stem cells to overexpress angiogenic factors in situ using biodegradable polymeric nanoparticles. Specifically our strategy utilized stem cells as delivery vehicles by taking advantage of their ability to migrate toward ischemic tissues in vivo. Using the optimized polymeric vectors, adipose-derived stem cells were modified to overexpress an angiogenic gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF). We described the processes for polymer synthesis, nanoparticle formation, transfecting stem cells in vitro, as well as methods for validating the efficacy of VEGF-expressing stem cells for promoting angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

We describe the method of programming stem cells to overexpress therapeutic factors for angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Processes described include polymer synthesis, transfecting adipose-derived stem cells in vitro, and validating the efficacy of programmed stem cells to promote angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

תאי גזע תכנות טיפולי אנגיוגנזה שימוש אורגניים פולימריים חלקיקים

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Manufacturing Of Robust Natural Fiber Preforms Utilizing Bacterial Cellulose as Binder

A novel method of manufacturing rigid and robust natural fiber preforms is presented here. This method is based on a papermaking process, whereby loose and short sisal fibers are dispersed into a water suspension containing bacterial cellulose. The fiber and nanocellulose suspension is then filtered (using vacuum or gravity) and the wet filter cake pressed to squeeze out any excess water, followed by a drying step. This will result in the hornification of the bacterial cellulose network, holding the loose natural fibers together.
Our method is specially suited for the manufacturing of rigid and robust preforms of hydrophilic fibers. The porous and hydrophilic nature of such fibers results in significant water uptake, drawing in the bacterial cellulose dispersed in the suspension. The bacterial cellulose will then be filtered against the surface of these fibers, forming a bacterial cellulose coating. When the loose fiber-bacterial cellulose suspension is filtered and dried, the adjacent bacterial cellulose forms a network and hornified to hold the otherwise loose fibers together.
The introduction of bacterial cellulose into the preform resulted in a significant increase of the mechanical properties of the fiber preforms. This can be attributed to the high stiffness and strength of the bacterial cellulose network. With this preform, renewable high performance hierarchical composites can also be manufactured by using conventional composite production methods, such as resin film infusion (RFI) or resin transfer molding (RTM). Here, we also describe the manufacturing of renewable hierarchical composites using double bag vacuum assisted resin infusion.

We present a novel method of manufacturing rigid and robust short natural fiber preforms using a papermaking process. Bacterial cellulose acts simultaneously as the binder for the loose fibers and provides rigidity to the fiber preforms. These preforms can be infused with a resin to produce truly green hierarchical composites.

ייצור של תבניות ייצרו מראש חזקות סיבים טבעיים ניצול קטריאלי תאית כמו בינדר

A novel method of manufacturing rigid and robust natural fiber preforms is presented here. This method is based on a papermaking process, whereby loose ...

TAPE: A Biodegradable Hemostatic Glue Inspired by a Ubiquitous Compound in Plants for Surgical Application

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant adhesion strength than commercial tissue adhesives. Medical adhesives have attracted great attention as potential alternative tools to sutures and staples due to their convenience in usage with minimal invasiveness. Although there are several protocols for developing tissue adhesives including those commercially available such as fibrin glues and cyanoacrylate-based materials, mostly they require a series of chemical syntheses of organic molecules, or complicated protein-purification methods, in the case of bio-driven materials (i.e., fibrin glue). Also, the development of surgical glues exhibiting high adhesive properties while maintaining biodegradability is still a challenge due to difficulties in achieving good performance in the wet environment of the body. We illustrate a new method to prepare a medical glue, known as TAPE, by the weight-based separation of a water-immiscible supramolecular aggregate formed after a physical mixing of a plant-derived, wet-resistant adhesive molecule,&#160;Tannic Acid (TA), and a well-known biopolymer, Poly(Ethylene) glycol (PEG). With our approach, TAPE shows high adhesion strength, which is 2.5-fold more than commercial fibrin glue in the presence of water. Furthermore, TAPE is biodegradable in physiological conditions and can be used as a potent hemostatic glue against tissue bleeding. We expect the widespread use of TAPE in a variety of medical settings and drug delivery applications, such as polymers for muco-adhesion, drug depots, and others.

We describe the simplest protocol to prepare biodegradable medical glue that has an effective hemostatic ability. TAPE is a water-immiscible supramolecular aggregate prepared by mixing of tannic acid, a ubiquitous compound found in plants, and poly(ethylene) glycol, yielding a 2.5 times greater water-resistant adhesion compared with commercial fibrin glue.

TAPE: דבק עוצר דמום אורגני בהשראת תרכובת ניכרת בכל היבט של צמחים עבור יישום כירורגי

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

מנהל מתמשך של mitogens β-cell כדי איי עכבר Intact<em&gt; Ex Vivo</em&gt; שימוש פוליפוני מתכלה (לקטית-שיתוף גליקולית וחומצה) מיקרוסכמות

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a high-protein crambe meal that has limited value, as it is not fit for food or feed use. However, it contains proteins that could potentially make it a suitable raw material for higher-value products. The purpose of this study was to find methods of making this side stream into extruded films, showing that products with a higher value can be produced. The study mainly considered the development of material compositions and methods of preparing and extruding the material. Wheat gluten was added as a supportive protein matrix material, together with glycerol as a plasticizer and urea as a denaturant. The extrudate was evaluated with respect to mechanical (tensile testing) and oxygen barrier properties, and the extrudate structure was revealed visually and by scanning electron microscopy. A denser, more homogeneous material had a lower oxygen transmission rate, higher strength, and higher extensibility. The most homogeneous films were made at an extruder die temperature of 125-130 &#176;C. It is shown here that a film can be extruded with promising mechanical and oxygen barrier properties, the latter especially after a final compression molding step.

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

The side stream from plant oil production of Crambe abyssinica has limited value. The purpose of this study was to find methods for extruding materials based on this side stream, demonstrating that products with a higher value can be produced. The extrudates were found to have promising properties.

סרטים שחול של<em&gt; Crambe abyssinica</em&gt; / חיטה גלוטן תערובות

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

פלטפורמת microfluidic עם איתור Multiplexed אלקטרוני למערכות מעקב מרחבית של חלקיקים

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

הזרקת בלוטות תוך-לימפתיות של חלקיקי פולימר מתכלים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video