המחברים מודים לד&quot;ר Pooneh Bagher וד&quot;ר אריקה וסטקוט להערות עריכה בהכנת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי הלאומי ללב, ריאות ודם מכון של המכון הלאומי לבריאות במספרי הפרס R37-HL041026 וR01-HL086483 לSSS וF32-HL107050 לMJS. תוכן זה הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

<ol>
	<li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors.">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circ. Res. 78, 415-423 (1996).</li><li>Crutchley, D. J., Ryan, J. W., Ryan, U. S., Fisher, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradykinin-induced+release+of+prostacyclin+and+thromboxanes+from+bovine+pulmonary+artery+endothelial+cells.+Studies+with+lower+homologs+and+calcium+antagonists.">Bradykinin-induced release of prostacyclin and thromboxanes from bovine pulmonary artery endothelial cells. Studies with lower homologs and calcium antagonists.</a> Biochim. Biophys. Acta. 751, 99-107 (1983).</li><li>Kruse, H. J., Grunberg, B., Siess, W., Weber, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+biologically+active+autacoids+is+regulated+by+calcium+influx+in+endothelial+cells.">Formation of biologically active autacoids is regulated by calcium influx in endothelial cells.</a> Arterioscler. Thromb. 14, 1821-1828 (1994).</li><li>Busse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EDHF:+bringing+the+concepts+together.">EDHF: bringing the concepts together.</a> Trends Pharmacol. Sci. 23, 374-380 (2002).</li><li>Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-activated+K++channels+in+murine+endothelial+cells:+block+by+intracellular+calcium+and+magnesium.">Ca2+-activated K+ channels in murine endothelial cells: block by intracellular calcium and magnesium.</a> J. Gen. Physiol. 131, 125-135 (2008).</li><li>Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+conduction+along+endothelial+cell+tubes+from+mouse+feed+arteries:+confounding+actions+of+glycyrrhetinic+acid+derivatives.">Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives.</a> Br. J. Pharmacol. 166, 774-787 (2012).</li><li>Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+intercellular+Ca2++signaling+in+endothelial+cell+tubes+of+mouse+resistance+arteries.">Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries.</a> Microcirculation. 19, 757-770 (2012).</li><li>Cohen, K. D., Jackson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+hyperpolarization+is+not+required+for+sustained+muscarinic+agonist-induced+increases+in+intracellular+Ca2++in+arteriolar+endothelial+cells.">Membrane hyperpolarization is not required for sustained muscarinic agonist-induced increases in intracellular Ca2+ in arteriolar endothelial cells.</a> Microcirculation. 12, 169-182 (2005).</li><li>Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+morphological+integrity+and+Ca2++signaling+in+freshly+isolated+murine+feed+artery+endothelial+cell+tubes.">Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 301, 773-783 (2011).</li><li>Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+isoform+expression+in+smooth+muscle+cells+and+endothelial+cells+of+hamster+cheek+pouch+arterioles+and+retractor+feed+arteries.">Connexin isoform expression in smooth muscle cells and endothelial cells of hamster cheek pouch arterioles and retractor feed arteries.</a> Microcirculation. 15, 503-514 (1908).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+electrical+conduction+along+endothelial+tubes+of+resistance+arteries+through+Ca2+-activated+K++channels.">Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels.</a> Circ. Res. 110, 1311-1321 (2012).</li><li>Bagher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+intravascular+pressure+activates+endothelial+cell+TRPV4+channels,+local+Ca2++events,+and+IKCa+channels,+reducing+arteriolar+tone.">Low intravascular pressure activates endothelial cell TRPV4 channels, local Ca2+ events, and IKCa channels, reducing arteriolar tone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18174-18179 (2012).</li><li>Faraci, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+vascular+effects+of+angiotensin+II:+new+insights+from+genetic+models.">Cerebral vascular effects of angiotensin II: new insights from genetic models.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 26, 449-455 (2006).</li><li>Emerson, G. G., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+coupling+between+endothelial+cells+and+smooth+muscle+cells+in+hamster+feed+arteries:+role+in+vasomotor+control.">Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control.</a> Circ. Res. 87, 474-479 (2000).</li><li>Ledoux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+inositol+1,4,5-trisphosphate+signaling+in+restricted+spaces+of+myoendothelial+projections.">Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9627-9632 (2008).</li><li>Tran, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Ca2++wavelets+and+the+induction+of+myoendothelial+feedback.">Endothelial Ca2+ wavelets and the induction of myoendothelial feedback.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, 1226-1242 (2012).</li><li>Nausch, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sympathetic+nerve+stimulation+induces+local+endothelial+Ca2++signals+to+oppose+vasoconstriction+of+mouse+mesenteric+arteries.">Sympathetic nerve stimulation induces local endothelial Ca2+ signals to oppose vasoconstriction of mouse mesenteric arteries.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 594-602 (2012).</li><li>Duza, T., Sarelius, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+endothelial+cell+Ca2++in+response+to+mouse+cremaster+muscle+contraction.">Increase in endothelial cell Ca2+ in response to mouse cremaster muscle contraction.</a> J Physiol. 555, 459-469 (2004).</li><li>Colden-Stanfield, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradykinin-induced+increases+in+cytosolic+calcium+and+ionic+currents+in+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.">Bradykinin-induced increases in cytosolic calcium and ionic currents in cultured bovine aortic endothelial cells.</a> Circ. Res. 61, 632-640 (1987).</li><li>Brunner, F., Kukovetz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioligand+binding+to+muscarinic+receptors+of+bovine+aortic+endothelial+cells.">Radioligand binding to muscarinic receptors of bovine aortic endothelial cells.</a> Br. J. Pharmacol. 102, 373-380 (1991).</li><li>Tracey, W. R., Peach, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+muscarinic+receptor+mRNA+expression+by+freshly+isolated+and+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.">Differential muscarinic receptor mRNA expression by freshly isolated and cultured bovine aortic endothelial cells.</a> Circ. Res. 70, 234-240 (1992).</li><li>Adams, D. J., Hill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channels+and+membrane+potential+in+the+modulation+of+intracellular+calcium+in+vascular+endothelial+cells.">Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells.</a> J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).</li><li>Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+isolation+and+characterization+of+single+vascular+smooth+muscle+cells+from+cremasteric+arterioles.">Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles.</a> Microcirculation. 4, 35-50 (1997).</li></ol>

אף אחד.

כאן אנו מתארים את הבידוד של צינורות אנדותל מהים והשימוש בתכשיר זה כדי להמחיש Ca 2 + אירועי איתות בתוך ECs המכונן שלה. הליך זה הותאם מאחד שפותח במקור לבודד צינורות אנדותל מarterioles של שריר Cremaster האוגר 8. ניצול שינויים קלים של הטכניקות שהוצגו כאן, יש לנו לבודד צינורות אנדותל ממגוון רחב של מיטות וכלי דם, כוללים: עורקי הזנה של שריר מפשק אוגר והלחי arterioles כיס 10, עורק ברום הבטן מעולה עכבר 6,7,9, mesenteric עכבר ומוחות עורקים וmicrovessels הלימפה (תצפיות לא פורסמו; אזכור כלולים לבידוד כלי mesenteric 12 וכלי מוחין 13). בידוד צינורות אנדותל מהמיטות כלי דם חדשים עשוי לדרוש שינויים בפרוטוקול המקורי. אם הבידוד הוא לא מוצלח, עדיף להתחיל על ידי שינוי פעמים עיכול:להגדיל את זמן העיכול אם צינורות אנדותל קשים לבודד מתאי שריר חלק וadventitia ולהפחית את זמן עיכול אם צינור אנדותל לא נותר על כנן. אם שינוי זמני עיכול הוא לא מוצלח, התאמת הריכוז של אנזימי עיכול או טמפרטורת העיכול צריכה להישפט. אפשרות נוספת היא להקטין את הקוטר הפנימי של פיפטה טחינה דקה, אשר מגדילה את כוח גזירה בהסרת תאי שריר חלק. הגדלת המהירות של פליטת נוזל יכול להיות גם ניסיתי במשך אותו האפקט, אבל יש יותר סיכוי לפגוע בהכנה. יש להכיר בכך שזה לא יכול להיות אפשרי לבודד צינורות אנדותל ללא פגע מכלי שבו תאי האנדותל אינם מחוברים היטב זה לזה על ידי חלבוני junctional. דיסוציאציה של תאי שריר חלק הבאים עיכול אנזימטי בתחילה בוצעה באמצעות pipettor בסגנון יד 8. יש לנו מעודן הליך טחינה דקה באמצעות microsyrמערכת אינגה, שאפשרה בידוד עקבי של צינורות אנדותל ארוכים יותר (עד 3 מ&quot;מ) 6. בעת שימוש במערכת זו, פיפטה טחינה דקה היא backfilled עם שמן מינרלים כדי לספק עמודת נוזל רציפה בין הבוכנה שליטה בתנועה וPSS המכיל את קטע כלי נוזל. Incompressibility של נוזל יחד עם כוח המניע המתמיד של תוצאות הבוכנה microsyringe בגזירה קבועה כמו הספינה נאלץ באמצעות קצה פיפטה. לעומת זאת, טכניקות ידיים המשמשות לעתים קרובות לתאים מתנערים (למשל לסחוט נורת גומי בסוף פיפטה פסטר) כרוכה בדחיסה של אוויר, אשר מציגה השתנות בלחץ הנהיגה, ובכך גזירה המופעל בקצה פיפטה. ישנם יתרונות רבים להכנת הצינור ללימוד תפקוד האנדותל בmicrovessels. הראשון הוא שתהליך הבידוד מספק אוכלוסיות מובחנות הומוגנית ילידים סלולריות של ECS ו mu החלקתאי scle. מאז ECs יישאר מחובר פיזי כמו צינורות, הם נבדלים מהתאים בודדים שרירים חלקים, אשר שומרים על תצורת &quot;C&quot; אם הם נשארים רגועים במהלך טחינה דקה. סוגים כך בהתאמה תא בקלות נבדלים, למשל, כאשר קבלת דגימות לשיטות מולקולריות כגון PCR בזמן אמת ואימונוהיסטוכימיה 10. מאז צינורות מרובים מבודדים מכלי אחד (או מכלי דו צדדיים כפי שנעשה לים), ניתן לקבל נתונים מולקולריים ונתונים תפקודיים מאותו כלי של בעלי חיים מסוימים. ביטוי כך מולקולרי יכול להיות מתואם עם ההתנהגות הפונקציונלית של האנדותל כלי הדם. יתר על כן, ניתן לפתור אירועי איתות שני פנים ובין תאית מהותיים להאנדותל כלי הדם עצמאיים מהשפעתם של כוחות המודינמית (לחץ, זרימה), סוכני vasoactive נשאו בזרם הדם (למשל הורמונים), או מתאי שריר חלק שמסביב (לדוגמא60; באמצעות צימוד myoendothelial 14-16), עצבי 17, או parenchyma הרקמה 18. חשוב לציין, שכן האנדותל מבודד טרי מmicrovessels המיועד, אין שינוי של פנוטיפ שקשור בדרך אחרת עם culturing ECs 19-21. לדוגמא, ECS תרבית מאבד ביטוי הקולטן מוסקריניים ובכך לשנות את פרופילי סידן האיתות שלהם. יתר על כן, מאפייני אלקטרו של ECs יכולים לשנות בתרבות 22. בגלל ECs הבודד להישאר יחד בערוצי צומת פער פונקציונליים, צינור אנדותל מציג מודל אידיאלי לחקר ההולכה של 2 + אותות חשמליים בין התאים וCa 6,7. צריכים גם להכיר בכך שתאי שריר חלק ניתקו נלמדים בקלות עם טכניקות תיקון מהדק לנתונים משלימים שבסיס תפקוד כלי הדם 23. מגבלה העיקרית למ &#39;צינור אנדותלאודל הוא חוסר היציבות של התכשיר עם הגדלת טמפרטורה. בעוד ההכנות שלנו מהים הוכיחו יציבה ובריאים בטמפרטורת הסביבה חדר (~ 24 ° C) ובמשך כמה שעות ב32 ° C, השפלה מורפולוגיים ופונקציונלית מתרחשת בפחות משעה על 37 ° C 9. הגבלה חשובה שנייה של צינור אנדותל היא האובדן של צמתים myoendothelial ותחומים האיתות הטבועות בם, כי הם חלק בלתי נפרד מתפקוד EC בדפנות כלי הדם בשלמותה 14-16. צריך גם להכיר בכך שבעוד שצינורות ארוכים יותר יאפשר איתות אינטר להיחקר על פני מרחקים גדולים יחסית 6, הכנת הצינורות מסובכת כפי שהם מקבלים יותר, כי זה הופך להיות קשה יותר כדי לנתק באופן מלא המקיף את תאי שריר חלק וadventitia. מצאנו כי צינורות ארוכים יותר מ1-2 מ&quot;מ גם קשים יותר למצב ובטוח בתא הזרימה. בניגוד לכך, בעוד שצינורות קצרים יותר (לדוגמא: &lt;1 מ&quot;מ) ENACa 2 + וחשמל אותות ble להיחקר 8, הם קשה לשמור במהלך superfusion בתא הזרימה. לבסוף, גם עם בידוד אופטימלי של צינורות בילטרלי, יש חומר מספיק לכימות מסורתי של ביטוי חלבון באמצעות כתמים מערביים, אם כי immunolabeling מספק מדד של ביטוי חלבון ולוקליזציה. למרות מגבלות אלה, צינור אנדותל מייצג הכנה חדשנית למתן תובנה חדשה מנגנונים של תפקוד תא אנדותל כלי הדם בגוף חי.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הבידוד של צינורות תא האנדותל מהים העכבר. הים נובע מהדם בעורק ואספקת בית החזה הפנימי מחומצן לשרירי בטן הקדמי. שלנו עובד עם הים כמודל ניתן לייחסו לזה מתן מגזרים ארוכים יחסית, unbranched דם קטן שמתאים גם ללימוד אירועי איתות אינטר בדבר תפקידה הבסיסי של האנדותל בשלטון ותיאום הרפיה תא שריר חלק. למעוניינים ברקמות אחרות מאשר שרירי שלד, מצאנו בטכניקה זו כדי להתאים בקלות להשגת צינורות אנדותל מmicrovessels של מערכת הלימפה במוח, מעיים ו. התכונות העיקריות של שיטה זו הן שאורכים שלמים (1-3 מ&quot;מ) של האנדותל כלי הדם מבודדים, מאובטח נגד coverslip זכוכית בתא זרימה שבו הם superfused עם PSS, וצלמת עבור Ca 2 + איתות 7-9 אומשופד ל6,8 איתות החשמלי. בתוך תא הזרימה, חיצו העליון של צינור חשוף לפתרון superfusion ומגיב להתערבויות ניסיוניות, בעוד החצי התחתון (במגע עם coverslip) מוגן ונשאר שקט. בנוסף ללימוד שני 2 אירועי Ca התוך ואינטר + איתות, צינורות האנדותל יכולים לשמש בזמן אמת PCR כמוני להערכת ביטוי גני 6,10, אימונוהיסטוכימיה לחקור ביטוי חלבון 6,10, ומחקרי אלקטרו להגדיר מאפייני biophysical של 6,11 הולכה חשמליות. ישנם מספר יתרונות להכנת צינור אנדותל ללימוד תפקוד האנדותל. הראשון הוא שתהליך הבידוד מספק הבחנה פשוטה בין שתי אוכלוסיות תאים: תאי האנדותל (שיישארו בהיווצרות צינור) ותאי שריר חלק (ניתקה בנפרד, בדרך כלל &quot;C&quot; בצורה שבירגוע). זה מאפשר לדגימה ומחקר של מאפיינים ייחודיים שבבסיס תרומת תאי בהתאמה לתפקוד כלי סלקטיבית. שנית, מודל זה מאפשר הרזולוציה של איתות אירועים מהותיים לאנדותל, עצמאי מההשפעה של זרימת הדם, המקיף את שריר חלק, עצבים, וparenchyma. שלישית, האנדותל הוא למד תוך מבודד טרי, ובכך להימנע משינויים בגן או ביטוי חלבונים הקשורים בתרבית תאים.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Nitroprusside</td><td>Sigma</td><td>431451</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>USB Products</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma</td><td>P-4762</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>C-8051</td><td></td></tr><tr><td>Dithioerythritol</td><td>Sigma</td><td>D-8255</td><td></td></tr><tr><td>Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes)</td><td>Warner Instruments</td><td>G150-4</td><td></td></tr><tr><td>Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes)</td><td>World Precision Instruments</td><td>4897</td><td></td></tr><tr><td>Nanoliter Injector Microsyringe</td><td>World Precision Instruments</td><td>B203MC4</td><td>Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000</td></tr><tr><td>Micro4 Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm Culture Tubes</td><td>Fisher</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>3-Axis Micromanipulator</td><td>Siskiyou Corp</td><td>DT3-100</td><td>Holding and positioning the pinning pipettes</td></tr><tr><td>Flow Chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27N</td><td></td></tr><tr><td>100-1,000 &amp;micro;l Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3120000062</td><td>For transferring digested vessel segment to the flow chamber</td></tr><tr><td>1 ml Pipette Tips</td><td>Fisher</td><td>02-707-405</td><td>For transferring digested vessel segment to the flow chamber</td></tr><tr><td>Upright Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51W1</td><td>The actual microscope is up to the user</td></tr><tr><td>Spinning Disc Confocal System</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>Confocal imaging is optional</td></tr><tr><td>XR/TURBO EX Camera</td><td>Stanford Photonics</td><td>XR/TURBO EX</td><td>Ideal for our needs; may vary with user</td></tr><tr><td>Piper Control Software</td><td>Stanford Photonics</td><td></td><td>Imaging software for TURBO EX camera</td></tr><tr><td>Stereo Microscrope</td><td>Leica</td><td>MZ8</td><td>may vary with user</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Microdissection Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>#5/45</td><td></td></tr><tr><td>Minutiens Insect Pins</td><td>Austerlitz</td><td>M size 0.15 mm</td><td></td></tr><tr><td>GP Millipore Express PLUS Membrane</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Scoring Device</td><td>Austin Flameworks</td><td>Small Handheld Scoring Tool</td><td>austinflameworks.com</td></tr><tr><td>Compact Pet Trimmer</td><td>Wahl Clipper Corp.</td><td>Model 9966</td><td>Clean well after each use to maintain life</td></tr></tbody></table>

isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries

השליטה על זרימת דם בכלי הדם על ידי ההתנגדות מווסתת את אספקת חמצן וחומרים מזינים במקביל עם ההסרה של חילוף חומרים לפי מוצרים, כפי שהודגמה על ידי פעילות גופנית שרירי שלד. תאי אנדותל (ECs) מרפדים את אינטימה של כל כלי ההתנגדות ולשרת את התפקיד מרכזי בשליטה בקוטר (vasodilation למשל תלוי האנדותל), ובכך, את הגודל וההפצה של זרימת דם לרקמות. הרגולציה של התנגדות כלי דם על ידי ECs הוא התבצע על ידי Ca 2 + איתות תאית, שמובילה לייצור של autacoids diffusible (למשל תחמוצת חנקן ומטבוליטים חומצה הארכידונית) 1-3 וhyperpolarization 4,5 כי לעורר רגיעה תא שריר חלק. לכן הבנה של הדינמיקה של Ca 2 + איתות אנדותל היא צעד מפתח להבנת מנגנונים המסדירים בקרת זרימת דם. בידוד צינורות אנדותל מבטל משתנים מבלבלים קשורים blood בלומן הכלי ועם תאים המקיפים את שריר חלק ועצבי perivascular, אשר אחרת להשפיע על מבנה EC ותפקוד. כאן אנו מציגים את הבידוד של צינורות האנדותל בעורק מעולה ברום הבטן (SEA) באמצעות פרוטוקול מותאם לכלי זה. כדי לבודד צינורות אנדותל מעכבר הרדים, הים הוא את הגבעול באתר כדי לשמור על דם בתוך לומן הכלי (כדי להקל על לדמיין את זה בזמן נתיחה), ואת כל הגיליון של שרירים בטן הוא נכרת. הים הוא גזור חופשי מסביב סיבי שריר שלד ורקמות חיבור, דם סמוק מהלום, ועיכול אנזימטי מתון מתבצע כדי לאפשר הסרת adventitia, עצבים ותאי שריר חלק באמצעות טחינה דקה עדינה. הכנות טריות מבודדים אלה של האנדותל בשלמות לשמור על המורפולוגיה האם שלהם, עם ECs הבודד שנותר בשילוב פונקציונלי זו לזו, תוכל להעביר כימית וחשמלי signals intercellularly דרך צמתים פער 6,7. בנוסף לאספקת תובנה חדשה ביופיסיקה איתות סיד והקרום, הכנות אלה יאפשרו מחקרים מולקולריים של ביטוי גנים ולוקליזציה חלבון בתוך האנדותל כלי הדם מקומי.

יכולות להיות יזם תגובות סידן בצינורות מבודדים טרי אנדותל באמצעות אצטילכולין (ACH). בסרט הזה, צינור אנדותל עמוס 10 מיקרומטר fluo-4 AM האם מגורה עם superfusion של מיקרומטר ACH 1 (סרט 1). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50759/SochaandSegal_movie1.avi" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בסרט.</a> הצבע הוא נרגש ב491 ננומטר ופליטה נרשמת 500-550 ננומטר באמצעות מצלמת מכשיר תשלום מצמידים התעצמה. ערימות תמונה נרכשות ב120 פריימים / השני לתקופה שניות 25 ואז יכולות להיות בממוצע (למשל ל40 מסגרות / sec). תמונות הקרינה נציג לאורך הזמן מוצגות באיור 4. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig1.jpg" width="500px" /> איור 1. תא הזרימה וטפטפות שימוש במהלך הבידוד של צינורות אנדותל. </stro<html> ng&gt;) דוגמאות תא הזרימה מורכבת עם coverslip זכוכית x 50 מ&quot;מ 24 מ&quot;מ כבסיס. ב) (מימין) פיפטה משך (משמאל) ומשך, שבורה, מלוטשת וזווית cannulation. פיפטה זה משמשת כדי לשטוף אריתרוציטים מלומן של העורק לאחר נתיחה. דוגמאות בקנה מידה בר = 200 מיקרומטר. ג) (מימין) פיפטה משך (משמאל) ומשך, שבורה ומלוטשת טחינה דקה. הקוטר הפנימי של פיפטה זה נקבע על ידי הקוטר החיצוני של העורק. דוגמאות בר סולם = 200 מיקרומטר. ד) פיפטה משכה, שבורה ומלוטשת (משך (משמאל) וימין) מצמיד. קצה פיפטה זה מעוגל ואטום לגמרי כדי לאבטח את צינור אנדותל בתא הזרימה. בר = 200 מיקרומטר קנה המידה. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50759/50759fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> class = &quot;jove_content&quot; עבור: לשמור-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig2.jpg" width="500px" /> איור 2. ספינינג מיקרוסקופ confocal דיסק להדמיה של Ca 2 + אותות.) מיקרוסקופ הזקוף המשמש להדמית סידן. (א) יחידת דיסק ספינינג confocal עם מטרות טבילה (ב) התעצמה מצלמה מכשיר תשלום מצמידים. ג) (א) 63X (ב &#39;) NA = 1) ו (ב) 20X (NA = 0.5) המשמש להדמיה. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50759/50759fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig3.jpg" width="500px" /> איור 3. בידוד של השרירים הבטן ועורק ברום הבטן מעולה. </st<html> rong&gt;) מורדם עכבר עם שרירי בטן חשופה ושלחין עם תמיסת מלח 0.9% טמפרטורת חדר. חיצים אדומים מסמנים את האתרים תחת רפידות שומן שבימי בהתאמה להיכנס כל שריר rectus abdominis (כלומר היכן יש מקשרים את כלי דם). בקנה מידה בר = 1 סנטימטר. B) שרירים בטן מבודדים (חד צדדי) וSEA תלו בחדר נתיחה לmicrodissection. חץ אדום מציין את האתר הגדול הראשון של הסתעפות של הים (כלומר, הנקודה שבה ניקוי של הכלי הופסק). בקנה מידה בר = 1 סנטימטר. C) צינור מבודד אנדותל תא מים. תמונת ההפרש התערבות ניגודיות של צינור אנדותל הבא דגירה 1 שעות בטמפרטורת חדר. צינור אנדותל היה superfused עם חיץ superfusion ב3 מיליליטר / דקה. בר = 50 מיקרומטר קנה המידה. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50759/50759fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> ether.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig4.jpg" width="500px" /> איור 4. הקרינה סידן בצינור תא האנדותל. תמונות ניאון נציג של צינור אנדותל בתגובה לגירוי עם אצטילכולין 1 מיקרומטר.) פלואורסצנטי לפני גירוי. ב &#39;) הקרינה צינור אנדותל בזמן ממשל אצטילכולין, t = 0 שניות. C) הקרינה צינור אנדותל ב t = 5 שניות. ד) הקרינה צינור אנדותל ב t = הקרינה 10 שניות. E) אנדותל צינור ב t = 15 שניות הקרינה צינור אנדותל. F) בזמן t = 20 שניות. ברים סולם = 40 מיקרומטר. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50759/50759fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries at JoVE.com

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

אנו מציגים הכנה להדמית מניפולציה סידן איתות בהאנדותל כלי הדם מקומי, ללא פגע. צינורות אנדותל מבודדים טריים מעורקי התנגדות עכבר אספקת שרירים שלד לשמור במורפולוגיה vivo ואיתות דינמית בתוך ובין תאי שכנים. ניתן להכין צינורות אנדותל מmicrovessels של רקמות ואיברים אחרים.

בידוד של כלי הדם האנדותל צינורות מעורקי עכבר התנגדות

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

isolation-microvascular-endothelial-tubes-from-mouse-resistance

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

15.6K Views.  University of Missouri.  אנו מציגים הכנה להדמית מניפולציה סידן איתות בהאנדותל כלי הדם מקומי, ללא פגע. צינורות אנדותל מבודדים טריים מעורקי התנגדות עכבר אספקת שרירים שלד לשמור במורפולוגיה vivo ואיתות דינמית בתוך ובין תאי שכנים. ניתן להכין צינורות אנדותל מmicrovessels ...

Video: Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

הערכה של מנגנוני הבקרה וסקולרית ניצול מיקרוסקופ וידאו מבודד התנגדות העורקים של חולדות

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Medicine

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

Immunology and Infection

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in the endothelium at the transcriptomic and epigenomic levels, resulting in proatherogenic responses. Recently, single-cell RNA sequencing (scRNAseq) and single-cell Assay for Transposase Accessible Chromatin sequencing (scATACseq) studies were performed to determine the transcriptomic and chromatin accessibility changes at a single-cell resolution using the mouse partial carotid ligation (PCL) model. As endothelial cells (ECs) represent a minor fraction of the total cell populations in the artery wall, a luminal digestion method was used to obtain EC-enriched single-cell preparations. For this study, mice were subjected to PCL surgery to induce d-flow in the left carotid artery (LCA) while using the right carotid artery (RCA) as a control. The carotid arteries were dissected out two days or two weeks post PCL surgery. The lumen of each carotid was subjected to collagenase digestion, and endothelial-enriched single cells or single nuclei were obtained. These single-cell and single-nuclei preparations were subsequently barcoded using a 10x Genomics microfluidic setup. The barcoded single-cells and single-nuclei were then utilized for RNA preparation, library generation, and sequencing on a high-throughput DNA sequencer. Post bioinformatics processing, the scRNAseq and scATACseq datasets identified various cell types from the luminal digestion, primarily consisting of ECs. Smooth muscle cells, fibroblasts, and immune cells were also present. This EC-enrichment method aided in understanding the effect of blood flow on the endothelium, which could have been difficult with the total artery digestion method. The EC-enriched single-cell preparation method can be used to perform single-cell omics studies in EC-knockouts and transgenic mice where the effect of blood flow on these genes has not been studied. Importantly, this technique can be adapted to isolate EC-enriched single cells from human artery explants to perform similar mechanistic studies.

We present a method for isolating endothelial cells and nuclei from the lumen of mouse carotid arteries exposed to stable or disturbed flow conditions to perform single-cell omics experiments.

בידוד תאי אנדותל מהלומן של עורקי הצוואר של עכברים לניסויים רב-תאיים חד-תאיים

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של מפרקת מוח עכבר

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone regulation, barrier functions, and angiogenesis. Endothelial cell dysfunction is a hallmark predictor and major driver for the progression of severe cardiovascular diseases, yet the underlying mechanisms remain poorly understood. The ability to isolate and perform analyses on endothelial cells from various vascular beds in their native form will give insight into the processes of cardiovascular disease. This protocol presents the procedure for the dissection of mouse subcutaneous and mesenteric adipose tissues, followed by isolation of their respective arterial vasculature. The isolated arteries are then digested using a specific cocktail of digestive enzymes focused on liberating functionally viable endothelial cells. The digested tissue is assessed by flow cytometry analysis using CD31+/CD45&#8722; cells as markers for positive endothelial cell identification. Cells can be sorted for immediate downstream functional assays or used to generate primary cell lines. The technique of isolating and digesting arteries from different vascular beds will provide options for researchers to evaluate freshly isolated vascular cells&#160;from arteries of interest and allow them to perform a wide range of functional tests on specific cell types.

This protocol details a method for the dissection of mouse adipose depots and the isolation and digestion of respective arteries to liberate and then identify the endothelial cell population. Freshly isolated cells used in downstream applications will advance the understanding of vascular cell biology and the mechanisms of vascular dysfunction.

בידוד וזיהוי של תאי אנדותל וסקולריים ממחסני שומן נפרדים ליישומים במורד הזרם

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone ...

בידוד תאי אנדותל מנימי לימפה עורית מורין

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

מחבר זרקור: בידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל לימפה עורית מורין

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...

בידוד של כלי הדם האנדותל צינורות מעורקי עכבר התנגדות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הערכה של מנגנוני הבקרה וסקולרית ניצול מיקרוסקופ וידאו מבודד התנגדות העורקים של חולדות

בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

בידוד תאי אנדותל מהלומן של עורקי הצוואר של עכברים לניסויים רב-תאיים חד-תאיים

בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של מפרקת מוח עכבר

בידוד וזיהוי של תאי אנדותל וסקולריים ממחסני שומן נפרדים ליישומים במורד הזרם

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation