מחקר במעבדה שלי הוא נתמך על ידי משרד wku של קופות הפעלת ביולוגיה, מחקר wku קרן RCAP-אני מעניק # 11-8032 ועל ידי מענק KBRIN-AREA במימון באמצעות מענק הורה מהמכון הלאומי למדעי רפואה כלליות של המכון הלאומי בריאות תחת מספר הפרסים 5P20GM103436-13. אני רוצה גם להודות ד&quot;ר טיאן שו במעבדה שהכיר לי את הטכניקה הזאת ואת ד&quot;ר ריימונד Pagliarini שהוקמה בטכניקה זו ראשונה במעבדה שו.

1. אינדוקציה של גידולים לא פולשני שפירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במניות רשומות בטבלה 2 לאינדוקציה של גידולים שפירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תרבות המתנע עבור המניה &quot;בוחן&quot; של גנוטיפ הבא: y, w, אי-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A;&gt; y Act5C +&gt; Gal4, כטב&quot;מ-GFP </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תרבות המתנע עבור המניה &quot;נבדקה&quot; של גנוטיפ הבא: w; FRT40A, כטב&quot;מ-V12 ראס / ארגון נוער קתולי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף עשר בתולות מהמלאי &quot;הבוחן&quot; ועשרה זכרים מהמלאי &quot;נבדק&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצות את הזכרים ונקבות מ&quot; הבוחן &quot;והמנייה&quot; נבדקה &quot;על ידי הצבת את שניהם בבקבוקון עם אוכל לטוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הצלב בחממה 25 ° C ולאפשר הזכרים ונקבות להזדווג ולהטיל ביצים ל24-48 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את הבקבוקונים לתצהיר ביצה מספיק ואת הימצאותם של זחלי instar הראשונים ולוודא כי התרבות היא לא להתייבש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כמה טיפות של autoclavedמים מזוקקים לתרבות כדי לשמור אותו הלח (אם התרבות היא התייבשות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך לעקוב אחר התרבות וחזור על שלב 1.7.1 במידת הצורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב נדודי זחלי instar שלישיים תחת סטראו הקרינה כפי שתואר בסעיף 3. </li></ol> 2. אינדוקציה של גידולים פולשניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במניות רשומות בטבלה 2 לאינדוקציה של גידולים פולשניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתרבות המתנע מצעד 1.2 לעיל של גנוטיפ הבא: y, w, אי-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C y&gt; +&gt; Gal4, כטב&quot;מ-GFP </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תרבות המתנע עבור המניה &quot;נבדקה&quot; של גנוטיפ הבא: w;, FRT40A, ראס כטב&quot;מ V12 / ארגון נוער הקתולי LGL 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף עשר בתולות מהמלאי &quot;הבוחן&quot; ועשרה זכרים מהמלאי &quot;נבדק&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצות את הזכרים ונקבות מ&quot; הבוחן &quot;והמנייה&quot; נבדקה &quot;על ידי הצבת את שניהם בבקבוקון עם f זבובood. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הצלב בחממה 25 ° C ולאפשר הזכרים ונקבות להזדווג ולהטיל ביצים ל24-48 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את הבקבוקונים לתצהיר ביצה מספיק ואת הימצאותם של זחלי instar הראשונים ולוודא כי התרבות היא לא להתייבש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כמה טיפות של autoclaved מים מזוקקים לתרבות כדי לשמור אותו הלח (אם התרבות היא התייבשות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך לעקוב אחר התרבות לצעד יובש וחזור על 2.7.1 לפי צורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לזחלי instar שלישיים תחת סטראו הקרינה כפי שתואר בסעיף 3. </li></ol> 3. תצפית של גידולים שפירים ופולשני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זחלי instar שלישיים לבידוד גידול שפיר וויזואליזציה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרטב מברשת צבע במים מזוקקים, ובאמצעות מברשת צבע זה לגרד כמה זחלי instar שלישיים מהקיר של בקבוקון התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח זחלים בשקופית דיכאון עם 1X PBS ולאחר מכן באמצעות גרוטאות מברשת צבע רטובותדואר את כל חומר מזון מהאפידרמיס הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הזחלים בצלחת פטרי ולהשאיר במקפיא -20 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לשתק את הזחל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטה חלופית כדי לשתק זחלים באמצעות FLYNAP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את שרביט FLYNAP טבול בFLYNAP לבקבוקון מ3.1.3.2 ולאחר חיבור הבקבוקון פקוק בואו בקבוקון עם זחלים לעמוד 30-40 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הזחל המשותק בשקופית זכוכית, להוסיף טיפה של שמן halocarbon אור, מכסה עם מכסה זכוכית ולהתבונן תחת סטראו הקרינה עם היכולת לדמיין חלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זחלי נושאות גידול השפירים יהיו לזרוח ירוקים באזור הקדמי שבו מורכב cephalic הוא הווה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר יום 10 זחלים (אחרי גיוס) מהתרבות שנקבעה בשלב המס &#39;2 לעיל לתצפית של גידולים פולשניים. יום 10 זחלים נבחרו בגלל שיש לי זחלי נושאות גידול פולשני l מורחבשלב Arval ובאופן כללי לא מצליח pupariate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב 3.1.1 צעדים ל3.1.4 אלא שבמקום יום שימוש זחלי instar השלישי 10 זחלים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זחלי נושאות גידול פולשני יום 10 יהיו לזרוח ירוקים באזור הקדמי שבו מורכב cephalic הוא הווה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במצלמה דיגיטלית ואז לקחת תמונות של זחלי נושאות גידול השפירים ופולשנית fluorescing. </li></ol> 4. Dissection של התצפית מורכבת ונוספת מסוג cephalic של גידולים שפירים ופולשני האפידרמיס השקוף של הזחל מקשה לשמור על המידה של פלישה של גידולים. כך המידה של פלישה היא מדמיין טוב יותר על ידי ביתור מורכב cephalic מהזחל. צריכים להיות מנוצלים בשלבים הבאים כדי לנתח מורכב cephalic. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מברשת צבע רטובה בחר זחלים שלישיים instar (לגידולים שפירים) ויום 10 זחלים (עבור גידולים פולשניים) from צלוחיות התרבות, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח זחלים בטוב של צלחת לנתיחה המכילה קר 1X PBS. השתמש במברשת צבע כדי לגרד את כל חלקיקי מזון מן האפידרמיס הזחל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הזחלים נקיים גם טרי של הצלחת לנתיחה המכילה קר 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק לנוכחות של הקרינה ה-GFP באמצעות סטראו מסוגל לאתר הקרינה. בטל זחלים אינן נושאים ה-GFP. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 1.0ml של קר 1X PBS ולטרי על הצלחת לנתיחה ובאמצעות זוג המלקחיים להעביר זחל נושאת או גידולים שפירים או פולשני (פרוטוקול הנתיחה נשאר זהה לאלה שני סוגים של גידולים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את הזחל מטה בעזרת זוג מלקחיים על 2/3rds מהקצה הקדמי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג מלקחיים האחר וזריזות להפריד 1/3rd האחורי של הזחל וזורקים אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עזוב את 2/3rds הקדמי של הזחל. ככל שהלחץ בתוך הזחל משתחרר תוכןזחל יהיה לטפטף מתוך חלל הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג מלקחיים כדי להסיר את הבטן, שומן גוף ואת התוכן פנימי אחר של הזחל שניגר מתוך חלל הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג המלקחיים להחזיק את הקרס בפה של הזחל ולדחוף אותו לתוך האפידרמיס הזחל ובאמצעות זוג מלקחיים האחר להפוך את הזחל לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים בעדינות ובזהירות כדי להסיר את השומן בגוף, בלוטות רוק, מעיים, מורכבת דיסק כנף וכל צינורות לקנה הנשימה. מורכב cephalic צריך להיות גלוי כעת מחובר לקרס הפה של הזחל ההפוך. אונות המוח ואת חוט עצב הגחון (VNC) עדיין תהיינה מחוברים לאפידרמיס הזחל דרך העצבים הנובעים מVNC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג מלקחיים כדי לשבור בעדינות את הקשרים בין עצבי cephalic והאפידרמיס הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , שיתוף cephalic כמו חיבורי העצב בין VNC והאפידרמיס הזחל שבורים וגוף עודף שומן ורקמות אחרות הוסרוmplex יהיה ברור לעין ויצורף האפידרמיס הזחל רק בווי הפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורכב cephalic ניתן להשאיר מצורף האפידרמיס הזחל אם מורכב צריך להיות קבוע עבור יישומים במורד הזרם כמו מכתים נוגדן או להדמיה מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אין יישומים נוספים במורד הזרם הייתי להתבצע לאחר מכן מורכב cephalic יכול להיות מנותק מן האפידרמיס הזחל והניח בטיפת גליצרול תקשורת הרכבה המבוסס על התבוננות וניתוח נוספים. השתמש Vectashield כתקשורת הרכבה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bale, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+and+human+disease.">Hedgehog signaling and human disease.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 47-65 (2002).</li><li>Bier, E., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+an+emerging+model+for+cardiac+disease.">Drosophila, an emerging model for cardiac disease.</a> Gene. 342, 1-11 (2004).</li><li>Coombs, G. S., Covey, T. M., Virshup, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+in+development,+disease+and+translational+medicine.">Wnt signaling in development, disease and translational medicine.</a> Curr Drug Targets. 9, 513-531 (2008).</li><li>Gistelinck, M., Lambert, J. C., Callaerts, P., Dermaut, B., Dourlen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+tauopathies:+what+have+we+learned.">Drosophila models of tauopathies: what have we learned.</a> Int J Alzheimers Dis. 2012, 970980 (2012).</li><li>Marsh, J. L., Thompson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+in+the+study+of+neurodegenerative+disease.">Drosophila in the study of neurodegenerative disease.</a> Neuron. 52, 169-178 (2006).</li><li>Reiter, L. T., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Drosophila+melanogaster+to+uncover+human+disease+gene+function+and+potential+drug+target+proteins.">Using Drosophila melanogaster to uncover human disease gene function and potential drug target proteins.</a> Expert Opin Ther Targets. 6, 387-399 (2002).</li><li>Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+and+functions+of+beta-catenin.">The many faces and functions of beta-catenin.</a> EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+Drosophila+for+metastatic+behavior.">A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior.</a> Science. 302, 1227-1231 (2003).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+in+Drosophila.">A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila.</a> Nat Protoc. 1, 2583-2589 (2006).</li><li>Boccaccio, C., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+growth:+a+MET-driven+genetic+programme+for+cancer+and+stem+cells.">Invasive growth: a MET-driven genetic programme for cancer and stem cells.</a> Nat Rev Cancer. 6, 637-645 (2006).</li><li>Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+remodeling+is+essential+for+Drosophila+disc+eversion+and+tumor+invasion.">Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2721-2726 (2007).</li><li>Wang, W., Eddy, R., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cofilin+pathway+in+breast+cancer+invasion+and+metastasis.">The cofilin pathway in breast cancer invasion and metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 7, 429-440 (2007).</li><li>Brand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+as+a+cell+and+developmental+marker+in+the+Drosophila+nervous+system.">GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system.</a> Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).</li><li>Brand, A. H., Dormand, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GAL4+system+as+a+tool+for+unravelling+the+mysteries+of+the+Drosophila+nervous+system.">The GAL4 system as a tool for unravelling the mysteries of the Drosophila nervous system.</a> Curr Opin Neurobiol. 5, 572-578 (1995).</li><li>Vidal, M., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+for+cancer+research.">Drosophila models for cancer research.</a> Curr Opin Genet Dev. 16, 10-16 (2006).</li><li>Parks, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+generation+of+high-resolution+deletion+coverage+of+the+Drosophila+melanogaster+genome.">Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome.</a> Nat Genet. 36, 288-292 (2004).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+techniques+for+studying+Drosophila+development.">Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development.</a> Development. 130, 5065-5072 (2003).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li><li>Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+tumor+suppressors+in+genetic+mosaics:+the+Drosophila+lats+gene+encodes+a+putative+protein+kinase.">Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase.</a> Development. 121, 1053-1063 (1995).</li><li>Rebay, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+novel+components+of+the+Ras/Mitogen-activated+protein+kinase+signaling+pathway+that+interact+with+the+yan+gene+of+Drosophila+identifies+split+ends,+a+new+RNA+recognition+motif-containing+protein.">A genetic screen for novel components of the Ras/Mitogen-activated protein kinase signaling pathway that interact with the yan gene of Drosophila identifies split ends, a new RNA recognition motif-containing protein.</a> Genetics. 154, 695-712 (2000).</li><li>Therrien, M., Morrison, D. K., Wong, A. M., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+modifiers+of+a+kinase+suppressor+of+Ras-dependent+rough+eye+phenotype+in+Drosophila.">A genetic screen for modifiers of a kinase suppressor of Ras-dependent rough eye phenotype in Drosophila.</a> Genetics. 156, 1231-1242 (2000).</li><li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+in+vitro+assay+for+quantitating+the+invasive+potential+of+tumor+cells.">A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells.</a> Cancer Res. 47, 3239-3245 (1987).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J Cell Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+in+vivo+models+of+neoplasia.">New developments in in vivo models of neoplasia.</a> Cancer Metastasis Rev. 10, 191-192 (1991).</li><li>Mueller, B. M., Romerdahl, C. A., Trent, J. M., Reisfeld, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+spontaneous+melanoma+metastasis+in+scid+mice+with+an+antibody+to+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Suppression of spontaneous melanoma metastasis in scid mice with an antibody to the epidermal growth factor receptor.</a> Cancer Res. 51, 2193-2198 (1991).</li><li>Konantz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+xenografts+as+a+tool+for+in+vivo+studies+on+human+cancer.">Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer.</a> Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).</li><li>McIntyre, R. E., vander Weyden, L., Adams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+gene+discovery+in+the+mouse.">Cancer gene discovery in the mouse.</a> Curr Opin Genet Dev. 22, 14-20 (2012).</li><li>Mattison, J., vander Weyden, L., Hubbard, T., Adams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+gene+discovery+in+mouse+and+man.">Cancer gene discovery in mouse and man.</a> Biochim Biophys Acta. 1796, 140-161 (2009).</li><li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila.">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 4, 753-761 (2011).</li><li>Stefanatos, R. K., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila:+a+bold+past,+a+bright+future.">Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future.</a> J Genet Genomics. 38, 431-438 (2011).</li><li>Beaucher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+brain+tumor+metastases+express+both+neuronal+and+glial+cell+type+markers.">Drosophila brain tumor metastases express both neuronal and glial cell type markers.</a> Dev Biol. 301, 287-297 (2007).</li><li>Beaucher, M., Hersperger, E., Page-McCaw, A., Shearn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+ability+of+Drosophila+tumors+depends+on+MMP+activity.">Metastatic ability of Drosophila tumors depends on MMP activity.</a> Dev Biol. 303, 625-634 (2007).</li><li>Joyce, J. A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+metastasis.">Microenvironmental regulation of metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).</li><li>Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+cell+polarity+drives+tumor+growth+and+invasion+through+JNK+activation+in+Drosophila.">Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila.</a> Curr Biol. 16, 1139-1146 (2006).</li><li>Uhlirova, M., Jasper, H., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cell-autonomous+induction+of+tissue+overgrowth+by+JNK/Ras+cooperation+in+a+Drosophila+tumor+model.">Non-cell-autonomous induction of tissue overgrowth by JNK/Ras cooperation in a Drosophila tumor model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13123-13128 (2005).</li><li>Uhlirova, M., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JNK-+and+Fos-regulated+Mmp1+expression+cooperates+with+Ras+to+induce+invasive+tumors+in+Drosophila.">JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila.</a> EMBO J. 25, 5294-5304 (2006).</li><li>Menut, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mosaic+genetic+screen+for+Drosophila+neoplastic+tumor+suppressor+genes+based+on+defective+pupation.">A mosaic genetic screen for Drosophila neoplastic tumor suppressor genes based on defective pupation.</a> Genetics. 177, 1667-1677 (2007).</li><li>Wu, M., Pastor-Pareja, J. C., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+Ras(V12)+and+scribbled+clones+induces+tumour+growth+and+invasion.">Interaction between Ras(V12) and scribbled clones induces tumour growth and invasion.</a> Nature. 463, 545-548 (2010).</li></ol>

אין לי מה לחשוף.

הסרטן הוא מחלה מורכבת עם הבנה הרבה יותר טובה היום מאשר בעבר. עם זאת, הרבה עדיין צריכה ללמוד והסביר לפני שיש לנו תמונה של המנגנונים שלמה. הפרוטוקול פשוט שהוצג כאן מאפשר לגרום גנטי גידולים שפירים ופולשני בהאורגניזם כולו ולאחר מכן ללמוד את הביולוגיה הקשורים להתפתחות של ...

התפתחות של גידולים משפירים למצב גרורתי היא תהליך חכם צעד שמאופיין בהתחמקות ממנגנוני הגנה בגוף נוכחי 8. לדוגמא תאים סרטניים בגוף חייבים להיות מסוגלים להתחמק ממערכת החיסון ואפופטוזיס, פריצת דרך המטריצה ​​תאית מיוחדת (ECM) הנקראת קרום במרתף, ולהתגבר על כל פקדים חברתיים שהוטלו על ידי התאים המקיפים את 8. זוהי דרך התקדמות חכמה צעד שהתאים הסרטניים לרכוש את היכולת להעביר וליישב אתרים מרוחקים בתהליך הנקרא גרורות. ההבנה של אופן שבו התאים הסרטניים מתגבר על החסמים שהוטלו על ידי הגוף שלנו היא עדיין בחיתוליו, לעומת זאת, התמונה המצטיירת ממחקר שנעשתה עד כה מצביע על שימוש חוזר של תהליכים התפתחותיים נורמלים ומסלולי איתות על ידי התאים הסרטניים 11-13. זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster תרם מאוד לunderstanding של התפתחות נורמלית ומחלה באמצעות שימוש בטכניקות גנטיות מתוחכמות שפותחו בעשורים האחרונים 14-17. באמצעות mutagenesis וכלי ביטוי יתר שהגענו להבנה טובה יותר של אונקוגנים שונים וגני מדכאי סרטן 18-22. עם זאת, גרורות סרטניים היא תוצאה של שיתוף פעולה בין כמה נגעים גנטיים שנחקר בעיקר במודלים של תרבית תאי 23,24 כמו גם מודלים xenograft שונים 25-27. יש מודלים אלו אם כי עוצמה המגבלות שלהם כמו שהם לא לחקות לחלוטין את התנאים נמצאו בכל יצור חי. יתר על כן, מודלים מהונדסים זמינים בעכברים הם מסורבלים ולא תורם לניתוח גנטי של התנהגות 28,29 פולשנית. מספר מחקרים ניסו להבין פלישה של תאים סרטניים בדרוזופילה 30,31. טכניקות אלו בעיקר לנצל השתלה של גידולים ראשוניים למארחים ולאחר מכן מסתמכות על מעקב טרהnsplanted גידולים לפלישה לרקמות שכנות 32,33. טכניקה רבת עוצמה בשם MARCM 10 הותאמה על ידי Pagliarini ושו למודל פלישת גידול בדרוזופילה 9. דוגמנות גנטית אלגנטית זה של פלישת גידול ניצלה את שיתוף הפעולה בין אונקוגן הופעל ואובדן קוטביות תא. כוחו של דוגמנות זה טמון בעובדה שהגידולים פולשניים נוצרים באורגניזם שלם ובכך לעקוף את הצורך בהשתלה של רקמות. כדי להביא לשיתוף פעולה בשעור, אונקוגן הופעל כמו ראס V12 מתבטא בשיבוטים של תאים בדיסק עיניים מחושים הזחל. כתוצאה מטכניקת MARCM שיבוטים אלה גם מסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) להדמיה קלה ונעשים הומוזיגוטים למוטציות קוטביות תא כמו זחלים קטלניים ענק, שרבט, ודיסקים גדולים. התוצאה היא ה-GFP מתויגת גידולים פולשניים ב מורכב cephalic. בדו&quot;ח זה אניתדגים כיצד לגרום, ולחזות גידולים פולשניים אלה הן בהקשר של זחלים שלמים והמורכב בcephalic גזור החוצה. האינדוקציה הגידול המובאת כאן מנצלת חומרים כימיים בכרומוזום השני של דרוזופילה. בטבלה 2, אני מספק רישום של מניות על כרומוזומים X ו -3 שניתן לנצלם לאותה מטרה. אני מאמין כי פרוטוקול פשוט זו יהפוך את הטכניקה הזו נגישה לחוקרים המעוניינים בהבנת הבסיס המולקולרי של התקדמות גידול.

<table><tbody><tr><td>10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution</td><td>Invitrogen, Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chilled 1X PBS pH7.2 working solution</td><td>Invitrogen, Sigma Aldrich</td><td></td><td>Make fresh and refrigerate, can be used up to a week</td></tr><tr><td>Flynap</td><td>Carolina Biologicals</td><td></td><td>Fly anesthesia needed to anesthetize larvae</td></tr><tr><td>Fixative</td><td>0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde</td><td></td><td>Needed to fix the dissected cephalic complex</td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td>Several</td><td></td><td>Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube</td></tr><tr><td>1.7ml Eppendorf tube</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass slides, cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Mounting Media or any other mounting media</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon 200 or 700 Oil</td><td>Polysciences Inc. or Halocarbon.com</td><td></td><td>Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope</td></tr><tr><td>Sally Hansen &quot;Hard as Nails&quot; nail polish</td><td>Can be found at any general merchandise store</td><td></td><td>Needed to seal the edges of Coverslip</td></tr><tr><td>A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope</td><td>Leica and others</td><td></td><td>Needed to observe the GFP fluorescence in larvae</td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paint Brush</td><td>Can be found at any general merchandise store</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table 1.&lt;/strong&gt; Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article.</td></tr></tbody></table>

a protocol for genetic induction and visualization of benign and invasive tumors in cephalic complexes of drosophila melanogaster

דרוזופילה האירה את ההבנה של הבסיס הגנטי של התפתחות מחלה ורגילה שלנו בעשורים האחרונים, וכיום היא ממשיכה לתרום הרבה מאוד להבנה של מחלות מורכבות 1-7 שלנו. התפתחות של גידולים משפירים למצב גרורתי היא אירוע מורכב 8 וכבר הדגם בדרוזופילה כדי לעזור לנו להבין טוב יותר את הבסיס הגנטי של מחלה זו 9. כאן אני מציג פרוטוקול פשוט כדי לגרום גנטי, להתבונן ולאחר מכן לנתח את ההתפתחות של גידולים בזחלי דרוזופילה. טכניקת האינדוקציה הגידול מבוססת על מערכת MARCM 10 ומנצלת את שיתוף הפעולה בין אונקוגן הופעל, ראס V12 ואובדן של גנים קוטביות תא (שרבט, דיסקי זחלים ענק גדולים וקטלניים) כדי ליצור גידולים פולשניים 9. אני אדגים כיצד ניתן דמיינו גידולים אלה בזחלים ללא פגע ואז איך אלה יכולים להיות גזורים החוצה לניתוח נוסף. הפרוטוקול פשוטים שהוצג כאן צריך לעשות את זה אפשרי עבור טכניקה זו כדי להיות מנוצל על ידי חוקרים מעוניינים בהבנת תפקידו של גן בפלישת גידול.

כתוצאה מהפרוטוקול מובאת כאן המשתמש יהיה מסוגל לגרום לגידולים שפירים על ידי overexpressing אונקוגן הופעל בדיסק דמותי מחושים עיני הזחל. משתמש גם תוכל לגרום לגידולים פולשניים בדיסק המחושים העין על ידי overexpressing אונקוגן הופעל בשיבוטים של תאים גם למוטציה גנטית קוטביות תא. הגידו?...

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster at JoVE.com

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

שיתוף פעולה בין אונקוגן הופעל כמו RAS V12 ומוטציות בגנים קוטביות תא כמו שרבטה, לגרום לצמיחת גידול בדרוזופילה שבו תאים סרטניים גם להציג התנהגויות פולשנית. הנה פרוטוקול פשוט לאינדוקציה והתבוננות בגידולים שפירים ופולשנית מוצג.

פרוטוקול גנטי אינדוקציה ויזואליזציה של גידולים שפירים ופולשני בסוג cephalic מכלולי<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

a-protocol-for-genetic-induction-visualization-benign-invasive-tumors

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

9.5K Views.  Western Kentucky University.  שיתוף פעולה בין אונקוגן הופעל כמו RAS V12 ומוטציות בגנים קוטביות תא כמו שרבטה, לגרום לצמיחת גידול בדרוזופילה שבו תאים סרטניים גם להציג התנהגויות פולשנית. הנה פרוטוקול פשוט לאינדוקציה והתבוננות בגידולים שפירים ופולשנית מוצג. 

Video: A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Cancer Research

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue organization. Drosophila melanogaster has emerged as a popular experimental model system in cancer biology to study the genetic and cellular mechanisms of tumorigenesis. In particular, genetic tools for Drosophila imaginal discs (developing epithelia in larvae) enable the creation of transformed pro-tumor cells within a normal epithelial tissue, a situation similar to the initial stages of human cancer. A recent study of tumorigenesis in Drosophila wing imaginal discs, however, showed that tumor initiation depends on the tissue-intrinsic cytoarchitecture and the local microenvironment, suggesting that it is important to consider the region-specific susceptibility to tumorigenic stimuli in evaluating tumor phenotypes in imaginal discs. To facilitate phenotypic analysis of tumor progression in imaginal discs, here we describe a protocol for genetic experiments using the GAL4-UAS system to induce neoplastic tumors in wing imaginal discs. We further introduce a diagnosis method to classify the phenotypes of clonal lesions induced in imaginal epithelia, as a clear classification method to discriminate various stages of tumor progression (such as hyperplasia, dysplasia, or neoplasia) had not been described before. These methods might be broadly applicable to the clonal analysis of tumor phenotypes in various organs in Drosophila.

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

Mosaic clone analysis in Drosophila imaginal disc epithelia is a powerful model system to study the genetic and cellular mechanisms of tumorigenesis. Here we describe a protocol to induce tumors in Drosophila wing imaginal discs using the GAL4-UAS system, and introduce a diagnosis method to classify the tumor phenotypes.

אינדוקציה ואבחון של גידולים ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; אפיתלציה דיסק Imaginalia

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector

This protocol describes the allotransplantation of tumors in Drosophila melanogaster using an auto-nanoliter injection apparatus. With the use of an autoinjector apparatus, trained operators can achieve more efficient and consistent transplantation results compared to those obtained using a manual injector. Here, we cover topics in a chronological fashion: from the crossing of Drosophila lines, to the induction and dissection of the primary tumor, transplantation of the primary tumor into a new adult host and continued generational transplantation of the tumor for extended studies. As a demonstration, here we use Notch intracellular domain (NICD) overexpression induced salivary gland imaginal ring tumors for generational transplantation. These tumors can first be reliably induced in a transition-zone microenvironment within larval salivary gland imaginal rings, then allografted and cultured in vivo to study continued tumor growth, evolution, and metastasis. This allotransplantation method can be useful in potential drug screening programs, as well as for studying tumor-host interactions.

Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector

This protocol provides detailed guidance for the initial and continued generational allotransplantation of Drosophila tumors into the abdomen of adult hosts for studying various aspects of neoplasia. Using an autoinjector apparatus, researchers can achieve improved efficiency and tumor yields compared to those achieved by traditional, manual methods.

אלוטרנספלנטציה של גידול בדרוזופילה מלנוגסטר עם מזרק אוטו-ננולטר הניתן לתכנות

This protocol describes the allotransplantation of tumors in Drosophila melanogaster using an auto-nanoliter injection apparatus. With the use of an ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Biology

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Developmental Biology

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

התנהגות Assay עבור Mechanosensation של MARCM מבוסס משובט ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Neuroscience

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

פרוטוקול גנטי אינדוקציה ויזואליזציה של גידולים שפירים ופולשני בסוג cephalic מכלולי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ה

אינדוקציה ואבחון של גידולים ב

אלוטרנספלנטציה של גידול בדרוזופילה מלנוגסטר עם מזרק אוטו-ננולטר הניתן לתכנות

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית

הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

התנהגות Assay עבור Mechanosensation של MARCM מבוסס משובט ב

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב