אנו מודים לד&quot;ר צ&#39;רלס גרינברג לשימוש במכשיר ה-PCR בזמן האמת שלו. עבודה זו נתמכת על ידי מרכז לחקר סרטן MUSC הולינגס הפעלת קרן, הולינגס מרכז הסרטן ACS IRG, ASCO Conquer פרס פיתוח קריירת קרן הסרטן, NIH 1K08HL 103780-01A1, וNIH 3P30CA138313-01S3. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות או סוכני מימון אחרים.

1. בידוד תאי מח עצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים תורמים עכברי FVB / ניו ג&#39;רזי ועכברים ממין נקבת FVB / ניו ג&#39;רזי באמצעות שיטת 2 CO ואחרי עקירת צוואר רחם זכרים. התאים הנקביים FVB / ניו ג&#39;רזי מח העצם ישמשו כתאים תחרותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים ומלקחיים קטנים, לנתח את עצמות ירך וtibiaes מעכברים ולמקם אותם בצלחת תרבית רקמה 60 מ&quot;מימ המכילה 6 מ&quot;ל קר כקרח RPMI1640 עם FBS המומת חום 5%. השתמש רקמת kimwipe להסיר שרירים ורקמות אחרות. חותך את שני הקצוות של כל פיר עצם בצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הקצה של העצם עם מחט 23 ז במזרק סמ&quot;ק 3, לשטוף את מח עצם עם RPMI1640 עם FBS המומת חום 5% למנה. Disaggregate רקמות מוח עצם על ידי שאיפות חוזרות ונשנות תוך שימוש באותה המחט. להעביר את השעית התא לצינור צנטריפוגה מ&quot;ל 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התאים למשך 5 דקות ב 400 XG, להסיר את supernatant, resuspend התאים ב1 מ&quot;ל של חיץ טמפרטורת חדר תאי דם אדום תמוגה (155 mM pיקרבונט otassium, כלוריד אמוניום 10 מ&quot;מימ, 0.1 מ&quot;מ של EDTA, pH = 7.4) ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ואז להוסיף 5-10 מ&quot;ל של RPMI 1640 עם FBS המומת חום 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים דרך מסננת תא. לאסוף את הזרימה דרך לצינור חדש. ספין למטה למשך 5 דקות ב 400 x גרם. הסר את supernatant; תא הגלולה לא תכיל כל צבע אדום. היעדר הצבע אדום מציין הסרה מלאה של תאי דם אדומים. Resuspend התא גלול ב 10 מ&quot;ל של RPMI1640 עם FBS המומת חום 5%. מערבולת בעדינות כדי לוודא השעית התא היא אחידה לחלוטין. קח aliquot וספירת התאים בhemacytometer. לחשב כמה נפח של תאים הנחוצים להשתלת מח עצם ומספיק תאי aliquot ולערבב תאי תורם גברים עם תאים נקביים מתחרים ביחס 05:02. ספין למטה למשך 5 דקות ב 400 XG, לשטוף עם PBS, resuspend ב PBS עם הריכוז הסופי של תאי תורם ב5 × 10 תאים 6 / מ&quot;ל ומתחרה ב2 × 10 6 </sup&gt; / מ&quot;ל. </li></ol> 2. השתלת מח עצם תחרותית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים ממין נקבה להקרין נמען (8-12 wks גיל) עם רדיאטור קרני גמא 137Cs במנה אחת של 4-6 שעות 11Gy לפני השתלת מח עצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את נקבות עכברים המוקרנים בעוצרים עכבר. הזרק תורם המעורב ותאים מתחרים דרך וריד זנב ב0.1 מ&quot;ל של נפח באופן שכל עכבר מקבל 5 × 10 5 תאים תורמים ו2 × 10 5 תאי מח עצם מתחרה מוחלט. </li></ol> 3. אוסף מדגם שבועות זוגות לאחר השתלת מח עצם, לאסוף דגימות דם היקפיות (~ 50 μl) מעכבר נמען נשי על ידי דימום רטרו מסלולית בתנאי הרדמה. דגימות נאספות לתוך צינורות מצופים EDTA. דגימות BM יכולות גם להיות שנאספו בסוף הניסוי, לפחות 4 חודשי השתלת הודעה בדרך כלל, עם את הנוהל כמו שתואר קודם (שלב 1);% בדרך כלל 20-40 של1 תאי BM שוקה הם מספיק לעשות מספיק כמות של ה-DNA. דגימות דם או BM מגיל עכברים נורמלים נקביים וזכריים מתאימים גם נאסף להכין עקומת סטנדרט. 4. בידוד הדנ&quot;א הגנומי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 × נפח של טמפרטורת חדר RBC תמוגה חיץ (~ 200 μl) לכל דגימת דם. מערבב היטב ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. הוסף 1 מ&quot;ל של PBS, אז ספין למטה כדי להסיר את רוב RBC lysed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד דנ&quot;א באמצעות ערכת חילוץ דנ&quot;א דם (ערכת חילוץ דם DNA QIAmp). החיץ טרום החם elution (ע&quot;א) על 37 מעלות צלזיוס כדי לשפר את התשואה של דנ&quot;א eluted. DNAs זכר ונקבה לעקומת סטנדרט מבודד באופן דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) הדנ&quot;א הגנומי יכול להיות מטוהר נוסף או מרוכז בשיטת משקעי EtOH בנוכחות נתרן יצטט M 3 (pH = 5.5). את כדורי DNA מכן resuspended במים מזוקקים 40-50 μl לניתוח באופן מיידי או מאוחסנים ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ה-DNA concentration עם פוטומטר הספקטרום Nanodrop ND-1000. דגימות עם OD 260/280 בין 1.8-2.0 משמשות לניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל DNA עם DNAase החופשי H 2 O ל4ng/μl בהיקף כולל של 50 μl. </li></ol> 5. הכנת עקומת סטנדרט דלל DNA הגברי והנשי DNA לריכוז של 4 ng / μl, ולהפוך את תערובת ה-DNA על פי הטבלה 1 <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> % של ה-DNA הגברי ברקע נקבה </td><td> נפח (μl) של ה-DNA הגברי 4ng/μl </td><td> נפח (μl) של ה-DNA הנשי 4ng/μl </td><td> נפח כולל (μl) </td></tr><tr><td> 0.2 </td><td> 1 </td><td> 499 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 0.5 </td><td> 1 </td><td> 199 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 2.5 </td><td> 5 </td><td> 195 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 12.5 </td><td> 25 </td><td> 175 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 87.5 </td><td> 175 </td><td> 25 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 200 </td><td> 0 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. הכנת דוגמאות לעקומת סטנדרט. עכברי זכרים ונקבה רגילים FVB / ניו ג&#39;רזי בגיל 8-12wks הוקרבו. תאי דם וBM נאספו. DNAs מתאים זכריים ותאים נקביים היינו מבודד ומחדש הושעה-בריכוז של 4ng/μl. את DNAs הזכר והנקבה היה מעורב ביחסים שונים על מנת ליצור את התערובות הסטנדרטיות מדגם DNA. 6. בזמן האמת PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את צלחת תגובת PCR על ידי ערבוב ירוק מגיב SYBR supermix עם פריימרים וDNA גנומי. נפח הריאקציה (20 μl) מכיל 400 ננומטר של כל מאיץ ו5 μl של הדנ&quot;א הגנומי תאי דם (μl X5 4ng/μl = 20 ng) בכל תגובה. דנ&quot;א sampהלס וסטנדרטים הוקמו בשלושה עותקים. הרצפים של primers מוצגים בטבלה 2. </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם גן </td><td> קדימה </td><td> הפוך </td></tr><tr><td> Bcl2 </td><td> 5&#39;-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA </td><td> 5&#39;-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG </td></tr><tr><td> Zfy1 </td><td> 5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA </td><td> 5&#39;-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC </td></tr></tbody></table> טבלת 2. רצף פריימר RT-PCR לBcl2 העכברי וZfy1. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבצע תגובת PCR שימוש במכשיר ה-PCR Biorad iQ5 בתנאים הבאים: 95 ° C 3 דקות, 42 מחזורי ההגברה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 58 מעלות צלזיוס למשך 25 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, ואחרי התכה עקומה צעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג סף ערכי מחזור (CT) על ידי מערכת Bio-Rad iQ5 2.1 Standard Edition אופטית. החישוב δCt (CT Zfy1 &lt;/ Sup&gt;-CT Bcl2) ערך, ורמת הביטוי Zfy1 מחושבת כערך של Ct 2-δ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים עקומות סטנדרטיות עבור כל סדרת תגובה באמצעות קריאה 2-δCt מתערובות ידועות גברים / נשים רגילות. העקומות הרגילות נוצרות על ידי קשירת קשר ערך הממוצע של 2-δCt של triplicates ל% DNA הגברי הידוע בתערובת עם הולם רגרסיה לינארית. </li></ol>

<ol>
	<li>McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells,+determined+by+quantitative+marrow+transplantation+into+irradiated+mice.">The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice.</a> Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).</li><li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress.">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119, 4898-4907 (2012).</li><li>Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+enhancement+of+donor+hematopoietic+cell+engraftment+by+the+CXCR4+antagonist+AMD3100+in+a+mouse+transplantation+model.">Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model.</a> PLoS One. 5, e11316 (2010).</li><li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice.">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li><li>Taketo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FVB/N:+an+inbred+mouse+strain+preferable+for+transgenic+analyses.">FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).</li><li>Morisaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+analysis+using+a+Y-chromosome-specific+probe+following+bone+marrow+transplantation.">Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation.</a> Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).</li><li>Lo, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+fetal+DNA+in+maternal+plasma+and+serum:+implications+for+noninvasive+prenatal+diagnosis.">Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis.</a> Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).</li><li>Byrne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimerism+analysis+in+sex-mismatched+murine+transplantation+using+quantitative+real-time+PCR.">Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR.</a> Biotechniques. 32, 279-280 (2002).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+recipient-derived+cells+in+allograft+neointima+formation+and+the+response+to+stent+implantation.">Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation.</a> PLoS One. 3, e1894 (2008).</li><li>Bosio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+real-time+quantitative+PCR+and+DNA+hybridization+for+quantitation+of+male+DNA+following+myoblast+transplantation.">A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation.</a> Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).</li><li>Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli1+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+HSCs+and+myeloid+progenitors.">Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors.</a> Blood. 115, 2391-2396 (2010).</li><li>Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+candidate+testis-determining+Y+genes+(Zfy-1+and+Zfy-2)+are+differentially+expressed+in+fetal+and+adult+mouse+tissues.">The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues.</a> Genes &amp; development. 4, 63-74 (1990).</li><li>Grundler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+PIM+serine/threonine+kinases+in+FLT3-ITD-induced+leukemogenesis+reveals+PIM1+as+regulator+of+CXCL12-CXCR4-mediated+homing+and+migration.">Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration.</a> J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).</li></ol>

אין לנו מתחרים אינטרסים כספיים לחשוף.

מטרת המחקר הנוכחי שלנו היא לספק לקהל טכניקה מבוססת PCR לכמת engraftment תא התורם במודל תחרותי עכברי מח עצם השתלה. מספר מחקרים שדיווחו על השימוש בRT-PCR לזיהוי תאי תורם במודלי השתלה 9-10. קבוצתו של ד&quot;ר Schwarzenberger פותחה לראשונה מודל עכברי השתלת מח עצם באמצעות PCR בזמן אמת כדי ל...

מודל Murine מח עצם (BM) השתלה פותח לראשונה ב -1960 1. דגם זה כבר נעשה שימוש נרחב לחקר התא תורם גזע hematopoietic (HSC) בביולוגית עכבר נמען מארח. מודל השתלת מח העצם Murine ספק לנו ידע רב ערך על פונקציות HSC והרגולציה שלהם והכרחי במחקר HSC. מודל allogeneic השתלת מח עצם כמו C57Bl/6J H2B-BALB / C H2d או מודל ההשתלה congenic כמו C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 משמש במעבדות רבות כדי ללמוד את תפקוד הגן על פעילות HSC 2, השפעה של טיפול תרופתי על תפקוד 3 או השתלת HSC מחלות נלוות כגון מחלת שתל נגד מארח (GVHD) 4. סמנים בתא שטח כגון haplotype MHC או CD45.1 משמשים בדרך כלל לתאים מייחדים תורם הנגזרים מתאי נמען מקורם-. C57Bl/6J H2B, CD45.2 </sup&gt;, BALB / C H2d וB6.SJL CD45.1 הם זני העכבר הנפוץ ביותר בהשתלת מח עצם, כי תרומת התא התורם ניתן להעריך בקלות על ידי הזרימה cytometry מדידת CD45.1 לעומת CD45.2 או H2B לעומת H2d. עם זאת, זנים רבים אחרים, כגון FVB / ניו ג&#39;רזי 5 ו C3H הם גם משמשים לעתים קרובות כדי לייצר מהונדסים בהנדסה גנטית או עכברים בנוקאאוט. עכברים אלו ניתן backcrossed לקו לדה ומתוחזק ברקע מעורב גנטי / MHC. במקרים אלה, קביעת engraftment תא תורם ותפקוד HSC יכולה להיות קשה כסמני שטח ספציפיים בתאים תורמים לא יהיו זמינים. באמצעות בדיקת כרומוזום Y-DNA ספציפית כדי לזהות את תאי תורם גברים על ידי כתם דרומי בהשתלת מח עצם מין חוסר התאמה שפותח לראשונה על ידי הקבוצה של ד&quot;ר Miwa 6. ואז, PCR בזמן אמת לקביעת מין האזור Y-נמצא שיטה מדויקת וספציפית מאוד לכמת maתאים עובריים le במערכת הדם האם 7. רעיון זה אומץ על ידי קבוצתו של ד&quot;ר Schwarzenberger לפיתוח של טכניקה בזמן אמת PCR במודל עכברי השתלת מח עצם כדי לקבוע engraftment התא התורם 8. אנחנו שונים בשיטה זו נוספת למדידת engraftment תא התורם במודל FVB / ניו ג&#39;רזי עכבר השתלת מח עצם. שיטה זו כיום שימוש נרחב בקבוצה שלנו ללימוד התפקיד של Pim1 קינאז בביולוגית HSC.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Hyclone </td><td> SH30255.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-017 </td><td> חום מומת </td></tr><tr><td> אמוניום כלוריד </td><td> חבר הפרלמנט Biomedicaals </td><td> 194806 </td><td></td></tr><tr><td> יקרבונט אשלגן </td><td> דיג </td><td> P184-500 </td><td></td></tr><tr><td> QIAamp DNA הדם MINIKIT </td><td> Qiagen </td><td> 51106 </td><td></td></tr><tr><td> מסננת תא </td><td> BD מדעי חיים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> iQ SYBR הירוק supermix </td><td> Biorad </td><td> 170-8882 </td><td></td></tr><tr><td> מכונת ה-PCR בזמן אמת iQ5 </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ספקטרה פוטומטר </td><td> Nanodrop ND-1000 </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

using quantitative real-time pcr to determine donor cell engraftment in a competitive murine bone marrow transplantation model

מודלי השתלת מח עצם Murine לספק כלי חשוב במדידה סלולרית פונקציות hematopoietic גזע (HSC) וגנים הקובעים / מולקולות המווסתות HSCs. במערכות מודל השתלות אלה, הפונקציה של HSCs נקבעת על ידי היכולת של תאים אלה נקלטים ולגבש מחדש עכברי נמען קטלני מוקרנים. בדרך כלל, התרומה / engraftment התא התורם נמדד על ידי נוגדנים לחלבונים בתא שטח תורם ספציפי באמצעות cytometry זרימה. עם זאת, שיטה זו תלויה במידה רבה על הספציפיות ואת יכולתו של סמן תא השטח כדי לבדל תאי תורם המופקים מתאי נמען מקורם-, אשר עשוי שלא להיות זמין עבור כל הזנים של העכברים. בהתחשב ברקע השונה של זני עכבר מהונדס גנטי בשוק, משטח זה תא / זרימת cytometry שיטה מבוססת יש מגבלות משמעותיות במיוחד בזני עכברים שאין סמנים מוגדרים היטב על פני שטח לתורם בתאים נפרדים מcongenic הנמען ceLLS. כאן, אנו מדווחים טכניקת PCR מבוססת כדי לקבוע engraftment / תרומת התא התורם בעכברי השתלה. אנו הושתלנו HSCs מח עצם התורם גברים לנקבות העכברים congenic קטלני מוקרנים. דגימות דם היקפיות נאספו בהשתלת הודעה שונה נקודתי זמן. דגימות מח עצם התקבלו בתום הניסויים. הדנ&quot;א הגנומי היה מבודד וגן כרומוזום Y הספציפי, Zfy1, הוגבר שימוש בזמן אמת PCR כמותית. Engraftment של תאים זכריים תורם המופקים בעכברי הנמען הנשים חושב על עקומת סטנדרט עם אחוז ידוע של גברי DNAs לעומת נקבה. Bcl2 שמש גן התייחסות לנרמל את כמות הדנ&quot;א המוחלטת. הנתונים שלנו הציעו כי גישה זו אמינה קובעת engraftment תא התורם ומספקת שיטה יעילה, פשוטה אך במדידת הכינון מחדש של תאי hematopoietic במודלים של השתלת מח עצם Murine. השיטה שלנו יכולה להיות מבוצעת באופן שגרתי ברוב המעבדות כי אףציוד יקר כגון cytometry זרימה נדרש.

איור 1 ו 2 הראו דוגמאות לעקומות סטנדרטיות זממו עם ערכים ממוצעים של 2-δCt נגד אחוזי DNA הגברי. האיור 1A הראה טמפרטורת התכה ספציפית לBcl2 וZfy1 amplicons מותאם ב78.5 המעלות צלזיוס ו88.5 ° C, בהתאמה. Bcl2 משמש כגן התייחסות לנרמל את הסכום הכולל של ה-DNA הטעון בכל תגובת PCR....

Watch this Scientific Journal Video about Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model at JoVE.com

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

קביעת engraftment תא התורם מציגה אתגר במודלי עכבר השתלות מח עצם שאין מוגדרים היטב סמני phenotypical. אנו תארנו המתודולוגיה לכמת engraftment תא התורם גברי בעכברי השתלה נשיות. שיטה זו ניתן להשתמש בכל זני העכבר לחקר פונקציות HSC.

באמצעות PCR כמוני בזמן אמת לקביעת engraftment תא התורם במודל תחרותי Murine מח עצם השתלה

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

using-quantitative-real-time-pcr-to-determine-donor-cell-engraftment

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

15.3K Views.  Medical University of South Carolina. קביעת engraftment תא התורם מציגה אתגר במודלי עכבר השתלות מח עצם שאין מוגדרים היטב סמני phenotypical. אנו תארנו המתודולוגיה לכמת engraftment תא התורם גברי בעכברי השתלה נשיות. שיטה זו ניתן להשתמש בכל זני העכבר לחקר פונקציות HSC.

Video: Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

במודל עכבר של בתוך הרחם השתלה

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

MicroRNA איתור גידולים הערמונית ב כמותי בזמן אמת PCR (QPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

הערכה טרום קלינית של מעכבי טירוזין קינאז לטיפול בלוקמיה חריפה

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Murine Cervical Heart Transplantation Model Using a Modified Cuff Technique

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are available to perform mechanistic in vivo studies. While heart transplantation models using a suture technique were first successfully developed in rats, the translation into an equally widespread used murine equivalent was never achieved due the technical complexity of the microsurgical procedure. In contrast, non-suture cuff techniques, also developed initially in rats, were successfully adapted for use in mice1-3. This technique for revascularization involves two major steps I) everting the recipient vessel over a polyethylene cuff; II) pulling the donor vessel over the formerly everted recipient vessel and holding it in place with a circumferential tie. This ensures a continuity of the endothelial layer, short operating time and very high patency rates4.
Using this technique for vascular anastomosis we performed more than 1,000 cervical heart transplants with an overall success rate of 95%. For arterial inflow the common carotid artery and the proximal aortic arch were anastomosed resulting in a retrograde perfusion of the transplanted heart. For venous drainage the pulmonary artery of the graft was anastomosed with the external jugular vein of the recipient5.
Herein, we provide additional details of this technique to supplement the video.

The murine cervical heart transplantation model is well suited for immunological as well as ischemia reperfusion injury studies. We modified the procedure using a non-suture cuff technique and performed more than 1,000 successful transplants with this approach.
Herein, we provide additional details of this technique to supplement the video.

עכברי צוואר הרחם לב השתלת דגם שימוש בטכניקת חפתים השתנה

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

דגם תרבות רקמות תלת ממדי למחקר עיקרי עצם אדם מח וממאיר שלו

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each year. While several animal models exist for this procedure and mice are the species that is most commonly used. The reasons for using mice are the relative cost of using this species, the existence of many genetically defined strains that allow for the study of immune responses, and the existence of an extensive array of reagents that can be used to further define responses in this species. This model has been used to define factors in the cornea that are responsible for the relative immune privilege status of this tissue that enables corneal allografts to survive acute rejection in the absence of immunosuppressive therapy. It has also been used to define those factors that are most important in rejection of such allografts. Consequently, much of what we know concerning mechanisms of both corneal allograft acceptance and rejection are due to studies using a murine model of corneal transplantation. In addition to describing a model for acute corneal allograft rejection, we also present for the first time a model of late-term corneal allograft rejection.

Mice have been used as a model for studying many forms of transplantation, including corneal transplantation. We describe in this report a murine model for both acute and late-term corneal transplantation.

השתלת קרנית עכברית: דגם לחקר הצורה נפוצה ביותר של Solid השתלות איברים

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous perfusion of organs provides the opportunity to improve organ quality and allows ex situ viability assessment of donor livers prior to transplantation. This video article provides a step by step protocol for ex situ normothermic machine perfusion (37 &#176;C) of human donor livers using a device that provides a pressure and temperature controlled pulsatile perfusion of the hepatic artery and continuous perfusion of the portal vein. The perfusion fluid is oxygenated by two hollow fiber membrane oxygenators and the temperature can be regulated between 10 &#176;C and 37 &#176;C. During perfusion, the metabolic activity of the liver as well as the degree of injury can be assessed by biochemical analysis of samples taken from the perfusion fluid. Machine perfusion is a very promising tool to increase the number of livers that are suitable for transplantation.

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Here we present a protocol describing oxygenated ex situ machine perfusion of donor liver grafts. This article contains a step by step protocol to procure and prepare the liver graft for machine perfusion, prepare the perfusion fluid, prime the perfusion machine and perform oxygenated normothermic machine perfusion of the liver graft.

באתרו לשעבר Normothermic מכונת זלוף של כבדים תורמים

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

הערכה של ריאות גרורה במודלי גידול עכבר החלב על ידי בזמן אמת כמותי PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies that promote efficient bone healing are non-existent and in high demand. Effective and reproducible animal models of fractures healing are needed to understand the complex biological processes associated with bone regeneration. Many animal models of fracture healing have been generated over the years; however, murine fracture models have recently emerged as powerful tools to study bone healing. A variety of open and closed models have been developed, but the closed femoral fracture model stands out as a simple method for generating rapid and reproducible results in a physiologically relevant manner. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice and facilitate a post-fracture stabilization of the femur by inserting an intramedullary steel rod. Although devices such as a nail or a screw offer greater axial and rotational stability, the use of an intramedullary rod provides a sufficient stabilization for consistent healing outcomes without producing new defects in the bone tissue or damaging nearby soft tissue. Radiographic imaging is used to monitor the progression of callus formation, bony union, and subsequent remodeling of the bony callus. Bone healing outcomes are typically associated with the strength of the healed bone and measured with torsional testing. Still, understanding the early cellular and molecular events associated with fracture repair is critical in the study of bone tissue regeneration. The closed femoral fracture model in mice with intramedullary fixation serves as an attractive platform to study bone fracture healing and evaluate therapeutic strategies to accelerate healing.

The murine closed femoral fracture model is a powerful platform to study fracture healing and novel therapeutic strategies to accelerate bone regeneration. The goal of this surgical protocol is to generate unilateral closed femoral fractures in mice using an intramedullary steel rod to stabilize the femur.

הדור של שברי הירך סגור בעכברים: מודל ללמוד ריפוי עצם

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...