אנו מכירים ק Mikic, שתרם לשלב הראשוני של הסרט הזה ומ Nicolescu לתמונת miR. ג הובר נתמכה על ידי מענק של IZKF של טובינגן Universtitätsklinikum, א &#39;אלווין הפר אנאנד על ידי תכנית ההון של טובינגן Universtitätsklinikum.

1. דרישות באוב Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מבנה הווקטור: פריימרים תחושת miR וantisense תוכננו אחרי ההוראות של Ambion, annealed ואת הגבעול לApaI / EcoRI מתעכל וקטור U6.1 pSilencer. לאחר שינוי מוצלח אחד מהשיבוטים וכתוצאה מכך היה גדל ופלסמיד pSilencer היה מבודד על ידי שיטת תמוגה אלקליין באמצעות ערכת הכנת פוליפוני Quiagen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות: ניתן לרכוש אלקטרודות או בקלות להיבנות 13. אנו משתמשים באלקטרודות מתוצרת עצמית של חוט פלטינה (Φ = 0.2, 0.25, או 0.5 מ&quot;מ קוטר) או במקרים מסוימים אלקטרודה חוט טונגסטן קטנה עוד יותר (Φ = 0.1 מ&quot;מ) 8 תלוי באיזה אזור אנחנו רוצים electroporate. כדי להימנע מחריכה של רקמה, אנו משתמשים ככלל קרובים יותר לרקמה רזה האלקטרודות. עבור electroporation הרחב של המוח התיכון, אנו משתמשים 0.5 חוטי פלטינה מ&quot;מ מולחמים לצינור נחושת / נירוסטהפיר וקבוע לבעל אלקטרודה עם מרחק של 3-5 מ&quot;מ (איור 1). לelectroporate אזורים מסוימים, אנו משתמשים 0.25 אנודות חוט הפלטינה מ&quot;מ וחוט פלטינה 0.2 מ&quot;מ או טונגסטן מ&quot;מ 0.1 לקתודה עם מרחק משוער של 1 מ&quot;מ או פחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות: האם את הפתרונות הבאים מוכנים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רינגר Autoclaved עוף, pH 7.5 (9.0 גרם NaCl, 0.42 גרם KCl, 0.24 CaCl2 גרם, מתמוסס ב1 ליטר מים מזוקקים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS (8 גרם NaCl, 0.2 גרם KCl, 0.24 גרם KH 2 PO 4, 1.44 גרם Na 2 HPO 4, לפזר בH 2 O מזוקק 1 ליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרין מהיר: 10 מ&quot;ג / H 2 פתרון מניות מזוקק מיליליטר O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיו איטי ייבוש (פחות לכה ולכן פחות הרעלה לעובר). הערה: מסנן dichroic כחול מחובר למנורת סיבים אופטית כמתואר בקנטו-סולר ו14 אדלר משפר את החדות ויכול לבטל את הצורך להזריק דיו. </li></ol></li></ol><img src="/files/ftp_upload/50024/50024fig1.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50024/50024fig1highres.jpg"/> איור 1. תרשים סכמטי של אלקטרודות ובעל אלקטרודה. (A, B, C) ​​חוט פלטינה היה מולחם בצד אחד של מוט צינור נירוסטה. חור נקדח לצד של פיר צינורי האחר כך שהתקע יכול להשתלב () האדום וחוטים בצבע כחולים היו מחוברים לתקע. בקצה השני החוט היה מצויד למחברי בננה שעובדים עם שקעי החשמל של electroporator. (A, C) חוט הפלטינה הייתי כפוף במלאך 90 מעלות. שכבה של לכה מסמר בודדה את המוט מעל לעיקול. 2. הכנות ישירות לפני באוב Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין את החומר הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל דיו עם רינגר עוף 01:06, להוסיף פתרון אנטיביוטיקת antimycotic (100x מGibco) 1:100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון וקטור: 1-2 מיקרוגרם / μl לDNA הספציפי בH 2 O בתוספת גרין המהיר (1:20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מלקחיים, מספריים, מחט טונגסטן ואלקטרודות עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך micropipettes להזרקת חומצת גרעין מנימי זכוכית בורוסיליקט (אורך לקוטר חיצוני: 100 מ&quot;מ x 0.9 מ&quot;מ). אנו משתמשים בחולץ פשוט PUL-1 (WPI, ברלין) עם ההגדרות שמוצגים בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפרמטרים של electroporator כפי שמוצג בטבלה 2. </li></ol></li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td fo:width="1in"> פרמטרים </td><td fo:width="1in"> ערכים </td></tr><tr><td> חום </td><td> 350 </td></tr><tr><td> משוך </td><td> 100 </td></tr><tr><td> מהירות </tד&gt; <td> 50 </td></tr><tr><td> השהיה </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. הגדרות עבור PUL-1 <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td fo:width="1.5in"> פרמטרים </td><td fo:width="1.5in"> ערכים </td></tr><tr><td> תדר </td><td> 50 הרץ </td></tr><tr><td> השהיה </td><td> 20-50 אלפיות שניים * </td></tr><tr><td> רוחב </td><td> 20 msec </td></tr><tr><td> מתח </td><td> 8-25 * V </td></tr><tr><td> דופק </td><td> 3 - 5 פעמים </td></tr><tr><td colspan="2"> * בהתאם לקוטר האלקטרודה ומרחק. אנאלקחת את זה בחשבון בעת ​​שינוי אחד מהפרמטרים. </td></tr></tbody></table> טבלה 2. הגדרות עבור ממריץ הדופק <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עובר חומוס לelectroporation: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ביצי תרנגולות מופרות על הצד הארוך יותר שלהם על 37 מעלות צלזיוס עם לחות 65% ל39 שעה לרכוש עוברים בין המבורגר והמילטון (HH) מביימת 15 9-11. העובר מתמקם בחלק העליון של הביצה, ולכן אתה צריך לסמן אותו עם קו עיפרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את הביצים עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקב את הביצה בצד הרחב שלה, שבו חלל האוויר צריך להיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 1-2 מיליליטר של חלבון ביצה. זה יהיה לנתק את העובר מקליפת הביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;לו קלטת קליפת הביצה כדי למנוע רסיסי פגז נופלים על העובר. השתמש במספריים כדי לחתוך חלון קטן לתוך קליפת הביצה סביב קו העיפרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק קצת דיומתחת opaca האזור כדי להמחיש את העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך בקרום vitelline עם מחט טונגסטן חידדה כדי להשיג נגישות טובה יותר של העובר להזרקת חומצות גרעין וelectroporation. </li></ol></li></ol> 3. Electroporation ודגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כמה טיפות של תמיסת רינגר החם על העוברים. זה יפחית את העוברים, כדי למנוע התחממות יתר, דבק של האלקטרודות לרקמה ולספק מדיום לנוכחי בין שתי אלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את פתרון הווקטור לתוך לומן של הצינור העצבי ברמת המוח התיכון. אם וקטור ביטוי הדנ&quot;א שלכם לא מכיל גן מדווח (למשל EGFP), להוסיף וקטור מעט נמוך יותר מרוכז כתב גן (1 מיקרוגרם / μl miR להביע וקטור ל0.9 מיקרוגרם / וקטור גן כתב μl) לפתרון ה-DNA. זה יבטיח כי אתה מזהה תאים transfected כעבור 8. אנו משתמשים וקטור pCAX מה שנקרא, מתנה מסוג לכאן ולכאןמ &#39;ג קרול 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור transfection רחב של המוח התיכון, הנח את האלקטרודות ימין ועל שמאל של העובר בשיאו של המוח התיכון. המרחק בין האלקטרודות צריך להיות בסביבות 3-5 מ&quot;מ. הגדרות האחרות הן 15V, 20 פולסים אלפיות שניים ועיכוב אלפיות 50 לHH 10. שינוי המיקום של שתי אלקטרודות במקצת לאורך ציר dorso-הגחון (DV) של המוח התיכון מבטיח יותר transfection רחב של תאי transfection ציר DV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור transfection הגחון, להוסיף קצת Ringer להעלות את הראש מקרום החלמון והנח את האנודה מתחת המוח התיכון הגחון. אם הראש לא עולה לדחוף את האלקטרודה תחת הקרום המפריד בין חלמון ועובר, כדי למנוע חריכה של הצינור העצבי. הקתודה צריכה להיות ממוקמת מעל dorso-רוחבי המוח התיכון הפוך להאנודה. אל תיגע בצינור העצבי. אנו transfect מחצית הגחון השמאלית של המוח התיכון, כדי למנוע כל קשיים בהתפתחות לב. המרחק בין האלקטרודותהוא סביב 1-0.5 מ&quot;מ, שאר ההגדרות 10V, 20 רוחב אלפיות ועיכוב אלפיות 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יחול ירידה נוספת של תמיסת מלח על גבי העוברים כדי לצנן אותה ולהסיר בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הביצים עם הקלטת ודגירה של לפחות 4 שעות; הזמן המינימאלי הנדרש לביטוי וקטור. </li></ol> 4. קיבוע של עוברי עופות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העוברים מהביצים שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים נקיים מתחת סטראו ולהעריך עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו המידה של transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את העוברים במשך לילה PFA 4% ב 4 ° C. להמשיך עם חתך ו / או הכתמה (הכלאה באתרו, אימונוהיסטוכימיה) כדי לנתח את השינויים באזור transfected. </li></ol>

<ol>
	<li>Kutter, C., Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA,+siRNA,+piRNA:+Knowns+of+the+unknown.">miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown.</a> RNA Biol. 5, 181-188 (2008).</li><li>Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enigmatic+world+of+mRNA-like+ncRNAs:+their+role+in+human+evolution+and+in+human+diseases.">The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 141-148 (2008).</li><li>Li, X., Jin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+small+regulatory+RNAs+in+determining+neuronal+identity.">Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity.</a> Nature reviews. Neuroscience. 11, 329-338 (2010).</li><li>Riedmann, L. T., Schwentner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA,+siRNA,+piRNA+and+argonautes:+news+in+small+matters.">miRNA, siRNA, piRNA and argonautes: news in small matters.</a> RNA Biol. 7, 133-139 (2010).</li><li>Coolen, M., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+brain+development+and+physiology.">MicroRNAs in brain development and physiology.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 461-470 (2009).</li><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).</li><li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shocking'+developments+in+chick+embryology:+electroporation+and+in+ovo+gene+expression.">Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).</li><li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).</li><li>Nakamura, H., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misexpression+of+genes+in+brain+vesicles+by+in+ovo+electroporation.">Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 42, 199-201 (2000).</li><li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos.">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nat. Protoc. 3, 419-426 (2008).</li><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Gene Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> The EMBO journal. 1, 841-845 (1982).</li><li>Potter, H., Weir, L., Leder, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer-dependent+expression+of+human+kappa+immunoglobulin+genes+introduced+into+mouse+pre-B+lymphocytes+by+electroporation.">Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 7161-7165 (1984).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Dev. Dyn. 229, 433-439 (2004).</li><li>Canto-Soler, M. V., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+cup+and+lens+development+requires+Pax6+expression+in+the+early+optic+vesicle+during+a+narrow+time+window.">Optic cup and lens development requires Pax6 expression in the early optic vesicle during a narrow time window.</a> Developmental biology. , 294-2119 (2006).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951.">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).</li><li>Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation:+a+powerful+and+convenient+means+of+nonviral+gene+transfer+to+tissues+of+living+animals+(Review).">In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review).</a> Int J Mol Med. 1, 55-62 (1998).</li><li>Agoston, Z., Li, N., Haslinger, A., Wizenmann, A., Schulte, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+physical+interaction+of+Meis2,+Pax3+and+Pax7+during+dorsal+midbrain+development.">Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development.</a> BMC Dev Biol. 12, 10 (2012).</li><li>De Pietri Tonelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+detection+of+microRNAs+in+developing+vertebrate+embryos+after+acute+administration+of+a+dual-fluorescence+reporter/sensor+plasmid.">Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid.</a> Biotechniques. 41, 727-732 (2006).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

<html> וידאו זה מדגים שיטה יעילה לtransfect פלסמיד לתוך תאי neuroepithelial של אזורים הספציפיים של המוח התיכון החומוס. פולסים חשמליים מלבניים של מתח נמוך יכולים להציג את ה-DNA לתוך תאים של הצינור העצבי החומוס באוב 6,16. עם זאת, הדיוק של מיקוד DNA מתעכבת לעתים קרובות על ידי השדה ...

ההכרה של RNAs ללא קידוד הקטן כמו שחקנים נוספים לביטוי גנים השיקה מורכבות חדשות לרגולציה תכנות / גן הגנומי. יש מינים שונים של RNAs ללא קידוד חשיבות תפקודית בתאים עצביים, כוללים קטן RNAs 1-4 ללא קידוד. מיקרו RNA (miR או מירנה) למשל מראה פרופילי ביטוי שונים ומשתנים במוח המתפתח 5. ממוקדת ב electroporation אובו של עובר חומוס מספקת הזדמנות ייחודית לבקרת זמן ומרחב של ביטוי גנים והשתקה במהלך פיתוח. סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים של ביצוע ביטוי מחוץ לרחם של מירס באזורים מסוימים של המוח התיכון חומוס שימוש באוב electroporation 6-10. כדי להבטיח השפעה ארוכה טווח של RNAs ללא קידוד אלה הקטנים בתאים, רצף ה-DNA של מירס היו משובט לתוך וקטורים מונו או דו cistronic. לב electroporation אובו, miR מכיל vEctor מוזרק לתוך הצינור עצבי המוח התיכון על ידי חשיפת העובר לאחר ביצוע חלון קטן בקליפת הביצה. כדי transfect אזורים ספציפיים במוח התיכון בתוספת הקטנה (האנודה) ומינוס (קטודה) אלקטרודות פלטינה ממוקמות בעמדות ספציפיות. עבור transfection המוח התיכון הגחון, האנודה ממוקמת מתחת למוח תיכון הגחון השמאל והקתודה מעל המחצית הימנית של המוח התיכון לפני היישום נוכחית. הפתיחה בקליפת הביצה סגורה עם קלטת ועוברים טופחו במשך כל זמן שנדרש לכל ניתוח. שיטה זו תוארה במקור על ידי Muramatsu et al. 6 ומשופרת על ידי Momose et al. 8 עבור transfection הספציפי לאזור. <img src="/files/ftp_upload/50024/50024schematic1.jpg" fo:content-width-="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50024/50024schematic1highres.jpg"/> סקירת סכמטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העובר בביצה חשוף על ידי חיתוך חלון קטן לתוך הדואר קליפת ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הווקטור (ים) מומס מוזרק לתוך המוח התיכון באמצעות נימי מיקרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתי אלקטרודות - המונחות במקביל או מתחת ומעל לעובר - ליצור שדה חשמלי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השדה החשמלי temporally יוצר נקבוביות בקרום התא, המאפשר כניסה לתא על ידי-DNA הטעון השלילי (או RNA) נמשך להאנודה 11,12. </li></ol>

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company</td>
 <td></td>
 <td>Model</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosillicate glass capillaries </td>
 <td>Hartenstein</td>
 <td></td>
 <td>Model: 0.9 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcapillary puller</td>
 <td>WPI, Berlin</td>
 <td></td>
 <td>Model: Pul1-E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Electroporator</td>
 <td>Intracel</td>
 <td></td>
 <td>Model: TSSIC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope - fluorescence </td>
 <td>LEICA</td>
 <td></td>
 <td>Model: MZFLIII</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td>Model: Stemi</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Camera and software</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td>Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

in ovo expression of microrna in ventral chick midbrain

RNAs ללא קידוד הם שחקנים נוספים בויסות ביטוי הגנים. ממוקד ב electroporation אובו של אזורים ספציפיים מספק כלי ייחודי לשליטה במרחב ובזמן של ביטוי microRNA מחוץ לרחם. עם זאת, מבנים מוחיים הגחון כמו המוח התיכון הגחון הם די קשים להגיע לכל מניפולציות. הנה, אנחנו מדגימים דרך יעילה לelectroporate מירנה למוח תיכון הגחון באמצעות אלקטרודות פלטינה דקות. שיטה זו מציעה דרך אמינה transfect אזורים ספציפיים של המוח התיכון וכלי שימושי במחקרי vivo.

באזור המוח התיכון transfected עם miR המידה גלויה דרך הביטוי של ה-GFP מוקטור כתב הזריק יחד עם הווקטור להביע miR (איור 2). באמצעות אלקטרודות פלטינה עם קוטר של 0.5 מ&quot;מ והניח במקביל לציר AP של מוביל המוח התיכון בדרך כלל לtransfection של שטח נרחב לאורך DV-AP והציר, ובכלל זה למוח האחורי...

Watch this Scientific Journal Video about In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain at JoVE.com

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

ביטוי מחוץ לרחם הוא טכניקה אחת על מנת להבהיר את תפקיד רנ&quot;א בהתפתחות המוח. עם זאת, מיקוד באזורים מסוימים באמצעות ב electroporation אובו הוא מאתגר. כאן, אנו מציגים דרך יעילה לאזורי המוח התיכון הגחון ועל גב באופן סלקטיבי electroporate.

בביטוי אוב של microRNA בגחון צ&#39;יק מוח התיכון

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

in-ovo-expression-of-microrna-in-ventral-chick-midbrain

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

10.4K Views.  University of Tübingen.  ביטוי מחוץ לרחם הוא טכניקה אחת על מנת להבהיר את תפקיד רנ"א בהתפתחות המוח. עם זאת, מיקוד באזורים מסוימים באמצעות ב electroporation אובו הוא מאתגר. כאן, אנו מציגים דרך יעילה לאזורי המוח התיכון הגחון ועל גב באופן סלקטיבי electroporate. 

Video: In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

ב electroporation לג&#39;ימי של המוח התיכון צ&#39;יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

פרופיל מקיף של הסדרת substantia nigra הדופמין ואזור Tegmental הגחון

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

RNA-Seq ניתוח של ביטוי הגנים בדיפרנציאל חוט השדרה Electroporated אפרוח עוברי

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, interactions with our environment can induce brain plasticity. Increasingly, research is trying to identify which environments stimulate brain plasticity beneficial for treating brain and behavioral disorders. Two environmental manipulations are described which increase or decrease the number of tyrosine hydroxylase immunopositive (TH+, the rate-limiting enzyme in dopamine (DA) synthesis) neurons in the adult mouse midbrain. The first comprises pairing male and female mice together continuously for 1 week, which increases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in males, but decreases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in females. The second comprises housing mice continuously for 2 weeks in &#8216;enriched environments&#8217; (EE) containing running wheels, toys, ropes, nesting material, etc., which increases midbrain TH+ neurons by approximately 14% in males. Additionally, a protocol is described for concurrently infusing drugs directly into the midbrain during these environmental manipulations to help identify mechanisms underlying environmentally-induced brain plasticity. For example, EE-induction of more midbrain TH+ neurons is abolished by concurrent blockade of synaptic input onto midbrain neurons. Together, these data indicate that information about the environment is relayed via synaptic input to midbrain neurons to switch on or off expression of &#8216;DA&#8217; genes. Thus, appropriate environmental stimulation, or drug targeting of the underlying mechanisms, might be helpful for treating brain and behavioral disorders associated with imbalances in midbrain DA (e.g. Parkinson&#8217;s disease, attention deficit and hyperactivity disorder, schizophrenia, and drug addiction).

This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

אפנון סביבתי של מספר המוח התיכון דופמין נוירונים בעכברים בוגרים

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

שיטה פשוטה וזולה לקביעה קרה רגישות והסתגלות בעכברים

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

זיהוי אמין של חיים דופאמין נוירונים תרבויות המוח התיכון באמצעות רצף RNA ו- TH-מונחה האמרגן ביטוי eGFP

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and &#946;-cell failure. Various strategies, including the injection of insulin or the usage of insulin-sensitizing drugs, were pursued to treat T2DM or at least reduce the symptoms. In addition, the application of herbal compounds has attracted increasing attention. Thus, it is necessary to find efficient test systems to identify and characterize insulin-mimetic compounds. Here we developed a modified chick embryo model, which enables testing of synthetic compounds and herbal extracts with insulin-mimetic properties. Using a fluorescence microscopy-based primary screen, which quantifies the translocation of Glucose transporter 4 (Glut4) to the plasma membrane, we were able to identify compounds, mainly herbal extracts, which lead to an increase of intracellular glucose concentrations in adipocytes. However, the efficacy of these substances requires further verification in a living organism. Thus, we used an in-ovo approach to identify their blood glucose-reducing properties. The approval by an ethics committee is not needed since the use of chicken embryos during the first two-thirds of embryonic development is not considered an animal experiment. Here, the application of this model is described in detail.

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

In this study, we describe an in-ovo system as a promising tool to test insulin-mimetic compounds in a living organism. The main advantages include adequate throughput rates and acceptable costs, which enable the identification of phytochemicals with insulin-mimetic properties.

מודל ב Ovo לבדיקת תרכובות מימטי-אינסולין

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a premise for determining the role of neuron types within a neural circuit, and their significance in information encoding relative to learning. Likewise, the method can be used to test the physiological significance of two or more connected brain regions in awake and anesthetized animals. The current study demonstrates how VTA glutamate neurons modulate the firing rate of putative pyramidal neurons in the CA1 (hippocampus) of anesthetized mice. This protocol employs adeno-associated virus (AAV)-dependent labeling of VTA glutamate neurons for the tracing of VTA presynaptic glutamate terminals in the layers of the hippocampus. Expression of light-controlled opsin (channelrhodopsin; hChR2) and fluorescence protein (eYFP) harbored by the AAV vector permitted anterograde tracing of VTA glutamate terminals, and photostimulation of VTA glutamate neuron cell bodies (in the VTA). High-impedance acute silicon electrodes were positioned in the CA1 to detect multi-unit and single-unit responses to VTA photostimulation in vivo. The results of this study demonstrate the&#160;layer-dependent distribution of presynaptic VTA glutamate terminals in the hippocampus (CA1, CA3, and DG). Also, the photostimulation of VTA glutamate neurons increased the firing and burst rate of putative CA1 pyramidal units in vivo.

The current protocol demonstrates a simple method for tracing of ventral tegmental area (VTA) glutamate projections to the hippocampus. Photostimulation of VTA glutamate neurons was combined with CA1 recording to demonstrate how VTA glutamate terminals modulate CA1 putative pyramidal firing rate in vivo.

מעקב אנטומי ותפקודי משולב של מסופי גלוטמט באזור הגונטם הגחמני בהיפוקמפוס

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a ...