נתמך בחלקו על ידי R01NS064593 וR21ES016636 (KV). מיקרוסקופי בוצע בVCU - מחלקה לנוירוביולוגיה מתקן מיקרוסקופי ואנטומיה, נתמך, בין השאר, במימון ה-NIH NINDS מרכז ליבת מענק 5P30NS047463. Confocal מיקרוסקופ הדיסק מסתובב נקנה בפרס ה-NIH NCRR (1S10RR027957).

הכנת תא א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> fibroblasts העיקרי אדם נורמלי (GM02270) התקבלו ממאגר Coriell סלולרי, קמדן, ניו ג&#39;רזי, והונצח עם 6 hTERT. תאים גדלו והתרחבו בCellStar מנות 6-סנטימטר בתקשורת (4 מ&quot;ל) בהיקף של MEM בתוספת 20% בסרום עוברי שור (GIBCO), חומצות אמינו non-essential/essential, ויטמינים, פירובט נתרן, ופניצילין / סטרפטומיצין (HyClone ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כליה עוברית אנושית 293 (HEK293) תאים נלקחו מאוסף תרבות סוג האמריקאי וגדלה והתרחבה בCellStar מנות 6-סנטימטר. התאים נשמרו בתקשורת (4 מ&quot;ל) בהיקף של DMEM בתוספת חומצות 10% עובריים שור בסרום, שאינן חיוניות אמינו, L-גלוטמין, ופניצילין / סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 53BP1-mCherry (N-Myc-WT 53BP1 pLPC-Puro; Addgene פלסמיד 19836) וH2B-GFP (pCLNR-H2BG; 17735 פלסמיד Addgene) גן היתוך הבונה גם לבטא את גני התנגדות G418 puromycin או, בהתאמה, transduced (fibroblaSTS) או transfected (HEK293) באמצעות SuperFect (Qiagene) לתוך תאים ונשמר תחת בחירת תרופה. תחזוקה של קרינה נבדקה מעת לעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24-48 שעות לפני רכישת תמונה, תאי trypsinized לתוך השעית תא בודד ונזרעו בצפיפות נמוכה על צלחות תחתונות 3.5 סנטימטר FluroDish זכוכית. </li></ol> התקנת מיקרוסקופ ב ויבוא תמונות פרוטוקול זה פותח באמצעות מיקרוסקופ הסלולרי Zeiss אובזרוור SD דיסק ספינינג confocal המצויד בZ1 עמדת AxioObserver, ערוץ כפול Yokagawa יחידת המז&quot;פ-X1a 5000 מסתובב דיסק, 2 מצלמות Photometrics QuantEM 512SC EMCCD, מאייר 120C HXP מבוסס סיבים, 4 לייזרים (Lasos 100mW רב קווי ארגון [458, 488, 514 ננומטר], 50 405 דיודה mW ננומטר, דיודה 40 MW 561 ננומטר, והדיודה ננומטר 30 mW 635), AOTF, מערכת Pecon XL multiS1 שלב דגירה, דגירת Zeiss מודולים (O 2 מודול S, CO 2 מודול S, S TempModule, ההסקה XL S) ומו לפנישלב torized XY עם תותב NanoScanZ piezo Z. כדי למזער את הסטיות כדוריות ואילו תאים חיים הדמיה תמכו במדיום מימי, 63x/1.20 מי C-Apochromat / קור אובייקטיבי עדשה ונוזל Zeiss Immersol W טבילה (עם מקדם שבירת n = 1.334) היו בשימוש. לערוץ 2 confocal הדמיה, RQFT מראה וBP525/50 Dichroic 405/488/568/647 (ירוק) וBP629/62 (אדום) מסנני פליטה היו בשימוש. תוכנת המערכת המשמשת הייתה Zeiss AxioVision (גרסה. 4.8.2.0) עם AV4 Multi-channel/Z/T, הדמיה מהירה, פיזיולוגיה, MosaiX, מארק ומצא, מצלמה כפולה, בתוך 4D, פוקוס אוטומטי ומודולים Deconvolution 3-D. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא פועל כי 2 גז CO 2 למודול CO של מערכת הדגירה. אם מיקרוסקופ נתמך על ידי שולחן אוויר נגד רעידות, הדלק את אספקת האוויר (או 2 גז N) לשולחן האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הכח לעמדת מיקרוסקופ, יחידה מסתובבת דיסק, מצלמות, מודולים דגירה, מאייר HXP, שלב ממונע, ארגוןליזר, ומחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 1 דקות של זמן חימום, סובב את מפתח ההצתה לארגון הליזר ל&quot; ב &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוח הבקרה של ליזר Zeiss, מפעיל את המתגים לקווי הליזר לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את המתג עבור בקר Lasos ארגון הליזר מ&quot; מתנה &quot;ל&quot; טווח ליזר&quot; ולהתאים את בקר האור לרמה האופטימלית (כלומר בדיוק מתחת לנקודה שבה החיווי הירוק הופך לאדום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את AxioVision תוכנה. הערה: ממשק המשתמש עבור AxioVision יכול להיות מותאם אישית עם תפריטים וחלונות נפתחים שהם ספציפיים למיקרוסקופ במיוחד ורכיבים שהיא שולטת. ככזה, לכל מערכת יש ממשק פוטנציאל ייחודי. לכן, הנחיות כלליות למניפולצית תוכנה מסופקות בשלבים הבאים, ולא לכיווני חלונות ספציפיים תוכנה, כרטיסיות ו / או בתפריטים נפתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 1 שעות לפני ההדמיה, בתוכנה, לאתר את הפקדים לחממה ולהפעיל את החימום לחדר העליון ואת צלחת השלב. הגדר את הטמפרטורה עד 37 מעלות צלזיוס הפעל 2 שליטת CO ולהגדיר את הרמה של 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את העדשה האובייקטיבית להדמיה. במחקר זה, עדשת 63x/1.20 NA C-Apochromat מים / קור אובייקטיבי שמשה הערה:. לעדשה, בינוני טבילה עם מדד דומה למים (נוזל טבילת Zeiss Immersol W) שבירה הוא זקוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם עמדות נפרדות מרובות הן שידגמו על פני תקופה ארוכה של זמן, כדי להיות בטוח יש למרוח כמות מספקת של מדיום טבילה כדי לוודא שהיא מתבצעת מתפקיד אחד למשנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הצלחת על הבמה ולהביא את העדשה האובייקטיבית עד במגע עם התחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שימוש בפקדי מיקרוסקופ או בתוכנה, לכוון את האור הנפלט לעינית ובחר את המתאים widefield המסנן נקבע לאות הניאון של עניין (לצורך מחקר זה, &quot;אדום&quot; מסנן נקבע ל53BP1 ו&quot; GFP &quot;מסנן נקבע לH2B ). &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפו דרך העדשות העיניות, להתמקד בתמונה, ולאתר את השדה מתאים של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> או באמצעות תוכנה או פקדי מיקרוסקופ, לכוון את האור הנפלט מאת העינית ליציאה עם יחידת דיסק ספינינג confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה, להפעיל את הליזר המתאים (למחקר זה, ליזר ננומטר 561 ל53BP1 וקו 488 ננומטר של ארגון הליזר לH2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל ערוץ, להתאים את עוצמת הליזר על ידי התאמת מסנן השליטה מתכוננת acousto האופטית (AOTF) לרמה מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את המראה המתאים Dichroic (RQFT 405/488/568/647) ומסנני פליטה (BP 629/62 ל53BP1 וBP 525/50 לH2B). לפתוח את התריס ליחידת דיסק ספינינג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את החלון &quot;החי&quot; כדי להציג את השדה הנוכחי של נוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה, פתח את השליטה &quot;המצלמה&quot;, לבחור את המצלמה לשימוש (אם מערכת מצלמה כפולה) ולהגדיר את זמן חשיפה לכ 100 מילישניות. התאם% ו EM לקבל כמו נמ&quot;אהערת essary:. מבנה 53BP1-mCherry מופיע מעט עמום. מצאנו את זה מועיל כדי להגדיל את רווח EM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה, פתח את השליטה ליחידת דיסק ספינינג confocal ולהתאים את מהירות הדיסק מסתובב על ידי הזנת זמן חשיפת המצלמה שהוקם כדי ללכוד תמונה מתאימה (לדוגמה: ~ 100 ms). לחץ על &quot;גדר&quot; כדי לנעול בשינוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח &quot;רכישה רבה ממדית&quot;. בחר בכרטיסיית הערוץ ולטעון / לבחור ערוצים מתאימים. במחקר זה, אנו משתמשים בערוצים שהוגדרו לdsRed (561 ננומטר עירור ליזר ו-BP 629/62 מסנן לפליטה) וה-GFP (488 ננומטר קו ליזר לעירור וBP525/50 מסנן לפליטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח רישום תמונה, מראה Dichroic משותף (RQFT 405/488/568/647) שמש לשני הערוצים. הגדר את התוכנה ל&quot; פוקוס אוטומטי &quot;. הערה: עבור לעורך כלי → הגדרות כדי להתאים את ההגדרות של מד&quot;א. ודא שעוצמת הליזר הנאותה מוגדרת (&quot;כוח הליזר הולם&quot; מתייחס להגדרה המאפשרת לךכדי להלהיב fluorophore המתאים תוך מזעור תמונת הלבנה-). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון מד&quot;א, בחר בכרטיסיית Z-המחסנית. בחר &quot;Z-מחסנית במיקום המוקד הנוכחי&quot;. הגדר את הטווח ל~ 10 מיקרומטר Z-עורם ולבחור &quot;אופטימלי&quot; למספר צעדים על מנת להבטיח דגימת נייקוויסט דרך הערת ז&#39;: הגודל המדויק של Z-המחסנית יהיה תלוי בגובה של התאים שלך. בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 23. לחץ על &quot;התחל&quot; ולנתח את תמונת Z-מחסנית כתוצאה כדי להבטיח את ההגדרות מתאימות למה שאתה חוקר (למשל במחקר זה, היה חשוב לכל תמונה לגרעין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;T&quot; (זמן). לניסוי שלנו עם camptothecin, אנו קובעים את המרווח בין נקודתי זמן הדמיה עד 5 דקות והמשך הכולל של הישיבה לשעה 1 עבור וידאו שליטה (תאים שאינם מטופלים). הערה: כדי למזער את תמונת הלבנה-של התאים, הניסוי צריך להיות מוגדר כך שAOTF חסר הליזר בין נקודתי זמן הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fאו הדמיה מרובה נקודות של מספר תאים במנה, בחלון מד&quot;א, בחר בכרטיסיית המיקום. ודא &quot;החל&quot; הגדרה לפני / אחרי נקודת זמן העמדה ל&quot; מסומנת. בחר &quot;Mark_Find&quot;. שימוש בתצוגה &quot;החייה&quot;, להזיז את קערת האוכל ובחר בשדות מתאימים של תצוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;התחל&quot; בתפריט רב ממדי הרכישה כדי להתחיל את הניסוי ולהקליט וידאו שליטה (של תאים שלא טופלו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר וידאו השליטה, להוסיף את הטיפול המתאים (במקרה זה, camptothecin מיקרומטר 10). הקלטנו וידאו הניסיוני (תאים שטופלו בתרופה) במרווחי דקות 5-10 ל2-4 שעות. הערה: נושא חשוב שיש לשקול הוא המהירות שבה השפעת נתונה מתרחשת לאחר טיפול. כפי שניתן לראות בוידאו, 53BP1 המוקדים יתחילו מ~ 5 דקות אחרי תוספת של CPT. למרות תהליך קל יחסית, והוסיף תרופה למנה ידנית וכיול מחדש-מיקרוסקופ עושה ייקח זמן. שיקול שצריך לתת לזה בעת תכנון ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניטור מ &#39;itosis, אנו קובעים את המרווח ל -7.5 דקות ורשמנו ל4-5 שעות (ההגדרות הספציפיות תלויות בקו הסלולרי בשימוש, ואורכו של מחזור התא שלו). התאמות ייתכן שיהיה הצורך נעשתה כדי למנוע הלבנה-תמונה במהלך הקלטה ארוכה יותר. </li></ol> עיבוד וניתוח תמונת ג פרוטוקול זה פותח באמצעות תוכנת Volocity (PerkinElmer). תוכנה המשמשת לאיסוף נתונים זה (AxioVision) יש גם את היכולת לעבד ולנתח תמונות. משתמשים מוזמן לנצל את התוכנה הזמינה להם, ולהתייעץ ספרות מתאימה לגבי היישום שלהם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת Volocity. צור ושם ספרייה חדשה, ולייבא את קבצי הווידאו שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצפייה בקבצים, אנחנו בדרך כלל למצוא את זה מועיל ביותר לשימוש בהגדרה &quot;המורחבת הפוקוס&quot;. זה כופה את פרוסות Z-מחסנית ו, עבור פרוטוקול זה, מאפשר לנו לדמיין מוקדי 53BP1 באזורים שונים של הגרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם קטעי וידאו על פי צורך. ווlocity מצויד במגוון רחב של כלים כדי לשפר את איכות תמונות שנרכשו. על ידי הקפדה על ההגדרות במיקרוסקופ היו מתאימות, הרבה זמן ניתן לשמור בעריכה מאוחר יותר. לעתים קרובות, כדאי deconvolve התמונות שלך, ולהתאים את הבהירות / ניגודיות. צרכי העריכה הספציפיים שלך ישתנו בהתאם לניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חותמת זמן יחסית וסרגל קנה מידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצפייה בתאים ב3-D, מעבר להגדרת &quot;3-D האטימות&quot;. זה מאפשר סיבוב של התאים שניתנו 3-D בחלל, ובכך לספק פרספקטיוות שונות על מבנים של עניין בתוך התאים. הערה: זה מועיל לחזות תאים במישורים שונים כדי לקבוע היכן מבנים של נסיעות ריבית. לדוגמה, בהגדרה &quot;המורחבת הפוקוס&quot; קשה להבחין ש53BP1 אין, למעשה, לנתק מהדנ&quot;א במהלך מיטוזה. עם זאת, זה ברור מב 3-D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרטים ותמונות סטילס יכולים להיות מיוצאים למגוון סוגי קבצים המבוססים על העדפת משתמש. </l<html> i&gt; </ol> תוצאות מייצגות ד דוגמה להיווצרות 53BP1 מוקדים בתגובה לCPT מוצגת באיור 1. תאים נחשפים לצורת CPT מוקדים בתוך דקות 5-10, ולשמור על המוקדים האלה לכל אורך הקלטה. כפי שמוצג באיור 2, 53BP1 מנתק מהכרומטין בתחילתם של מיטוזה, יוצר אובך דק סביב הכרומוזומים העיבוי. כtelophase מתרחש מיטוזה ומגיעה לסיומו, שוב אגרגטים 53BP1 למוקדים נפרדים. בעוד HEK293 התאים לא היו חשופים לCPT, הם בכל זאת נוצרו מוקדים בשפע, ספונטניים 53BP1 תיקון שנוצרו על ידי ניזק לדנ&quot;א אנדוגני. התבוננות זו אפשרה לנו להגיע למסקנה ש53BP1 אינו מהווה מוקדים במהלך מיטוזה מוקדם, בקנה אחד עם דו&quot;ח קודם שהראה השפעה דומה לאחר חשיפת תאים לקרינה מייננת ותרופות radiomimetic 5. יור 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg &quot;/&gt; האיור 1. Camptothecin (10 מיקרומטר) גורם DSBs והיווצרות המוקדים 53BP1 ברכיבה על אופני fibroblasts בתוך 30 דקות של הוספת התרופה לבינונית. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> איור 2. 53BP1 אינו מהווה מוקדים במהלך מיטוזה עד telophase/G1 בHEK293 תאים.

<ol>
	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).</li><li>Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fluorescence+imaging+of+live+cells+by+effective+cytosolic+delivery+of+probes.">Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes.</a> PLoS One. 5, e10459 (2010).</li><li>Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שמירה על שלמות גנטית היא חיונית להישרדות תא. כישלון כדי לשמר את התוצאות הגנום במוקדם, היווצרות הסרטן, הזדקנות או מות 8. יש עניין רב בהבחנה כמה פונקציות DDR, נובעות מחשיבותו למחקר בסיסי וקליני. טכניקות רבות פותחו במשך השנים כדי לסייע במחקר של כמה תאים לזהות ולתקן ני...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מוצר </td><td> חברה </td></tr><tr><td> מנות תרבות CellStar </td><td> גריינר ביו אחד </td></tr><tr><td> מנות תחתית זכוכית FluroDish </td><td> עולם מכשירי דיוק, Inc </td></tr><tr><td> MEM תקשורת </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> חומצות אמינו לא חיוניות </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> חומצות אמינו </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> ויטמינים </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> פירובט נתרן </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-WT 53BP1 pLPC-Puro; 19836 פלסמיד </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; 17735 פלסמיד </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss סלולרי אובזרוור SD הדמית המערכת </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (מהדורה 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W שמן </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> תוכנת Volocity (גרסה 6.0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

הפסקות כפולות גדיל (DSBs) הן DNA המזיק ביותר נגעי תא יכול להיתקל. אם יצא שלא תוקן, פוטנציאל גדול DSBs נמל לייצר מוטציות וליקויים כרומוזומליים 1. כדי למנוע הטראומה הזאת מcatalyzing חוסר יציבות גנומית, זה קריטי לתאים כדי לזהות DSBs, להפעיל את תגובת הניזק לדנ&quot;א (DDR), ולתקן את ה-DNA. כאשר מגורה, DDR עובד כדי לשמור על שלמות גנטית על ידי מפעילת עצירת מחזור תא כדי לאפשר תיקון להתקיים או לאלץ את התא כדי לעבור אפופטוזיס. המנגנונים הבולטים של תיקון DSB מתרחשים דרך nonhomologous הסוף מצטרף-(NHEJ) וההומולוגי רקומבינציה תיקון (הרר) (שנסקר ב2). יש חלבונים רבים שפעילות חייבת להיות דווקא מתוזמרת לDDR כדי לתפקד כראוי. בזאת, אנו מתארים שיטה ל2 - ויזואליזציה 3-ממדית (ד &#39;) של אחד מהחלבונים האלה, 53BP1. חלבון p53 מחייב 1 (53BP1) localizes לתחומיםDSBs על ידי הקשירה לההיסטונים שונים 3,4, ויצר מוקדים בתוך 5-15 דקות 5. השינויים והגיוס של חלבוני היסטון 53BP1 ואחרים DDR לאתרי DSB הם האמינו כדי להקל על ההתארגנות המבנית של הכרומטין סביב אזורים של ניזק ולתרום לתיקון דנ&quot;א 6. מעבר להשתתפות ישירה בתיקון, תפקידים נוספים כבר תאר ל53BP1 בDDR, כגון הסדרת מחסום S תוך, מחסום G2 / M, והפעלת DDR חלבונים במורד זרם 7-9. לאחרונה, התגלה כי 53BP1 אינו מהווה מוקדים בתגובה לניזקי DNA הנגרמים במהלך מיטוזה, במקום לחכות לתאים להיכנס G1 לפני localizing לסביבה של 6 DSBs. חלבוני DDR כגון 53BP1 נמצאו לקשר עם מבני mitotic (כגון kinetochores) במהלך ההתקדמות במיטוזה 10. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש של 2 ו - 3-D הדמיה חייה תא לדמייןהיווצרות 53BP1 המוקדים בתגובה לדנ&quot;א סוכן camptothecin המזיק (CPT), כמו גם התנהגותו של 53BP1 במהלך מיטוזה. Camptothecin הוא topoisomerase אני מעכב שבעיקר גורם DSBs במהלך שכפול הדנ&quot;א. כדי להשיג זאת, השתמש חלבון היתוך ניאון תואר קודם 53BP1-mCherry לבנות מורכב מחלבון תחום 53BP1 מסוגלת להיקשר 11 DSBs. בנוסף, השתמש חלבון היתוך ניאון היסטון H2B-GFP לבנות מסוגל לפקח דינמיקת הכרומטין לאורך מחזור התא אך בפרט במהלך 12 מיטוזה. הדמית תא חייה בממדים רבים היא כלי מצוין להבנה מעמיקה יותר של התפקוד של חלבונים בתאי DDR האיקריוטים.

Watch this Scientific Journal Video about Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins at JoVE.com

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחשת DNA חלבון איתות הפסקה כפולת גדיל הופעל בתגובה לניזק לדנ&quot;א, כמו גם הלוקליזציה שלה במהלך מיטוזה.

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

two-three-dimensional-live-cell-imaging-dna-damage-response

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Views.  Virginia Commonwealth University. פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחשת DNA חלבון איתות הפסקה כפולת גדיל הופעל בתגובה לניזק לדנ"א, כמו גם הלוקליזציה שלה במהלך מיטוזה.

Video: Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Cancer Research

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Genetics

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of programmed DNA breaks in lymphocytes. The Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM- and Rad3-Related kinase (ATR) and the catalytic subunit of DNA-dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) are among the first that are activated upon induction of DNA damage, and are central regulators of a network that controls DNA repair, apoptosis and cell survival. As part of a tumor-suppressive pathway, ATM and ATR activate p53 through phosphorylation, thereby regulating the transcriptional activity of p53. DNA damage also results in the formation of so-called ionizing radiation-induced foci (IRIF) that represent complexes of DNA damage sensor and repair proteins that accumulate at the sites of DNA damage, which are visualized by fluorescence microscopy. Co-localization of proteins in IRIFs, however, does not necessarily imply direct protein-protein interactions, as the resolution of fluorescence microscopy is limited. 
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a novel technique that allows the direct visualization of protein-protein interactions in cells and tissues with unprecedented specificity and sensitivity. This technique is based on the spatial proximity of specific antibodies binding to the proteins of interest. When the interrogated proteins are within ~40 nm an amplification reaction is triggered by oligonucleotides that are conjugated to the antibodies, and the amplification product is visualized by fluorescent labeling, yielding a signal that corresponds to the subcellular location of the interacting proteins. Using the established functional interaction between ATM and p53 as an example, it is demonstrated here how PLA can be used in suspension cell cultures to study the direct interactions between proteins that are integral parts of the DNA damage response.

Here, it is demonstrated how the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) can be used to detect and visualize the direct protein-protein interactions between ATM and p53 in suspension cell cultures exposed to genotoxic stress.

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Biochemistry

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair complexes. This process is regulated by a myriad of proteins that promote the association and disassociation of proteins to these lesions. Thanks in large part to the ability to perform functional screens of a vast library of proteins, there is a greater appreciation of the genes necessary for the double-strand DNA break repair. Often knockout or chemical inhibitor screens identify proteins involved in repair processes by using increased toxicity as a marker for a protein that is required for DSB repair. Although useful for identifying novel cellular proteins involved in maintaining genome fidelity, functional analysis requires the determination of whether the protein of interest promotes localization, formation, or resolution of repair complexes. 
The accumulation of repair proteins can be readily detected as distinct nuclear foci by immunofluorescence microscopy. Thus, association and disassociation of these proteins at sites of DNA damage can be accessed by observing these nuclear foci at representative intervals after the induction of double-strand DNA breaks. This approach can also identify mis-localized repair factor proteins, if repair defects do not simultaneously occur with incomplete delays in repair. In this scenario, long-lasting double-strand DNA breaks can be engineered by expressing a rare cutting endonuclease (e.g., I-SceI) in cells where the recognition site for the said enzyme has been integrated into the cellular genome. The resulting lesion is particularly hard to resolve as faithful repair will reintroduce the enzyme's recognition site, prompting another round of cleavage. As a result, differences in the kinetics of repair are eliminated. If repair complexes are not formed, localization has been impeded. This protocol describes the methodology necessary to identify changes in repair kinetics as well as repair protein localization.

Repair of double-strand DNA breaks is a dynamic process, requiring not only formation of repair complexes at the breaks, but also their resolution after the lesion is addressed. Here, we use immunofluorescence microscopy for transient and long-lasting double-stranded breaks as a tool to dissect this genome maintenance mechanism.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון וקינטיקה ב DNA נגעים מתקדמות

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is essential in revealing cellular events associated with the recruitment and assembly of DNA repair complexes at the site of DNA damage. In the last few years, several powerful tools have been developed to induce site-specific DNA damage. Moreover, novel seminal techniques allow us to study these processes at the single-cell resolution level using both fixed and living cells. Although these techniques have been used to study various biological processes, herein we present the most widely used protocols in the field of DNA repair, Fluorescence Immunostaining (IF) and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), which in combination with endonuclease-based site-specific DNA damage make it possible to visualize and quantify the genomic occupancy of DNA repair factors in a directed and regulated fashion, respectively. These techniques provide powerful tools for the researchers to identify novel proteins bound to the damaged genomic locus as well as their post-translational modifications necessary for their fine-tune regulation during DNA repair.

This article introduces essential steps of immunostaining and chromatin immunoprecipitation. These protocols are commonly used to study DNA damage-related cellular processes and to visualize and quantify the recruitment of proteins implicated in DNA repair.

הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

הדמיה של תאים חיים של פעילות תמלול בהפסקות דו-סטרנד DNA

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

Immunofluorescence-Based Visualization of DNA Repair Protein Interactions

Source: de la Pe&#241;a Avalos, B., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/61447">Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence.</a> J. Vis. Exp. (2020).
In this video, we describe the immunofluorescence method to visualize the localization of the DNA repair proteins &#947;H2AX and 53BP1 at the sites of double-strand DNA breaks in irradiated cell nuclei.

הדמיה מבוססת אימונופלואורסנציה של אינטראקציות חלבון תיקון DNA

Source: de la Pe&#241;a Avalos, B., et al., Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (2020).
In this video, we ...

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ"א

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video