עבודה זו נתמכת על ידי R01-HD058629 לIEZ

1. הכנת מאכלי ECM המצופים תרבות או Coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון מניית ECM ידי המסת מצע ECM ב PBS (של Dulbecco פוספט שנאגר מלוח, Invitrogen, # 14040-133). סנן באמצעות מזרק 0.2 מ&quot;מ מסנן (VWR, # 28145-495) וקיפאון בaliquots ב-80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל פתרון מניית ECM ב PBS לריכוז רצוי. לMaxGel, לדלל בDMEM (שינוי הנשר הבינוני של Dulbecco, Invitrogen, # 11995-065). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יבוצע immunofluorescence, לעקר 12 coverslips זכוכית עגולה מ&quot;מ (VWR, # 89015-724) על ידי הטבילה באתנול ולאפשר לייבוש באוויר. זה צריך להיעשות בברדס מינרית סטרילי. אם immunofluorescence לא יבוצע דלג לשלב 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום לעקר coverslips בכל אחד גם מצלחת גם 24 (קורנינג, # 3526). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל של תמיסה מדוללת מצע לכל אחד גם מצלחת 24 היטב ולדגור בטמפרטורת חדר למשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון ECM ולשטוף threזמני דואר בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את PBS ולהשתמש באופן מיידי או עטוף בparafilm ומאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות. </li></ol> 2. הכנת כלים לנתיחה צלחות Sylgard עם פחם הוסיף מוכנות לפרוטוקול של הייצור. הרקע השחור העמיד בלוחות אלה מספק תמיכה עבור מצמיד את העובר והצבע מציע ניגודיות טובה המאפשרת לדמיין את העובר השקוף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין צלחות שוקלים ישירות לתוך כוס שלוש לשפוך על חלק איזון 150 גרם נוזלי 15 גר &#39;חלק ב&#39; וגרם אבקת פחם 1 (מכשירי Precision העולם, # SYLG184). מערבב יחד בעזרת מקל ארטיק מעץ או depressor לשון. יוצק לתוך כוס או 100 סנטימטר מנות פלסטיק. השתמש במבער גז קטן שנערך בערך 10 עד 12 סנטימטרים מעל את הכלים כדי לשרוף את כל בועות. מכסי מקום על צלחות ותנו לו לשבת לפחות 24 שעות כדי להגדיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את כלי נתיחה להוסיף Minutien סיכה (0.1 המ&quot;מ diameter) לבעל סיכה (כלים מדעיים, יפים # # 26002-10 ו26018-17, בהתאמה) לחלופין 26 מחטי מד (BD, # 309597) הכפופות בזווית ישרה בעזרת מלקחיים עשוי לשמש כביתור מכשירים. דומונט # 5 מלקחיים חדדו סטודנטים (כלי מדע פיין, # 91150-20) באמצעות אבן השחזה (כלים מדעיים פיין, # 29008-22). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל כלי הנתיחה עם אתנול 70% לפני השימוש. </li></ol> 3. אוסף של עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את עכבר ההריון תזמן בימי ההודעה coitum 8.5 בהתאם לתקנות ועדה לשימוש בבעלי חיים ולהסיר רחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רחם מקום בצלחת פטרי פלסטיק עם סטרילי PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרחם פעם עם PBS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ נתיחת עובר להסיר בזהירות מdeciduas באמצעות זוג המלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת קרומי extraembryonic ולשמור לgenotyping במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב עובר על ידי ספירת somites. השלבים האידיאליים לעשות explants לנתח הסלולרי Behאביאור בגובה קיפול עצבי יהיה בין 6 ל 10 שלבי somite כאשר הקפלים העצביים רק מתחילים לרומם ולפני המורפוגנזה העיקרית של mesenchyme הגולגולת מתרחשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את העובר בPBS. מקום בצלחת sylgard שחורה עם DMEM המכיל לא אדום פנול (Invitrogen, # 21063-029). הסר את קרומי extraembryonic ולשמור לgenotyping במידת הצורך. </li></ol> 4. הכנת explants <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקד מחדש מיקרוסקופ בהגדלה הגבוהה ביותר האפשרית על אזור הראש של העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע חתכים עם מחט לנתיחה בכל יד. השתמש במחט אחת להחזיק את הרקמה במקום ואחר לקיצוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הראש של העובר הקדמי לrhombomeres. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך לאורך קו האמצע לחוצה את הראש לשני חצי שווים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך סביב לשולי הראש וקו האמצע. קיצוצים אלה יסירו את פסגת premigratory ואקטודרם פני שטח בגבול החיצוני וצלחת prechordal בקו האמצע. הרקמה הנותרת תהיה explant ותכיל פסגה נודדת גולגולת העצבית, מזודרם ואקטודרם הפרקסיאלית פני שטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כרקמה היא לחתוך, להסיר שאריות גזורות מהתבשיל באמצעות פיפטה פסטר סטרילי. זה מונע מבלבל explant עם הפסולת הגזורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות explant ידי pipeting מעלה ומטה עם 20 פיפטה קצה μl וpipetman. זו תסיר תאים רופפים מצורפים ולמנוע קצוות משוננים על explants. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להרים את כל explant בכ 10 μl של נוזל בעזרת 20 טיפ פיפטה μl וpipetman ומקום במרכז התרבות המצופית היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של תקשורת התרבות והשלמה עם 15% FBS לכסות explant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת מקום בתרבות רקמות חממת humidified (5% CO 2, 37 המעלות צלזיוס) במשך 1-2 שעות כדי לאפשר explant לצרף לתחתית הקערה. צפו תקופתי כדי לוודא שלא יתייבש explantהחוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר explant צרף, מוסיף בזהירות לכל גם 250 DMEM μl השלים עם FBS 10% שכבר חמם עד 37 מעלות צלזיוס בwaterbath. ברגע explants צרף הם לא יזוזו בעת הצלחת מתערערת בעדינות מתחת למיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר מנה לרקמות תרבות חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, את explants יהיה מחובר היטב ותאים יתחילו להגר. בשלב זה סוכנים תרופתיים ניתן להוסיף לתקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 שעות לאחר ציפוי, תאים הגרו מexplants. המרחק הגר יכול להיות חזותי והדמיה. אנחנו בדרך כלל לעצור את התרבות בשלב זה מאז explants מתחיל להראות סימנים של כדאיות פחתה עם incubations הארוך יותר. יכול לשמש גם חיוני כתם כגון acridine כתום או כחול trypan כדי לבדוק את הכדאיות של explant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה ניתן לרכוש תמונות לתעד את המרחק ומספר התאים שנודדים מexplant. לחלופין, אם explants היה מצופה על coverslips,הם יכולים להיות קבועים וניתוחי immunohistochemical בצעו לדמיין חלבונים של עניין. </li></ol> צעדים קריטיים בפרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך explants של בערך באותו הגודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות את כל פסולת הנתיחה מהצלחת לנתח כמו שאתה לנתח כדי להימנע מפסולת מבלבל עם רקמת explanted הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר explants ציפוי בבארות או בcoverslips מקפיד להציב טיפה של תקשורת עם explant במרכז היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר explant מספיק זמן כדי לצרף לפני ההצפה היטב עם תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנאי טיפול צריכים להיות אחידים לכל מצע מבחן ותרופתי בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני explants יכול להתבצע מכל עובר (אחד מימין ואחד מהימין של הצינור העצבי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשבדוק הגירה של תאים מקווי עכבר מוטציה תחת תנאי ניסוי שונים, לשים explant 1 מוטציה בקבוצת הביקורת והשנייה בקבוצה שטופלה. </li></ol> פתרון בעיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ייכשל explants לצרף, להגדיל את הזמן המוקצב לקובץ מצורף. מניסיוננו, כמחצית מexplants לא לצרף וexplants הגדול יותר לדבוק בצורה יעילה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם explants לצרף לפריפריה של באר שזה יהיה קשה לתמונה. הקפד למקם explants במרכז הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן אידיאלי explants יהיה בערך באותו הגודל. עם זאת, הבדלים בגודל explant ניתן לתקן לשימוש בקוטר של explants כגורם תיקון כאשר quanitating נדידה של תאים מexplants. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם זיהום מתרחש להיות בטוח תנאי עבודה סטריליים נמצאים בשימוש. כל הכלים ומשטחי עבודה צריכים להיות מעוקרים עם אתנול 70%. Pipets וצלחות פטרי צריך להיות חדשים וסטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם explants מקבל אבד במהלך הנתיחה, מעת לעת להסיר פסולת כדי למנוע לאבד explant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאסטרינג הנתיחה היא גוזל זמן ודורשת תרגול. Optimal גדלה, כלים חדים נתיחה ועזרת מחטים. </li></ol>

<ol>
	<li>Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurulation+in+the+cranial+region--normal+and+abnormal.">Neurulation in the cranial region--normal and abnormal.</a> Journal of anatomy. 207, 623-635 (2005).</li><li>Fleming, A., Gerrelli, D., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+normal+and+abnormal+neurulation:+evidence+from+embryo+culture+studies.">Mechanisms of normal and abnormal neurulation: evidence from embryo culture studies.</a> The International Journal of Developmental Biology. 41, 199-212 (1997).</li><li>Copp, A. J., Greene, N. D., Murdoch, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+mammalian+neurulation.">The genetic basis of mammalian neurulation.</a> Nat. Rev. Genet. 4, 784-793 (2003).</li><li>Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+fibronectin,+laminin+and+entactin+in+the+neurulating+rat+embryo+studied+by+indirect+immunofluorescence.">The distribution of fibronectin, laminin and entactin in the neurulating rat embryo studied by indirect immunofluorescence.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 94, 95-112 (1986).</li><li>Tuckett, F., Morriss-Kay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcian+blue+staining+of+glycosaminoglycans+in+embryonic+material:+effect+of+different+fixatives.">Alcian blue staining of glycosaminoglycans in embryonic material: effect of different fixatives.</a> The Histochemical Journal. 20, 174-182 (1988).</li><li>Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+mesenchyme+in+mouse+neural+fold+elevation.+II.+Patterns+of+hyaluronate+synthesis+and+distribution+in+embryos+developing+in+vitro.">The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. II. Patterns of hyaluronate synthesis and distribution in embryos developing in vitro.</a> The American Journal of Anatomy. 188, 133-147 (1990).</li><li>Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+mesenchyme+in+mouse+neural+fold+elevation.+I.+Patterns+of+mesenchymal+cell+distribution+and+proliferation+in+embryos+developing+in+vitro.">The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. I. Patterns of mesenchymal cell distribution and proliferation in embryos developing in vitro.</a> The American Journal of Anatomy. 188, 121-132 (1990).</li><li>Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+mesenchymal+cell+and+hyaluronate+distribution+correlate+with+in+vivo+elevation+of+the+mouse+mesencephalic+neural+folds.">Changes in mesenchymal cell and hyaluronate distribution correlate with in vivo elevation of the mouse mesencephalic neural folds.</a> Anat. Rec. 226, 383-395 (1990).</li><li>Yoshida, T., Vivatbutsiri, P., Morriss-Kay, G., Saga, Y., Iseki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+in+mammalian+craniofacial+mesenchyme.">Cell lineage in mammalian craniofacial mesenchyme.</a> Mech. Dev. 125, 797-808 (2008).</li><li>Noden, D. M., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relations+and+interactions+between+cranial+mesoderm+and+neural+crest+populations.">Relations and interactions between cranial mesoderm and neural crest populations.</a> Journal of anatomy. 207, 575-601 (2005).</li><li>Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+origins+and+interactions+in+the+mammalian+skull+vault.">Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault.</a> Dev. Biol. 241, 106-116 (2002).</li><li>Morriss-Kay, G. M., Tuckett, F., Solursh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+Streptomyces+hyaluronidase+on+tissue+organization+and+cell+cycle+time+in+rat+embryos.">The effects of Streptomyces hyaluronidase on tissue organization and cell cycle time in rat embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 98, 59-70 (1986).</li><li>Morriss-Kay, G., Tuckett, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localisation+of+chondroitin+sulphate+proteoglycans+and+the+effects+of+chondroitinase+ABC+in+9-+to+11-day+rat+embryos.">Immunohistochemical localisation of chondroitin sulphate proteoglycans and the effects of chondroitinase ABC in 9- to 11-day rat embryos.</a> Development. , 106-787 (1989).</li><li>Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparitinase+treatment+of+rat+embryos+during+cranial+neurulation.">Heparitinase treatment of rat embryos during cranial neurulation.</a> Anat. Embryol. (Berl). 180, 393-400 (1989).</li><li>Sarkar, A. A., Zohn, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hectd1+regulates+intracellular+localization+and+secretion+of+Hsp90+to+control+cellular+behavior+of+the+cranial+mesenchyme.">Hectd1 regulates intracellular localization and secretion of Hsp90 to control cellular behavior of the cranial mesenchyme.</a> The Journal of Cell Biology. 196, 789-800 (2012).</li><li>Zohn, I. E., Anderson, K. V., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hectd1+ubiquitin+ligase+is+required+for+development+of+the+head+mesenchyme+and+neural+tube+closure.">The Hectd1 ubiquitin ligase is required for development of the head mesenchyme and neural tube closure.</a> Dev. Biol. 306, 208-221 (2007).</li><li>Chen, Z. F., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist+is+required+in+head+mesenchyme+for+cranial+neural+tube+morphogenesis.">Twist is required in head mesenchyme for cranial neural tube morphogenesis.</a> Genes Dev. 9, 686-699 (1995).</li><li>Tzahor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonists+of+Wnt+and+BMP+signaling+promote+the+formation+of+vertebrate+head+muscle.">Antagonists of Wnt and BMP signaling promote the formation of vertebrate head muscle.</a> Genes Dev. 17, 3087-3099 (2003).</li><li>Lumsden, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+epithelium+and+the+role+of+neural+crest+cells+in+the+initiation+of+the+mammalian+tooth+germ.">Spatial organization of the epithelium and the role of neural crest cells in the initiation of the mammalian tooth germ.</a> Development. 103, 155-169 (1988).</li><li>Newgreen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+explants+of+embryonic+chick+mesenchymes+and+epithelia+on+fibronectin+and+laminin.">Spreading of explants of embryonic chick mesenchymes and epithelia on fibronectin and laminin.</a> Cell and tissue Research. 236, 265-277 (1984).</li><li>Peyton, S. R., Ghajar, C. M., Khatiwala, C. B., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+ECM+mechanics+and+cytoskeletal+tension+as+important+regulators+of+cell+function.">The emergence of ECM mechanics and cytoskeletal tension as important regulators of cell function.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 47, 300-320 (2007).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

השיטה מיושמת כאן מספקת assay חזק כדי לבחון את התנהגותם של תאי mesenchyme גולגולת. בנוסף לניתוחים סטטיים שהוצגו כאן, לחיות ניסויי הדמיה בשדה בהיר או בשילוב עם ביטוי של חלבוני ה-GFP שכותרתו, יכול להיות מועסק על מנת לבחון את התנהגותם של תאים בזמן אמת כפי שהם נודדים מexplant. לניסויי הדמיה חיים, explants יכול להיות מתויג עם DiI או להבדיל הגירה של רכס עצבי ממזודרם הפרקסיאלית, רוזה-YFP; Mesp1-cre או Rosa-YFP; Wnt1-cre או קווים הטרנסגניים אחרים יכול לשמש. אינטראקציות גולגולת mesenchyme-ECM גם ניתן לבחון ניצול assay explant זה. כאן אנו explants צלחת על מצעי ECM שונים שנמצאים בmesenchyme גולגולתי להראות כי תאים נודדים על אלה בדרגות שונות ושECM משפיע על המורפולוגיה של התאים. יתר על כן, explants יכול להיות מוטבע במטריצה ​​תלת ממדים כדי לגשת להתנהגויות של cells בהקשר זה. assay explant זה amendable לניתוח של ההשפעה של מניפולציות גנטיות ותרופתיות על התנהגויות mesenchyme גולגולת לניתוח אותות פנימיים וחיצוניים שיכול לווסת ולשנות הגירה. לדוגמה, אנו מנוצלים assay זה במחקרים שלנו להבחין בתפקיד של Hsp90 הפרשה עודפת בהתנהגויות החריגות בסלולריות mesenchyme גולגולתי מוטצית Hectd1 15. בניסויים אלה, התייחסו explants עם נוגדן אנטי Hsp90, Hsp90 חלבון, geldanamycin וDMA (amelioride דימתיל) כדי לחסום את ההפרשה של Hsp90 להוכיח כי ההתנהגות החריגה של תאים מוטנטים Hectd1 נובעת Hsp90 15 תאיים עודפים. גישות דומות יכולות לשמש פרמקולוגית לנתח מסלולים נוספים העומדים בבסיס המורפוגנזה נורמלית או לא נורמלית של mesenchyme גולגולתי. לאחר הבדיקה תושלם, explants ותאים נודדים יכולים להיות מנותח על ידי שורה של שיטות. לדוגמה, ג ניתוחים immunohistochemicalלהיות מועסק על מנת לבחון את הלוקליזציה של חלבונים חשובים לתנועות תא. ניתוחי transcriptome גם יכולים להיות מועסקים על מנת לקבוע כיצד ישפיע טיפול על ביטוי גנים. מגבלה משמעותית אחד של טכניקה זו היא שזה לא התנהגויות מודל בשלושה ממדים כפי שהם מתרחשים בגוף חי. השינוי של הפרוטוקול בי explants מוטבע במטריצה ​​תלת ממדים (למשל matrigel), יחד עם ביטוי של תאים סלולריים חלבון מסומן ניאון יכול להיות מועסק הכרחי כדי לטפל בבעיה זו. גם אם שינויים אלה בוצעו, ניסויים נוספים כדי לקשר בין התנהגויות שנראו בassay זה vivo לשעבר עם אלה in vivo יהיו צורך בכך. מגבלות אחרות כוללות מספר הגדול של עוברים הנדרשים כדי לייצר כמות מספקת כדי להפיק נתונים סטטי משמעותיים. והכי חשוב, הנתיחה היא פשוטה יחסית, זה דורש תרגול כדי לשלוט.

סגירת צינור עצבית באזור הגולגולת מתרחשת בין 8.5 עובריים היום (E8.5) ו -9.5 בעבר העכבר. כישלון לסגור כראוי הצינור העצבי בתוצאות הראש בanencephaly, מום מלידה מבנית נפוץ בבני אדם ואינו מתיישב עם חיים. הכוחות המניעים את סגירת צינור עצבית cephalic נוצרים משתי רקמות העצביות עצמו וסביבתו והאפידרמיס mesenchyme 3. בהרחבה מסוימת של mesenchyme הגולגולת נחשב לחיוני לגובה של 1,2 הקפלים העצבי קרניאלי. Mesenchyme גולגולתי הוא עשיר בחלבוני ECM בחלבונים מסוימים, כגון glycosylated proteoglycans ההפרין סולפט, כונדרואיטין סולפטים ו4-8 hyaluronate. שלא כמו בעובר העוף שבו תאי רכס עצביים להגר מצינור העצבי הגבה לאחר סגירת צינור עצבית, הרכס העצבי בעובר העכבר נודד באותו הזמן שהקפלים העצביים מתחילים rISE (אחרי שלב 5 somite). כך במהלך neurulation בעבר העכבר, mesenchyme הגולגולת מורכב מתאים שמקורם ברכס העצבי ומזודרם הפרקסיאלית. רכס עצבי ואוכלוסיות מזודרם הפרקסיאלית מושרים בזמנים שונים בהתפתחות; מקומי בתפקידים שונים בעובר להתפתח במבנים שונים 9,10. מזודרם הפרקסיאלית מקורו התכונה הראשונית ונודד לאזור הקדמי של העובר שבבסיס כל הצלחת העצבית המשוערת. הרכס העצבי מושרה בצומת של הצלחת העצבית ואקטודרם אפידרמיס, עובר לאפיתל mesenchyme מעבר וdelaminates רק לקראת גובה קיפול עצבי בעובר המכרסם. תאי רכס עצביים נודדים לאורך שבילים סטריאוטיפיים במזודרם הפרקסיאלית subectodermal לקשת branchial, frontonasal וmesenchyme periocular. מזודרם הפרקסיאלית יתרום לחלק מעצמותיו של קמרון הגולגולת ושרירים של פן, ואילו הדואר עצבי פסגה תתרום לעצמות אחרות של הגולגולת והפנים, בנוסף לעצבי גולגולת 9-11. מזודרם הפרקסיאלית ושושלות רכס עצביות יכולים להיות מסומן באופן דיפרנציאלי, על ידי Mesp1-cre וקווי עכבר מהונדס Wnt1-cre, בהתאמה 9. התפקיד החיוני של mesenchyme הגולגולת בסגירת צינור עצבית כבר הסיק מניסויים שבו טיפול בעוברים עם מכרסמי ECM שיבוש סוכנים כגון hyaluronidase, chondroitinase ABC, heparitinase או Diazo-אוקסו-norleucine (דון) במהלך סגירת neurulation הלקויה העצבית צינור 7, 12-14. בניסויים אלה, ניתוח היסטולוגית של קטעים סטטיים בעקבות neurulation חשף dysmorphogeneis קשורים של mesenchyme גולגולתי 7,12-14. עם זאת, מאחר שסוכן טרטוגנים היה גישה לרקמות מרובות, עדיין לא נקבע אם mesenchyme הגולגולת הוא באמת רקמת המטרה. בתמיכה למסקנה שרקמה זוחיוני לneurulation, mesenchyme גולגולתי מופיע חריג על ניתוחים היסטולוגיים בכמה עכברים עם מוטציות exencephaly 15-17. ובכל זאת, ברוב המקרים, ההשפעה של המוטציה על ההתנהגות התאית של mesenchyme גולגולתי לא טופלה. אנחנו פתחנו assay explant vivo לשעבר ישירות לבחון את התוצאה של מוטציה גנטית או מניפולציה תרופתית על התנהגותם של תאי mesenchyme גולגולת 15. בדיקה זו דומה לזו שפורסמה על ידי צחור et al 2003 לגשת פוטנציאל ההתמיינות של mesenchyme הגולגולת שנמצאה בבסיס את rhombomeres 18 מלבד ששונינו נתיחת explant כדי ללמוד את מאפייני הנדידה של אוכלוסיות קדמיות יותר של mesenchyme גולגולתי שבבסיס העצבי קדמי צלחת. השיטה שלנו היא גם שינוי של מבחני explant מבוצע בעובר העוף כדי לנתח את התנהגות הנדידה של הרכס העצבי עם keהבדלי y. הכנות קודמות explanted רכס העצבי או מזודרם הפרקסיאלית האחורי יותר 19,20. כמו כן, במהלך גובה קיפול עצבי בעובר העוף, הפסגה העצבית עדיין לא הגרה מצינור העצבי הגבה ובכך explants נלקח ממזודרם הפרקסיאלית הקדמי לא מכיל תאי רכס עצביים. בבדיקה שלנו, explants mesenchyme גולגולת מורכבת ממזודרם הפרקסיאלית, רכס עצבי ואקטודרם משטח מוכן ומצופה על מצע. מניפולציה ניסויית כולל בידוד של מוטציות גנטיות explants מ, ציפוי explants על ECM השונה או טיפולים תרופתיים יכולה להתבצע. תאים נודדים מexplant והמרחק, מספר וההתנהגות יכולים להיות מנותחים והשוואה בין קבוצות טיפול. בנוסף, הכנה זו היא amendable לניתוחים של נדידה סלולרית על ידי שיטות הדמיה בשידור חייה. לאחר ניסוי ההגירה, explants יכול להיות קבוע ונתונים לניתוחי immunohistochemical לפרווהTher להבהיר את ההשפעה של טיפולים. באופן כללי, הפרוטוקול שהוצג כאן הוא assay vivo לשעבר פשוט כדי לחקור את ההתנהגות של mesenchyme גולגולתי. כניסוי מייצג, אנו מנצלים assay זה לבחון את ההגירה של mesenchyme גולגולת על מצעים תאיים שונים.

an explant assay for assessing cellular behavior of the cranial mesenchyme

מערכת העצבים המרכזית נובעת מהצלחת העצבית שעוברת סדרה של תנועות המוךפו&quot;גנטי המורכבות וכתוצאה מכך ההיווצרות של הצינור העצבי בתהליך המכונה neurulation. במהלך neurulation, המורפוגנזה של mesenchyme שעומד בבסיס הצלחת העצבית האמינה לנהוג גובה קיפול עצבי. Mesenchyme הגולגולת מורכב ממזודרם הפרקסיאלית ותאי רכס עצביים. התאים של צורת גולגולת mesenchyme meshwork pourous המורכב מתאי stellate ומתערב בצורת גדילים תאיים מטריקס (ECM) התומכים הקפלים העצביים. במהלך neurulation, mesenchyme הגולגולת עובר שחלופים סטריאוטיפיים וכתוצאה מההתרחבות שלה ותנועות אלה הם האמינו כדי לספק כוח מניע לגובה קיפול עצבי. עם זאת, בשבילים ובהתנהגויות המניעות סלולריות המורפוגנזה mesenchyme גולגולתי נותרים למדו בצורה גרועה. אינטראקציות בין ECM והתאים של thes בבסיס גולגולת mesenchymeהתנהגויות תא דואר. כאן אנו מתארים assay פשוט vivo לשעבר explant המציא כדי לאפיין את התנהגותם של תאים אלה. בדיקה זו היא amendable למניפולציות תרופתיות לנתח ניתוחי הדמיה חיות האותות המעורבים ולאפיין את התנהגותם של תאים אלה עוד יותר. אנו מציגים ניסוי נציג מדגים את התועלת של בדיקה זו באפיון מאפייני הנדידה של mesenchyme גולגולתי במגוון של רכיבי ECM.

המראה של תאים הנודדים מexplants mesenchyme גולגולת מוצג באיור 2. בדקנו הגירה על מצעי ECM שונים שנמצאים בmesenchyme הגולגולת במהלך neurulation כוללים פיברונקטין (100 מ&quot;ג / מ&quot;ל; סיגמא # F1141), laminin (100 מ&quot;ג / מ&quot;ל; סיגמא # L2020), MaxGel ECM (1:500 דילול בDMEM ; סיגמא # E0282) וחומצה היאלורונית (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל; סיגמא, # 53747). תאים מצליחין להעביר מexplant כאשר אין ECM הוא הווה (נתונים לא מוצגים) ואת כל המצעים נבדקו הגירה נתמכת של התאים. גם צורתה, כמו גם את הגודל של תאים שנודדים מexplants תלויה במצע. זה צפוי כמו מחקרים קודמים מראים כי הכוחות המכאניים שנוצרו על ידי אינטראקציה של תאים עם ECM השונה להשפיע היא על הצורה ומאפייני נדידה של תאים 21. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig1.jpg" fo:content-width = &quot;5.5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4245/4245fig1highres.jpg&quot; /&gt; איור 1. הכנת explants. () להכין explants, E8.5 עוברים הם גזורים מdeciduas ורקמות extraembryonic. (ב) ראשי Embryo הם גזורים מקדמיים לגוף rhombomeres. Explants מוכן על ידי הסרת רקמה מקו האמצע והשולים החיצוניים של הראש להסיר את צלחת prechordal בקו האמצע והרכס העצבי premigratory ואקטודרם פני שטח בגבול, בהתאמה. (ג) explants מוכן על ידי גזירה מרקמות מקצות קו האמצע וחיצוניים של הראש להסיר את צלחת prechordal בקו האמצע ופסגת premigratory העצבית ואקטודרם משטח בגבולות. (ד) explants ממוקם בנפח קטן של מדיה במנות / coverslips מצופות ECM ואפשר לצרף לפני התוספת של מדיה נוספת. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig2.jpg" /> איור 2. Explants ההגירה של תאי mesenchyme גולגולת מexplants מצופה על מצעים שונים. היה מצופה על פיברונקטין, laminin, MaxGel ECM או חומצה היאלורונית וצלם אחרי 48 שעות בתרבות. בר גודל = 200 מ&quot;מ.

Watch this Scientific Journal Video about An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme at JoVE.com

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Mesenchyme הגולגולת עובר תנועות morphogenic דרמטיות שעשויים מספקת כוח מניע לגובה של הקפלים העצביים<sup&gt; 1,2</sup&gt;. כאן אנו מתארים פשוטים<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Explant assay לאפיין את ההתנהגויות הסלולר של mesenchyme הגולגולת במהלך neurulation. בדיקה זו יש יישומים רבים, בין היותך נוח למניפולציות תרופתיות וניתוחי הדמיה חיות.

Assay Explant להערכת התנהגות ניידת של mesenchyme הגולגולת

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

an-explant-assay-for-assessing-cellular-behavior-cranial

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Views.  Children's National Medical Center. Mesenchyme הגולגולת עובר תנועות morphogenic דרמטיות שעשויים מספקת כוח מניע לגובה של הקפלים העצביים 1,2. כאן אנו מתארים פשוטים Vivo לשעבר Explant assay לאפיין את ההתנהגויות הסלולר של mesenchyme הגולגולת במהלך neurulation. בדיקה זו יש יישומים רבים, בין היותך נוח למניפולציות ת?...

Video: An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during embryonic development that also commonly occurs in glioblastoma, the most frequent malignant brain tumor. EMT has also been observed in multiple carcinomas outside the brain including breast cancer, lung cancer, colon cancer, gastric cancer. EMT is centrally linked to malignancy by promoting migration, invasion and metastasis formation. The mechanisms of EMT induction are not fully understood. Here we describe an in vitro system for standardized isolation of cortical neural stem cells (NSCs) and subsequent EMT-induction. This system provides the flexibility to use either single cells or explant culture. In this system, rat or mouse embryonic forebrain NSCs are cultured in a defined medium, devoid of serum and enzymes. The NSCs expressed Olig2 and Sox10, two transcription factors observed in oligodendrocyte precursor cells (OPCs). Using this system, interactions between FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling involving Zeb1, Zeb2, and Twist2 were observed where TGF&#946;-activation significantly enhanced cell migration, suggesting a synergistic BMP-/TGF&#946;-interaction. The results point to a network of FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling to be involved in EMT induction and maintenance. This model system is relevant to investigate EMT in vitro. It is cost-efficient and shows high reproducibility. It also allows for the comparison of different compounds with respect to their migration responses (quantitative distance measurement), and high-throughput screening of compounds to inhibit or enhance EMT (qualitative measurement). The model is therefore well suited to test drug libraries for substances affecting EMT.

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.

Enzyme- ואת הסרום ללא דגם תרבית תאי גזע עצבי לחקירות EMT המתאימים גילוי תרופות

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during ...

Developmental Biology

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after undergoing an epithelial-mesenchymal transition 1,2. Following EMT, NCCs migrate large distances along stereotypic pathways until they reach their targets. NCCs differentiate into a vast array of cell types including neurons, glia, melanocytes, and chromaffin cells 1-3. The ability of NCCs to reach and recognize their proper target locations is foundational for the appropriate formation of all structures containing trunk NCC-derived components 3. Elucidating the mechanisms of guidance for trunk NCC migration has therefore been a matter of great significance. Numerous molecules have been demonstrated to guide NCC migration 4. For instance, trunk NCCs are known to be repelled by negative guidance cues such as Semaphorin, Ephrin, and Slit ligands 5-8. However, not until recently have any chemoattractants of trunk NCCs been identified 9. 
Conventional in vitro approaches to studying the chemotactic behavior of adherent cells work best with immortalized, homogenously distributed cells, but are more challenging to apply to certain primary stem cell cultures that initially lack a homogenous distribution and rapidly differentiate (such as NCCs). One approach to homogenize the distribution of trunk NCCs for chemotaxis studies is to isolate trunk NCCs from primary NT explant cultures, then lift and replate them to be almost 100% confluent. However, this plating approach requires substantial amounts of time and effort to explant enough cells, is harsh, and distributes trunk NCCs in a dissimilar manner to that found in in vivo conditions. 
Here, we report an in vitro approach that is able to evaluate chemotaxis and other migratory responses of trunk NCCs without requiring a homogenous cell distribution. This technique utilizes time-lapse imaging of primary, unperturbed trunk NCCs inside a modified Zigmond chamber (a standard Zigmond chamber is described elsewhere10). By exposing trunk NCCs at the periphery of the culture to a chemotactant gradient that is perpendicular to their predicted natural directionality, alterations in migratory polarity induced by the applied chemotactant gradient can be detected. This technique is inexpensive, requires the culturing of only two NT explants per replicate treatment, avoids harsh cell lifting (such as trypsinization), leaves trunk NCCs in a more similar distribution to in vivo conditions, cuts down the amount of time between explantation and experimentation (which likely reduces the risk of differentiation), and allows time-lapse evaluation of numerous migratory characteristics.

An approach to analyze the migration of explanted cells (trunk neural crest cells) is described. This method is inexpensive, gentle, and capable of distinguishing chemotaxis from both chemokinesis and other influences on migratory polarity such as those derived from cell-cell interactions within the primary trunk neural crest cell culture.

ניתוח של נדידת תאים עצביות קרסט טרונק באמצעות Assay השתנה Zigmond הקאמרי

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Neuroscience

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

חיתוך, תרבות וניתוח של הגולגולת הראשי ציצה עצביים תאים מעכבר לחקר של ציצה של תא העצבים העצבי והגירה

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals. Here, we describe an in vitro assay, "the reorientation assay", that has been used extensively to study the effect of extrinsic and intrinsic signals on the orientation of commissural axons2. This assay was developed by numerous people in the laboratories of Jane Dodd, Thomas Jessell and Andrew Lumsden (see acknowledgements for more details) and versions of this assay were used to demonstrate the reorientation activities of key axon guidance molecules, including the BMP chemorepellent in the roof plate3,4 and the chemoattractive activities of Netrin15 and Sonic Hedgehog (Shh)6 in the floor plate in the spinal cord.
Explants comprising 2-3 segments of the dorsal two-thirds of spinal cord are dissected from embryonic day (E) 11 rats and cultured in three dimensional collagen gels7. E11 dorsal spinal explants contain newly born commissural neurons, which can be identified by their axonal expression of the glycoprotein, Tag18. Over the course of 30-40 hours in culture, the commissural axon trajectory is recapitulated in these dorsal explants with a time course similar to that seen in vivo. This axonal trajectory can be challenged by placing either test tissues or a COS cell aggregate expressing a candidate signaling molecule in contact with one of the lateral edges of the dorsal explant. Commissural axons extending in the vicinity of the appended tissue will grow under the influence of both the endogenous roof plate and signals from the ectopic lateral tissue. The degree to which commissural axons are reoriented under these circumstances can be quantified. Using this assay, it is possible both to examine the sufficiency of a particular signal to reorient commissural axons3,4 as well the necessity for this signal to direct the commissural trajectory9.

This assay assesses the ability of a signaling molecule, here Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP7), to reorient commissural axons. An explant of embryonic dorsal spinal cord is cultured adjacent to an aggregate of COS cells secreting the candidate growth factors. Reoriented commissural axons growing within the explant are visualized by immunohistochemistry.

Assaying את היכולת של מולקולות איתות Diffusible כדי כיוון מחדש עובריים האקסונים Commissural השדרה

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes

Development of the palate is a dynamic process, which involves vertical growth of bilateral palatal shelves next to the tongue followed by elevation and fusion above the tongue. Defects in this process lead to cleft palate, a common birth defect. Recent studies have shown that palatal shelf elevation involves a remodeling process that transforms the orientation of the shelf from a vertical to a horizontal one. The role of the palatal shelf mesenchymal cells in this dynamic remodeling has been difficult to study. Time-lapse-imaging-based quantitative analysis has been recently used to show that primary mouse embryonic palatal mesenchymal (MEPM) cells can self-organize into a collective movement. Quantitative analyses could identify differences in mutant MEPM cells from a mouse model with palate elevation defects. This paper describes methods to isolate and culture MEPM cells from E13.5 embryos-specifically for time-lapse imaging-and to determine various cellular attributes of collective movement, including measures for stream formation, shape alignment, and persistence of direction. It posits that MEPM cells can serve as a proxy model for studying the role of palatal shelf mesenchyme during the dynamic process of elevation. These quantitative methods will allow investigators in the craniofacial field to assess and compare collective movement attributes in control and mutant cells, which will augment the understanding of mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation. Furthermore, MEPM cells provide a rare mesenchymal cell model for investigation of collective cell movement in general.

We present a protocol for isolation and culture of primary mouse embryonic palatal mesenchymal cells for time-lapse imaging of two-dimensional (2D) growth and wound-repair assays. We also provide the methodology for analysis of the time-lapse imaging data to determine cell-stream formation and directional motility.

בידוד והדמיה בזמן-לשגות של תאי מזנשים הפליאטל העוברי הראשי של העכבר כדי לנתח תכונות תנועה קולקטיבית

Development of the palate is a dynamic process, which involves vertical growth of bilateral palatal shelves next to the tongue followed by elevation and ...

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like the craniofacial skeleton and the peripheral nervous system. While it is critical to understand NCC migration in the context of a 3D embryo, isolating migratory cells in 2D culture facilitates visualization and functional characterization, complementing embryonic studies. The present protocol demonstrates a method for isolating chick cranial neural folds to generate primary NCC cultures. Migratory NCCs emerge from neural fold explants plated onto a fibronectin-coated substrate. This results in dispersed, adherent NCC populations that can be assessed by staining and quantitative morphological analyses. This simplified culture approach is highly adaptable and can be combined with other techniques. For example, NCC emigration and migratory behaviors can be evaluated by time-lapse imaging or functionally queried by including inhibitors or experimental manipulations of gene expression (e.g., DNA, morpholino, or CRISPR electroporation). Because of its versatility, this method provides a powerful system for investigating cranial NCC development.

This versatile protocol describes the isolation of premigratory neural crest cells (NCCs) through the excision of cranial neural folds from chick embryos. Upon plating and incubation, migratory NCCs emerge from neural fold explants, allowing for assessment of cell morphology and migration in a simplified 2D environment.

הכנה וניתוח מורפולוגי של תרביות תאי צמרת עצביים גולגולתיים של אפרוחים

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

In Vitro Investigation of the Effects of the Hyaluronan-Rich Extracellular Matrix on Neural Crest Cell Migration

Neural crest cells (NCCs) are highly migratory cells that originate from the dorsal region of the neural tube. The emigration of NCCs from the neural tube is an essential process for NCC production and their subsequent migration toward target sites. The migratory route of NCCs, including the surrounding neural tube tissues, involves hyaluronan (HA)-rich extracellular matrix. To model NCC migration into these HA-rich surrounding tissues from the neural tube, a mixed substrate migration assay consisting of HA (average molecular weight: 1,200-1,400 kDa) and collagen type I (Col1) was established in this study. This migration assay demonstrates that NCC cell line, O9-1, cells are highly migratory on the mixed substrate and that the HA coating is degraded at the site of focal adhesions in the course of migration. This in vitro model can be useful for further exploration of the mechanistic basis involved in NCC migration. This protocol is also applicable for evaluating different substrates as scaffolds to study NCC migration.

In Vitro Investigation of the Effects of the Hyaluronan-Rich Extracellular Matrix on Neural Crest Cell Migration

This protocol outlines an in vitro migration experiment suitable for the functional analysis of the molecules involved in the in vivo migration of neural crest cells into the hyaluronan-rich extracellular matrix.

במבחנה חקר ההשפעות של מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן על נדידת תאי קרסט עצביים

Neural crest cells (NCCs) are highly migratory cells that originate from the dorsal region of the neural tube. The emigration of NCCs from the neural tube ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

הערכת נכסים איתות של Ectodermal epithelia במהלך פיתוח Craniofacial

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Electroporation של Mesenchyme Craniofacial

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Cranial Neural Crest Cells Three-Dimensional In Vitro Differentiation Protocol for Multiplexed Assay

With their remarkable capacity to generate both ectodermal and mesenchymal derivatives, cranial neural crest cells (CNCC) have attracted a lot of interest in studying the mechanisms regulating cell fate decisions and plasticity. Originating in the dorsal neuroepithelium, this cell population is transient and relatively rare in the developing embryo - making functional tests, genomic screens, and biochemistry assays challenging to perform in vivo. To overcome these limitations, several methods have been developed to model CNCC development in vitro. Neurosphere (NS) based culturing methods provide a complex microenvironment that recapitulates the developing anterior neuroepithelium in 3D. These systems allow the growth of many NS in the same plate to generate a large amount of CNCC, but the produced NS present a high variability in shape, size, and number of CNCC formed - making quantitative assays difficult to perform. This protocol outlines a reproducible method for generating NS from mouse embryonic stem cells (mESC) in a 96-well format. NS generated in 96-well plates produce cranial neural crest cells (CNCC), which can be further cultured. By controlling the number of starting cells, this approach reduces variability in the size and shape between NS and increases reproducibility across experiments. Finally, this culture system is adaptable to several applications and offers a higher degree of flexibility, making it highly customizable and suitable for multiplexing experimental conditions.

We present a three-dimensional (3D) in vitro differentiation protocol generating neurospheres of reproducible size to produce cranial neural crest cells from mouse embryonic stem cells. We show that this methodology reduces variability compared to previous protocols and how it can be used for multiplexed assay to study cranial neural crest cell development.

תאי פסגה עצבית גולגולתית פרוטוקול התמיינות תלת מימדי במבחנה לבדיקה מרובבת

With their remarkable capacity to generate both ectodermal and mesenchymal derivatives, cranial neural crest cells (CNCC) have attracted a lot of interest ...