CIBC מלגה (JA) וNSERC מענק (RZ). אנו מודים למר הרוש Comeau (Brainsight) על עזרתו בעניין מצלמת אינפרא האדום, הגששים התואמים MR ותמיכת חומרה אחרת. אנו מודים גם לבריאן היינס (Hybex חידושים בע&quot;מ) שעצב את הזרוע רבת מפרקים לבעל סליל וספק כמה מהדמויות המוצגות בסרט הווידאו. ותודה מיוחדת לכל טכנאי MR ומ פריירה ממרכז מקונל מוח ההדמיה של מונטריאול נוירולוגיות המכון שעזר לנו לייעל את העיצוב של הניסוי.

הפרוטוקול מחולק בפגישה בת ימים (לא בהכרח ברציפות). היום הראשון מורכב מאתר fMRI המורכב עם אנטומי ותפקודיות בסריקות MR להגדיר לכל משתתף את האזורים כדי להיות ממוקדים עם TMS. היום השני מורכב בישיבות fMRI מראש ופוסט TMS בי TMS מוחל בתוך הסורק באמצעות MR סליל מיוחד תואם TMS (Magstim בע&quot;מ, ווילס, אנגליה) ומערכת stereotactic frameless (Brainsight). האחרונים משמשים לעמדה בסליל TMS בזמן אמת על אזורים יחסית לנתונים אנטומיים ותפקודיים של כל משתתף בקליפת מוח. 1. מושב Localizer <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם רכישת תמונה אנטומית ברזולוציה גבוהה של המשתתף שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז, לרכוש תמונות תפקודיות באמצעות שיפוע הד EPI דופק והפרדיגמה דגימה דלילה על מנת למזער את השפעת BOLD או מיסוך שמיעה עקב רעש סריקת MRI 14,15. במקרה שלנו, fMRI מתבצע דuring משימת מלודיה שבו משתתפים צריכים לקבוע אם שתי מנגינות רצופות 5-לב הן זהים או שונים 2,16. משימת שליטה שמיעתית אי אפליה כלולה גם, שבו נבדקים לשמוע שני דפוסים שווים באורך של חמישה שטרות, כולם באותו הגובה של C5 ומונחים לחצו על הכפתור השמאלי בעקבות הגירוי השני. תקופות של שתיקה גם מוכנסות באופן אקראי בין ניסויי משימה בכל ריצה. בסך הכל, 72 ניסויים מוצגים בסדר אקראי: 24 ניסויים של אפלית מנגינה, 24 ניסויי בקרה שמיעתית ו24 תקופות של שתיקה, למשך תקופה כוללת של 12 דקות 16 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את האתר באמצעות הגירוי אנטומית ו / או אתרים פונקציונליים. האדם צריך להיות מודע לכך שTMS מוגבל לגבי העומק של אתר הגירוי בגלל ההנחתה של עוצמת השדה החשמלית בעומק, ולא יכול לצפות להגיע לאזורים עמוקים יותר מ 3 סנטימטר 6,17. שלב חשוב הוא להשתמש בציוני דרך דומים לכל אחד מחלקיםicipant, שעלולה להיות קשה בגלל ההבדלים באנטומיה ותפקוד בין משתתפים. כאן, אנו ממקדים gyrus של Heschl בכל משתתף, הממוקם בשני אתרים אנטומיים ותפקודיים. אנו משתמשים במסכות של gyrus של Heschl מסופק על ידי אטלסי הרווארד-Oxford המבניים <a href="http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/data/atlas-descriptions.html" target="_blank">(http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/data/atlas-descriptions.html)</a> ויעד TMS מוגדרות בנפרד על ידי השיא הפעלה בתוך הפיתול של Heschl 2. בנוסף, אנחנו גם להגדיר את מיקום הקודקוד, אשר ישמשו כאתר שליטה לשלוט על השפעות הלא ספציפיות של TMS כגון חפצים אקוסטיים וחושיים. הקודקוד מוגדר אנטומית כנקודת אמצע בין הזיז וגשר האף, ומרחק שווה מחריצי intertragal ימין ועל שמאל. סדר האתר של גירוי (gyrus או הקודקוד של כלומר Heschl) הוא מתאזן על פנייחידים. </li></ul> 2. ניסוי fMRI טרום ופוסט TMS מפגש fMRI טרום TMS <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המשתתף כדי לעבור ישירות בסורק. זה כולל הסרה של מתכת ומילוי TMS וצורת הקרנת MR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם רכישת MR אנטומי ותפקודיות בסריקות (זהה לזו שבוצעה במושב מהאתר, ראה סעיף 1). </li></ul> stereotaxy וTMS ללא מסגרת בסביבת ה-MRI מערכת stereotaxy frameless מורכבת ממצלמת אינפרא אדום (פולאריס ספקטרה), כמה כלים וגששים (Brainsight) המשמשים להליך הרישום ומחשב. המחשב נמצא מחוץ לחדר הסורק, אבל הוא מוצב בכניסה לחדר הסורק ודלת הסורק נשמרה נפתחה במהלך יישום TMS. הכלים והגששים הם MR תואמים, כמו גם חצובה (תוצרת בית-) תמיכה במצלמת אינפרא האדום והם הerefore משמש בתוך החדר של הסורק. מצלמת אינפרא האדום היא לא MR-תואמת, ולכן ממוקמת בתוך חדר הסורק, ליד דלת הסורק בכשני מטרים ממשטח הסורק (ראה דיון על נהלי בטיחות). מערכת ממריץ TMS נמצאת בחדר סמוך לחדר הסורק MRI. אנו משתמשים בסליל TMS תואם MRI נמצא בתוך החדר והסורק מחובר למערכת TMS באמצעות כבל 7-מ &#39;דרך צינור מסנן RF. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון תמונות אנטומיות ותפקודיות של המשתתף שלך ויעדי הגירוי לחבילת תוכנת stereotactic (למשל Brainsight). הנה, אנחנו נהיה מיקוד gyrus של Heschl הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר רכישת fMRI מראש TMS, להסיר את החלק העליון MR ראש הסליל של סליל הראש 32-הערוץ (אם משתמש בסורק 3T סימנס ותצורת סליל ראש הערוץ 32). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להחליק את המשתתף על מיטת הסורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן סרט הראש ולהגדיר גשש על participהראש של הנמלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הזרוע רבת מפרקים למיטת הסורק ולתקן MR סליל TMS התואם על הזרוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי כל הגששים והסליל נמצאים בשדה ראייה של המצלמה. כאן, המצלמה זזה קצת לצד ימין של המשתתף כדי לאפשר מעקב קל יותר מהתקות הסליל בעת המיקוד לאונה הימנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את ראשו של הנושא שלך עם כלי stereotaxy (כלי מצביע כלומר). הדבר נעשה על ידי coregistering מספר ציוני דרך בראשו של המשתתף (למשל, במקרה שלנו את קצה האף, וnasion הצפיר לעוקץ החיצון של שתי האוזניים) באותם אתרים על הנתונים האנטומיים. בהליך זה, שני הנסיינים נדרשים, אחד קרוב לראשו של המשתתף למצב את כלי המצביע על ראשו של המשתתף, והניסוי האחר בכניסה של חדר הסורק כדי לבצע את הרישום במחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את סליל TMS התואם MR המשיק לtהוא קרקפת, ועוקב אחר הסליל מכוון למצלמת אינפרא האדום. הסליל הוא בכיוון עם הידית המסובבת פנתה לאחור ובמקביל ל2 קו האמצע. לתקן את מיקום הסליל באמצעות ברגים בזרוע רבה המפרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחדר הסמוך לסורק MRI, להפעיל את המערכת ולהתחיל גירוי TMS. TMS מיושם בעקבות דוגמת פרוטוקול, כלומר, גירוי פרץ תטא רציף (cTBS) מורכב ב3 פולסים ב50Hz, חזר בשנתי ה -40 ל5Hz. אנו משתמשים בעוצמת גירוי קבועה (41%) שהוגדרה על ידי פלט הממריץ 18,19. אנחנו בחרנו בפרוטוקול זה כפי שהוכח לווסת פלסטיות קליפת המוח למשך תקופה של עד 30 דקות לאחר הפסקת גירוי באוכלוסיות בריאות 20, (ראה סעיף דיון לנהלי בטיחות). </li></ul> מפגש fMRI לאחר TMS <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שגירוי הוא מוחלט, זה חשוב כדי לקבל בחזרה כפוף לסורק בהקדם האפשרי. הסר את Tסליל MS מחדר הסורק, והסר את הזרוע רבת המפרקים. הסט את ראשו של המשתתף לסליל ראש MR. ודא הסורק שלך הוא ערוך ומוכן ללכת. העצה שלנו היא לשמור על פלטפורמת הגוף העלתה במהלך פגישת TMS כולו, ולהפחית את המספר ומשך סריקות Localizer למינימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגלל ההשפעות של rTMS הן חולפות, חיבור הסריקה הסופית צריך להתחיל בסריקה הפונקציונלית. שוב, ערך fMRI במהלך ריצה 12-דקות של משימת המנגינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסריקה הסופית היא מוחלטת, לסיים עם סריקת אנטומי. </li></ul> 3. נציג תוצאות ניתוח של נתוני ה-fMRI שנערך בנפרד לשניהם פגישת fMRI לפני ואחרי-TMS. לכל מפגש fMRI (כלומר, לפניו ולאחריו TMS), את הניגוד בין המלודיות ומשימת השליטה השמיעתית מראה פעילות משימה הקשורה בשמאל וימין gyri של Heschl, gyri הזמני מעולה, חזיתית הנח gyri וprecentral gyri (איור 1 א, ב). כדי להעריך את ההבדלים בין הפעלות fMRI לפני ואחרי-TMS, אנו מבצעים ניתוח אפקט אקראי באמצעות סטודנטי מבחן t של זיווג. משמעות נקבעת באמצעות אשכולות שזוהו על ידי az&gt; 2 סף וסף אשכול תקן של p = 0.05. איור 1 C מייצג את-cTBS טרום הניגוד לאחר הניכוי למשתתף יחיד. הנתונים מראים כי cTBS המיקוד הנכון של Heschl gyrus (העיגול שחור) גורם לעלייה בתגובה בfMRI (משמאל) קליפת המוח השמיעתי הנגדית, כולל gyrus של שמאל Heschl. שינויים בתגובת fMRI נמצאים גם ברכס postcentral השמאל, השאירה אינסולה, ובקליפת המוח העורפית לרוחב בילטרלי. עם זאת, לא חל שינוי משמעותי בתגובת fMRI נתפס תחת הסליל. בנוסף, פרוטוקול משולב דומה TMS-fMRI חוזר על עצמו כדי לעורר (אתר שליטה) קודקוד. ההשוואה של פגישות לפני ואחרי-fMRI עם cTBS מיושם על הקודקוד לא הראתה שום significaהשפעת NT (מידע לא מוצג). <img src="/files/ftp_upload/3985/3985fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1. ניתוח של נתוני פרט מראש TMS fMRI (A), שלאחר TMS fMRI נתונים (B) ונתוני ה-fMRI מראש TMS לאחר הניכוי (C). תוצאות של א אפלית ניגוד מנגינת מינוס ניסויי בקרה שמיעתית למשתתף יחיד בפגישת fMRI מראש TMS () ובמושב fMRI לאחר TMS (B). משמאל לימין: ציריות, עטרה וsagittal תצוגות. בשניהם () ו (ב), סליל TMS הוא המיקוד הנכון של Heschl gyrus (העיגול שחור) ממוקם בx = 54, y = -13, z = 1 (MNI152 חלל סטנדרטי). לשני המפגשים fMRI לפני ואחרי-TMS, קואורדינטות מוצגות בx = -54, y = -13, z = 1 (MNI152 חלל סטנדרטי) כדי להראות שינויים באונה השמאלית באתר של גירוי (כלומר זכותו של gyrus Heschl ). תוצאות ג ניגוד הודעת מינוס פגישות מראש באמצעות TMS fMRI סטודנטי מבחן t של זיווג.

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנו מתארים פרוטוקול שילוב TMS לא מקוון וfMRI כדי לחקור את הארגון התפקודי של קליפת המוח השמיעתי. בסעיפים הבאים, אנחנו נדון גורמים מתודולוגיים לשקול בעת ביצוע גישה כזו. רכישה ועיתוי ל- TMS הודעת הפעלת fMRI <p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:r...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם חומר </td><td> סוג </td><td> חברה </td></tr><tr><td> גרייה מגנטית </td><td> Magstim סופר Rapid2 ממריץ, ראפיד-2 פלוס מודול אחד </td><td> Magstim בע&quot;מ, ווילס, אנגליה </td></tr><tr><td> קויל לגירוי מגנטי </td><td> MRI תואם 70 מ&quot;מ דמות של שמונה סליל </td><td> Magstim בע&quot;מ, ווילס, אנגליה </td></tr><tr><td> דימות בתהודה מגנטית </td><td> סורק טריו סימנס 3-T, קויל הראש 32-ערוץ </td><td> סימנס, Inc, גרמניה </td></tr><tr><td> Stereotaxy ללא מסגרת </td><td> Brainsight </td><td> Rogue מחקר בע&quot;מ, במונטריאול, קנדה </td></tr><tr><td> מערכת מדידה אופטית </td><td> פולאריס ספקטרה </td><td> צפון הדיגיטלי Inc, אונטריו, קנדה </td></tr><tr><td> זרוע רבת מפרקים לבעל סליל </td><td> תקן </td><td> Hybex innovatיוני Inc, אנז&#39;ו, קנדה </td></tr><tr><td> אוזניות תואמות-Insert MRI </td><td> Sensimetrics, הדגם S14 </td><td> Sensimetrics תאגיד, מסצ&#39;וסטס, ארה&quot;ב </td></tr></tbody></table>

mapping the after-effects of theta burst stimulation on the human auditory cortex with functional imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent progress, the functional properties and lateralization of the human auditory cortex are far from being fully understood. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a non-invasive technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses, and represents a unique method of exploring plasticity and connectivity. It has only recently begun to be applied to understand auditory cortical function 2. 
An important issue in using TMS is that the physiological consequences of the stimulation are difficult to establish. Although many TMS studies make the implicit assumption that the area targeted by the coil is the area affected, this need not be the case, particularly for complex cognitive functions which depend on interactions across many brain regions 3. One solution to this problem is to combine TMS with functional Magnetic resonance imaging (fMRI). The idea here is that fMRI will provide an index of changes in brain activity associated with TMS. Thus, fMRI would give an independent means of assessing which areas are affected by TMS and how they are modulated 4. In addition, fMRI allows the assessment of functional connectivity, which represents a measure of the temporal coupling between distant regions. It can thus be useful not only to measure the net activity modulation induced by TMS in given locations, but also the degree to which the network properties are affected by TMS, via any observed changes in functional connectivity.
Different approaches exist to combine TMS and functional imaging according to the temporal order of the methods. Functional MRI can be applied before, during, after, or both before and after TMS. Recently, some studies interleaved TMS and fMRI in order to provide online mapping of the functional changes induced by TMS 5-7. However, this online combination has many technical problems, including the static artifacts resulting from the presence of the TMS coil in the scanner room, or the effects of TMS pulses on the process of MR image formation. But more importantly, the loud acoustic noise induced by TMS (increased compared with standard use because of the resonance of the scanner bore) and the increased TMS coil vibrations (caused by the strong mechanical forces due to the static magnetic field of the MR scanner) constitute a crucial problem when studying auditory processing. 
This is one reason why fMRI was carried out before and after TMS in the present study. Similar approaches have been used to target the motor cortex 8,9, premotor cortex 10, primary somatosensory cortex 11,12 and language-related areas 13, but so far no combined TMS-fMRI study has investigated the auditory cortex. The purpose of this article is to provide details concerning the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools to investigate auditory processing. 
Previously we showed that repetitive TMS (rTMS) at high and low frequencies (resp. 10 Hz and 1 Hz) applied over the auditory cortex modulated response time (RT) in a melody discrimination task 2. We also showed that RT modulation was correlated with functional connectivity in the auditory network assessed using fMRI: the higher the functional connectivity between left and right auditory cortices during task performance, the higher the facilitatory effect (i.e. decreased RT) observed with rTMS. However those findings were mainly correlational, as fMRI was performed before rTMS. Here, fMRI was carried out before and immediately after TMS to provide direct measures of the functional organization of the auditory cortex, and more specifically of the plastic reorganization of the auditory neural network occurring after the neural intervention provided by TMS. 
Combined fMRI and TMS applied over the auditory cortex should enable a better understanding of brain mechanisms of auditory processing, providing physiological information about functional effects of TMS. This knowledge could be useful for many cognitive neuroscience applications, as well as for optimizing therapeutic applications of TMS, particularly in auditory-related disorders.

Watch this Scientific Journal Video about Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging at JoVE.com

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

עיבוד שמיעתי הוא בסיס לדיבור ועיבוד הקשורים למוסיקה. גרייה מגנטית (TMS) שמשה בהצלחה ללמוד מערכות קוגניטיביים, חושיות ומוטוריות, אך רק לעתים נדירות יושמה לאודישן. כאן אנו חקרנו TMS בשילוב עם סורק תהודה מגנטי תפקודי כדי להבין את הארגון התפקודי של קליפת המוח השמיעתי.

מיפוי לאחר הלוואי של תטא Burst גירוי בקורטקס השמיעתי האנושי בהדמיה תפקודית

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

mapping-after-effects-theta-burst-stimulation-on-human-auditory

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K Views.  McGill University. עיבוד שמיעתי הוא בסיס לדיבור ועיבוד הקשורים למוסיקה. גרייה מגנטית (TMS) שמשה בהצלחה ללמוד מערכות קוגניטיביים, חושיות ומוטוריות, אך רק לעתים נדירות יושמה לאודישן. כאן אנו חקרנו TMS בשילוב עם סורק תהודה מגנטי תפקודי כדי להבין את הארגון התפקודי של קליפת המוח השמיעתי.

Video: Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

תיוג hESCs ו hMSCs עם ברזל אוקסיד חלקיקים עבור פולשני של מעקב vivo עם MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Functional Imaging with Reinforcement, Eyetracking, and Physiological Monitoring

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcement.  However, the use of reinforcers such as juice and airpuffs can create challenges for fMRI.  Reinforcer delivery can cause head movement, which creates artifacts in the fMRI signal.  Reinforcement can also lead to changes in heart rate and respiration that are mediated by autonomic pathways.  Changes in heart rate and respiration can directly affect the fMRI (BOLD) signal in the brain and can be confounded with signal changes that are due to neural activity.  In this presentation, we demonstrate methods for administering reinforcers in a controlled manner, for stabilizing the head, and for measuring pulse and respiration.

This presentation demonstrates the use of fMRI to study neural circuits that underlie decision-making. Simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcements to investigate how outcomes affect decision processes.

הדמיה תפקודית עם חיזוק, Eyetracking, ניטור פיזיולוגית

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

אלקטרונים ספין תהודה מיקרו הדמיה המינים Live עבור מיפוי חמצן

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

הזרקה לתוך intraperitoneal דג הזברה למבוגרים

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

אלל ספציפי Gene Expression Assay כדי לבדוק את בסיס פונקציונלי של אגודות גנטי

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

הדמיה תפקודית של שומן חום בעכברים עם FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

שיטה להערכת ההשפעות של טווח של אורכי גל ועוצמות של אדום / טיפול באור האינפרה-אדום קרוב בסטרס חמצוני<em&gt; במבחנה</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

גאפ junctional אינטר תקשורת: ביומרקר פונקציונלית להערכת תופעות לוואי של toxicants ורעלים, ואת היתרונות הבריאותיים של מוצרים טבעיים

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...