עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקים AI62983 (AYK), AI22535 (GPB).

1. דגם Murine של פ GI aeruginosa להתיישבות והפצת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים C3H/HeN (6-8 wks הישן, נקבה, הרלן) מטופלים עם אנטיביוטיקה דרך הפה כדי לרוקן צומח commensal ולאחר מכן מונו יישבו עם הרשות הפלסטינית כפי שתואר לעיל 4. </li></ol> 2. מסיק Murine תוכן לומינל Cecal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול מרגמה לנקות נירוסטה לתוך אמבט חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים בחנק פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר פגר מאובטחת על לוח קלקר ומקלחת עם אתנול 95%. לעשות חתך אורכי קו האמצע דרך העור מעצם החזה ועד חיץ הנקבים. לשקף את העור הצפק לחשוף את חלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכרות cecum כולו. החזק את cecum עם מלקחיים מעל המכתש נירוסטה. Snip בשני הקצוות של cecum עם מספריים לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קצה פיפטה P1000 מלא מ&quot;ל 1 של חיץ flushate cecal (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA ו - 200 mM NaCl) 5 אל הקצה הפרוקסימלי של cecum. פלאש החיץ flushate cecal ותכנים luminal cecal אל תוך המדוכה נירוסטה. 1 מ&quot;ל של חיץ flushate cecal יהיה מספיק הסמקה כל תוכן cecal. Cecal תוכן flushate יהיה להקפיא מיד לבוא במגע עם מרגמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים את תוכן flushate cecal עם העלי סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרקע מקום קפוא תוכן luminal cecal לתוך צינור פוליפרופילן 50 מ&quot;ל חרוטי שקוע באמבט קרח / אתנול יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.2 עד 2.7 עבור כל עכבר נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב -80 ° C. </li></ol> 3. בידוד חיידקי RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח חם 1 (בהתבסס על נפח סופי של שני תוכן luminal cecal, כ 3 מ&quot;ל) של חומצת פנול / כלורופורם (05:01, v / v) הנכלל שפופרת 50 מ&quot;ל Oak Ridge צנטריפוגה עם כובע מאובטחת parafilm ב 65 ° C אמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים 0.5 נפח המאגר תמוגה (2% SDS, 16 mM EDTA ו - 200 mM NaCl) 6 הכלולים צינור פוליפרופילן 50 מ&quot;ל חרוטי במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ תמוגה רותחים לתכנים luminal cecal. Homogenize. מרתיחים במשך 5 דקות עם vortexing תקופתיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את 100 ° C תוכן cecal / מדגם תמוגה על חומצה 65 מעלות צלזיוס פנול / כלורופורם את הצינור צנטריפוגות רידג&#39;. חותם כובע עם parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם vortexing תקופתיים (כל 2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב g 2500 ב · 4 במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות העברת השלב מימית (הימנעות מכל של הממשק לבן) כדי צנטריפוגה רידג&#39; Oak טרי 50 מ&quot;ל. היקף השלב מימית תהיה כ -50% מהנפח הכולל של תוכן cecal, חיץ תמוגה, וחומצה פנול / כלורופורם. הוסף נפח שווה של חומצת פנול / כלורופורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם כובע עם parafilm ומערבבים היטב על ידי vortexing במהירות גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב g 2500 ב · 4 במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.7-3.9 עד אין ממשק לבן גלוי בין שלבי מימית ואורגנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות כדי להעביר את השלב מימית צנטריפוגה רידג&#39; Oak טרי 50 מ&quot;ל. הוסף נפח שווה של כלורופורם / isoamyl אלכוהול (24:1, v / v). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם כובע ומערבבים היטב על ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב g 2500 ב · 4 במשך 15 דקות. הסר השלב מימית (נפח יעמוד על כ 50% מנפח את התגובה בסה&quot;כ) כדי שפופרת 15 מ&quot;ל פוליפרופילן חרוטי ולהוסיף נפח שווה של isopropanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב -20 ° לפחות 2 שעות או למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב g 2500 · 4 ב 45 דקות. ג&#39;ל כמו גלולה יהוו בחלק התחתון של הצינור. הסר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הכדור עם 1 מ&quot;ל של אתנול קר כקרח 70%. וורטקס. צנטריפוגה מדגם ב ב ז ב 10,000 · 4 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו להפוך את הצינור כדי לאפשר יבש גלולה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה רנ&quot;א 200 μl מים RNase חינם. </li></ol> 4. DNase טיפול (Turbo-DNA חינם, Applied Biosystems) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של חיץ 10X DNase טורבו 2 μl טורבו DNase ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על ° 37 במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של מגיב DNase resuspended איון ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר, ערבוב מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g 10,000 בטמפרטורת החדר למשך 1.5 דקות ולהעביר את supernatant לצינור microfuge חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כרך אחד של חומצה (4 מעלות) קר פנול / כלורופורם ומערבבים היטב על ידי vortexing דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g 12,500 בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב מימית לצינור חדשה ולהוסיף 1 נפח של כלורופורם / isoamyl אלכוהול (49:1 v / v), מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g 12,500 בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב מימית (כ 50% מנפח את התגובה סה&quot;כ) לצינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח של 0.1 נתרן אצטט 3M, ו-pH 5.52.5 כרכים של אתנול קר כקרח 100%. וורטקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב -20 ° לפחות 2 שעות או ב -80 ° במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g 12,000 במשך 30 דקות ב 4 מעלות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הכדור עם 1 מ&quot;ל של אתנול קר כקרח 70% על ידי centrifuging במשך 5 דקות ב g 10,000 ב · 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant יבשה ואוויר במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 100 μl מים RNase חינם. במאי צריך לשים באמבט מים 65 ° עד resuspend ו לפזר את גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק את היעילות של הטיפול DNase, בתגובה RT-PCR תקן הגברה של חלבון ריבוזומלי (או גן התייחסות אחרת) יכול להתבצע עבור דגימות מטופלים ולא מטופלים, תוך שימוש לא שולטת RT. </li></ol> 5. RNA שלב ניקוי (Qiagen, RNeasy Kit) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיינו בדפי 56-57 של Qiagen RNeasy מיני מדריך (4 th Edition, אפריל 2006). פעל כפי שצוין. </li></ol> 6. נציג תוצאות הסכום הכולל של RNA חיידקי התאושש באמצעות פרוטוקול זה הוא כ 2-3 מיקרוגרם משני cecums. RNA התאושש היא בכמות ובאיכות מספקת עבור qPCR הבאים, פרופיל שעתוק, ו-RNA ניסויים Seq. טוהר RNA נבחנת באופן שוטף על ידי מדידת יחס 260nm/280nm 7 המדגם, אך שיטה זו אינה מספקת מידע על תקינות RNA. Bioanalyzer Agilent היא פלטפורמה מיקרופלואידיקה מבוסס על כימות, אומדת ובקרת איכות של DNA, RNA, חלבונים בתאים וכן מנצל מטרי שלמות המכונה RNA מספר Integrity RNA (רין) 8. RNA חילוץ עם פרוטוקול זה מייצר 260/280 יחסי החל 1.7-2.0 וערכים רין ≥ 7.0. דוגמה לניתוח Agilent Bioanalyzer של RNA חיידקי התאושש על ידי פרוטוקול זה מוצג באיור 1. <img src="/files/ftp_upload/3293/3293fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. Agilent Bioanalyzer electropherogram וג&#39;ל כמו התמונה של מסך מדגם Pseudomonas aeruginosa RNA בודד התאושש תוכן cecal Murine. רין 8.0.

<ol>
	<li>Bodey, G. P., Bolivar, R., Fainstein, V., Jadeja, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+caused+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Infections caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> Rev Infect Dis. 5, 279-279 (1983).</li><li>Bertrand, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endemicity,+molecular+diversity+and+colonisation+routes+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+intensive+care+units.">Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units.</a> Intensive Care Med. 27, 1263-1268 (2001).</li><li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+in+vivo+transcription+profiling+for+identifying+Pseudomonas+aeruginosa+genes+needed+for+gastrointestinal+colonization+and+dissemination.">Utility of in vivo transcription profiling for identifying Pseudomonas aeruginosa genes needed for gastrointestinal colonization and dissemination.</a> PLoS One. 5, e15131-e15131 (2010).</li><li>Koh, A. Y., Priebe, G. P., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+murine+model+of+gastrointestinal+colonization+and+dissemination+in+neutropenia.">Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia.</a> Infect Immun. 73, 2262-2272 (2005).</li><li>Alexander, R. J., Raicht, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+total+RNA+from+human+stool+samples.">Purification of total RNA from human stool samples.</a> Dig Dis Sci. 43, 2652-2658 (1998).</li><li>Fitzsimons, N. A., Akkermans, A. D., de Vos, W. M., Vaughan, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+gene+expression+detected+in+human+faeces+by+reverse+transcription-PCR.">Bacterial gene expression detected in human faeces by reverse transcription-PCR.</a> J Microbiol Methods. 55, 133-140 (2003).</li><li>Manchester, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+UV+methods+for+measurement+of+protein+and+nucleic+acid+concentrations.">Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations.</a> Biotechniques. 20, 968-970 (1996).</li><li>Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7, 3-3 (2006).</li><li>Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+gut+microbiome+in+obese+and+lean+twins.">A core gut microbiome in obese and lean twins.</a> Nature. 457, 480-484 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שיטת מיצוי RNA המתואר כאן מאפשר התאוששות של כמויות מספיקות של באיכות גבוהה הכולל Pseudomonas aeruginosa RNA שנקטפו מן העיכול Murine. שיטה זו אינה מוגבלת פ aeruginosa ועלול להיות מיושם על חיידקים אחרים. ההתאוששות של אורגניזמים מספיק חיידקים מהמעי ישתנו באופן משמעותי מן אורגניזם לאורגניזם. במודל Murine שלנו, פ aeruginosa בדרך כלל colonizes מערכת העיכול Murine ברמות בין 5 x אוקטובר 07-05 x 10 8 CFU / g צואה 4. מאז התאושש תוכן cecal הם בערך 0.5 גרם, מספר משוער של פ aeruginosa התאושש משני cecums הוא בין 5 x 07-05 אוקטובר CFU x 8 10. אם מיקרואורגניזמים אחרים נמצאים בשימוש, יהיה זה נבון כדי לוודא רמות קולוניזציה GI ואז לחשב את מספר cecums צריך לשחזר את מספר ממוקד של CFU. חשוב גם לציין כי בעת שימוש במודל זה Murine בפרט, עכברים שטופלו באנטיביוטיקה לא נגוע הרשות אין כמויות מדידים של RNA שבודד תוכן cecal שלהם. מודל Murine שלנו הקולוניזציה Pseudomonas aeruginosa העיכול ומנסה לחקות את הפצת בפתוגנזה של פ בקטרמיה ב סרטן בתאי גזע להשתלה בחולים aeruginosa. באוכלוסיית חולים זו, commensal צומח תיגמר לעתים קרובות משני לטיפול אנטיביוטי או כימותרפיות (למשל דלדול אנטיביוטי של GI commensal הצומח) וכתוצאה מכך צמיחת יתר של חיידקים פתוגניים (למשל מונו בשיתוף עם aeruginosa פ &#39;) ולאחר מכן הפצתו הבאים לאחר דיכוי המערכת החיסונית. היתרונות והמגבלות של מודל זה Murine כבר התייחס בעבר 4. מטרת המחקר הנוכחי היא לספק מתודולוגיה לבידוד מוחלט RNA של חיידקים מן במערכת העיכול. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מותאם Murine מודלים אחרים ללמוד היבטים אחרים של חיידקים בפתוגנזה של מערכת העיכול (כלומר commensal אינטראקציות הצומח, אפקטים על חיידקי מחלת מעי דלקתית, וכו &#39;). אחד היתרונות של שיטה זו היא שילוב של צעדים תמוגה מרובים כולל הקפאה / הפשרה, שיבוש מכני (כתישה עם homogenization, מרגמה / העלי), רותחים, תמוגה כימיים (למשל SDS). למרות ריבוי הצעדים תמוגה, כמה מיקרואורגניזמים (בעיקר חיידקים גראם חיוביים ופטריות / שמרים) עשויים לדרוש הפרעה מכנית נוספים. לאחר חם תמוגה / חומצת פנול, כלורופורם הדגירה (שלב 3.5), תוספת של חרוזים (0.1 מ&quot;מ עבור חיידקים ו / או 0.5-0.7 מ&quot;מ עבור שמרים), צעד הבאים חרוז פועם צריך להספיק כדי lyse האורגניזמים 9, 10. בהתחשב באופי המורכב של חומרים התאושש מן cecum Murine, חזר קר acid-phenol/chloroform עקירות (שלב 3.7-3.9) נדרשים לחלוטין על מנת להשיג איכות RNA מקובל והיושרה לתגובות במורד נוספת. בין 3-5 קר acid-phenol/chloroform עקירות ייתכן שתידרש לפני הלבן ממשק בין שלבי מימית ואורגנית מסולק. לבסוף, שילוב של הטיפול הן DNase (שלב 4) ו פרוטוקול ניקוי RNeasy (שלב 5) חיוניים הסרת DNA זיהום קטנים שאינם mRNA (5s וגם tRNA). כאמור, ה-RNA התאושש על ידי שימוש בפרוטוקול זה היא בכמות ובאיכות מספקת עבור פרופיל שעתוק הבאים 3, qPCR (לא פורסם), ו-RNA Seq (לא פורסם) ניסויים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> מכתש ועלי </td><td> דיג </td><td> 12-947-1 </td></tr><tr><td> Homogenizer </td><td> אומני </td><td> TM-125 </td></tr><tr><td> Oak Ridge צינורות צנטריפוגה (50 מ&quot;ל) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td></tr><tr><td> חומצה פנול / כלורופורם </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td></tr><tr><td> כלורופורם </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C2432 </td></tr><tr><td> Isoamyl אלכוהול </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> W205702 </td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 190764 </td></tr><tr><td> Diethyl pyrocarbonate (DEPC) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 40718 </td></tr><tr><td> DNase </td><td> Ambion </td><td> AM2238 </td></tr><tr><td> RNeasy Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> 3M נתרן אצטט </td><td> Ambion </td><td> AM9740 </td></tr><tr><td> 100% אתנול </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> E7023 </td></tr></tbody></table>

rna isolation of pseudomonas aeruginosa colonizing the murine gastrointestinal tract

Pseudomonas (רש&quot;פ) aeruginosa זיהומים לגרום תחלואה ותמותה משמעותי ב מארחים בעלי מערכת חיסונית חלשה, כגון חולים עם לוקמיה, פצעים חמורים לשרוף, או השתלות איברים 1. אצל חולים בעלי סיכון גבוה ב לפיתוח זיהומים הרשות הדם, מערכת העיכול (GI) הינו המאגר העיקרי של קולוניזציה 2, אבל המנגנונים שבאמצעותם מעברים הרשות מן חיידק colonizing אסימפטומטיים עד פולשנית, וקטלני לעיתים קרובות, הפתוגן אינם ברורים. בעבר, ביצענו ניסויים פרופיל vivo שעתוק על ידי הרשות מחלים mRNA מתאי חיידקים המתגוררים cecums של קולוניזציה עכברים 3 על מנת לזהות שינויים בביטוי גנים חיידקיים במהלך שינויים מצב החיסון של המארח. בדומה לכל ניסוי פרופיל שעתוק, הצעד שער הגבלת היא בבידוד של כמויות מספיקות של mRNA באיכות גבוהה. לאור שפע של אנזימים, פסולת, שאריות מזון, חומר חלקיקי במערכת העיכול, האתגר של בידוד RNA הוא מרתיע. כאן, אנו מציגים שיטה בידוד אמין לשחזור של RNA חיידקי התאושש העיכול Murine. שיטה זו מנצלת מודל ומבוססת Murine של קולוניזציה GI הרשות נויטרופניה-Induced הפצת 4. קולוניזציה GI פעם עם הרשות הפלסטינית הוא אישר, עכברים הם מורדמים תוכן ו cecal הם התאושש פלאש קפוא. RNA מופק אז באמצעות שילוב של הפרעה מכנית, רותחים, פנול / כלורופורם עקירות, טיפול DNase ו כרומטוגרפיה זיקה. כמות וטוהר יאושרו על ידי לספקטרופוטומטריה (טכנולוגיות Nanodrop) ו bioanalyzer (Agilent Technologies) (איור 1). שיטה זו של בידוד חיידקים במערכת העיכול RNA יכול בקלות להיות מותאם חיידקים ופטריות אחרות.

Watch this Scientific Journal Video about RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract at JoVE.com

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

שיטה אמינה הבידוד של RNA<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; התאושש cecums Murine מתואר. RNA התאושש היא בכמות ובאיכות מספקת עבור qPCR הבאים, פרופיל שעתוק, ו-RNA ניסויים Seq. טכניקה זו ניתן להתאים עבור בידוד RNA של חיידקים במעיים אחרים.

RNA בידוד Pseudomonas aeruginosa מיישבים את מערכת העיכול Murine

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

rna-isolation-pseudomonas-aeruginosa-colonizing-murine

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

19.1K Views.  University of Texas Southwestern Medical Center. שיטה אמינה הבידוד של RNA Pseudomonas aeruginosa התאושש cecums Murine מתואר. RNA התאושש היא בכמות ובאיכות מספקת עבור qPCR הבאים, פרופיל שעתוק, ו-RNA ניסויים Seq. טכניקה זו ניתן להתאים עבור בידוד RNA של חיידקים במעיים אחרים.

Video: RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

הפרדה אוטומטית של<em&gt; ג elegans</em&gt; יישבו variably ידי פתוגן חיידקים

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen which establishes chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis (CF). The overproduction of a capsular polysaccharide called alginate, also known as mucoidy, promotes the formation of mucoid biofilms which are more resistant than planktonic cells to antibiotic chemotherapy and host defenses. Additionally, the conversion from the nonmucoid to mucoid phenotype is a clinical marker for the onset of chronic infection in CF. Alginate overproduction by P. aeruginosa is an endergonic process which heavily taxes cellular energy. Therefore, alginate production is highly regulated in P. aeruginosa. To better understand alginate regulation, we describe a protocol using the mini-himar1 transposon mutagenesis for the identification of novel alginate regulators in a prototypic strain PAO1. The procedure consists of two basic steps. First, we transferred the mini-himar1 transposon (pFAC) from host E. coli SM10/&#955;pir into recipient P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugation to create a high-density insertion mutant library, which were selected on Pseudomonas isolation agar plates supplemented with gentamycin. Secondly, we screened and isolated the mucoid colonies to map the insertion site through inverse PCR using DNA primers pointing outward from the gentamycin cassette and DNA sequencing. Using this protocol, we have identified two novel alginate regulators, mucE (PA4033) and kinB (PA5484), in strain PAO1 with a wild-type mucA encoding the anti-sigma factor MucA for the master alginate regulator AlgU (AlgT, &#963;22). This high-throughput mutagenesis protocol can be modified for the identification of other virulence-related genes causing change in colony morphology.

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Here we describe a protocol using the mini-himar1 mariner transposon-mediated mutagenesis for generating a high-density insertion mutant library to screen, isolate and identify novel alginate regulators in the prototypic Pseudomonas aeruginosa strain PAO1.

זיהוי גנים הקשורים לרומן אלגינט ייצור ב<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; שימוש מיני<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagenesis תיווך transposon מרינר

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

לומד קהילות חיידקים<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; ו<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; באיירווייס

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

מודל Murine של הקבוצה B<em&gt; סטרפטוקוקוס</em&gt; נרתיקי Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

בידוד של אחת הקהילות חיידקי תאיים שנוצר ממודל מאתר של זיהום בדרכי השתן לניתוח תא בודד במורד הזרם

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

הדור של המסגרת של גן In-Frame מוטציות מחיקה ב פסאודומונס aeruginosa ובדיקת התקפה אלימה מודל עכבר פשוט של זיהום

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Isolation of Total RNA from Pseudomonas aeruginosa within Biofilms for Measuring Gene Expression

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in the airways of cystic fibrosis (CF) patients. P. aeruginosa is known for its ability to form biofilms that are protected by a matrix of exopolysaccharides. This matrix allows the microorganisms to be more resilient to external factors, including antibiotic treatment. One of the most common methods of biofilm growth for research is in microtiter plates or chambered slides. The advantage of these systems is that they allow for the testing of multiple growth conditions, but their disadvantage is that they produce limited amounts of biofilm for RNA extraction. The purpose of this article is to provide a detailed, step by step protocol on how to extract total RNA from small amounts of biofilm of sufficient quality and quantity for high throughput sequencing. This protocol allows for the study of gene expression within these biofilm systems.

Isolation of Total RNA from Pseudomonas aeruginosa within Biofilms for Measuring Gene Expression

This protocol presents a method to isolate RNA from Pseudomonas aeruginosa biofilms grown in chamber slides for high throughput sequencing.

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in the airways of cystic fibrosis (CF) patients. P. aeruginosa is ...

Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four women experience bacterial vaginosis, in which a low level of lactobacilli is accompanied by an overgrowth of diverse anaerobic bacteria. This condition has been associated with many health complications, including risks to reproductive and sexual health. While there is growing evidence showing the complex nature of microbial interactions in human vaginal health, the individual roles of these different anaerobic bacteria are not fully understood. This is complicated by the lack of adequate models to study anaerobically grown vaginal bacteria. Mouse models allow us to investigate the biology and virulence of these organisms in vivo. Other mouse models of vaginal bacterial inoculation have previously been described. Here, we describe methods for the inoculation of anaerobically grown bacteria and their viable recovery in conventionally raised C57Bl/6 mice. A new, less stressful procedural method for vaginal inoculation and washing is also described. Inoculation and viable recovery of Gardnerella are outlined in detail, and strategies for additional anaerobes such as Prevotella bivia and Fusobacterium nucleatum are discussed.

The protocol presents a mouse model of vaginal colonization with anaerobically cultured human vaginal bacteria. We focus on Gardnerella vaginalis,&#160;while including suggestions for Prevotella bivia and Fusobacterium nucleatum. This protocol can also be used as a guide for vaginal inoculations and viable recovery of other anaerobically grown bacteria.

מודלים של התיישבות נרתיקית מורין על ידי חיידקים שגודלו אנאירובית

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four ...

RNA בידוד Pseudomonas aeruginosa מיישבים את מערכת העיכול Murine

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס

כרוני לטווח ארוך

הפרדה אוטומטית של

זיהוי גנים הקשורים לרומן אלגינט ייצור ב

לומד קהילות חיידקים

מודל Murine של הקבוצה B

בידוד של אחת הקהילות חיידקי תאיים שנוצר ממודל מאתר של זיהום בדרכי השתן לניתוח תא בודד במורד הזרם

הדור של המסגרת של גן In-Frame מוטציות מחיקה ב פסאודומונס aeruginosa ובדיקת התקפה אלימה מודל עכבר פשוט של זיהום

Isolation of Total RNA from Pseudomonas aeruginosa within Biofilms for Measuring Gene Expression

מודלים של התיישבות נרתיקית מורין על ידי חיידקים שגודלו אנאירובית