אנו מודים Junko ואדה לקבלת סיוע טכני מעולה שלה. אנו מודים לפרופ &#39;אקיו Nomoto עבור באדיבות מתן וקטור ביטוי baculovirus עבור PVR-IgG2a. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקי-in-Aid לקידום פוליו חיסול ומחקר על מתעוררים מחדש המתעוררים מחלות זיהומיות של משרד העבודה הבריאות, והרווחה.

1. הכנת בינוני אחזקה (MM) וצמיחה בינוני (GM) להכנת MM ו-GM, ראה מדריך מעבדה פוליו של WHO 1. מדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת 2% עוברית עגל בסרום (FCS) ו -10% FCS יכול לשמש תחליפים של MM ו-GM, בהתאמה. 2. הכנת נוגדנים נגד PV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנטי PV מחדש נוגדנים (PV RIVM הקלדה antiserum) על ידי הוספת מים (0.5 מ&quot;ל בכל בקבוקון) כדי בקבוקון אחד של נוגדן אנטי PV (סוג 1, 2 או 3). הוסף פתרונות נוגדן מחדש (0.5 מ&quot;ל כל אחת) כדי מ&quot;ל של 4.5 מ&quot;מ צינורות שכותרתו נפרד. הערה: יש המון נוגדנים נגד PV ניתנים כצורה מחדש (0.5 מ&quot;ל בכל בקבוקון). במשך הרבה כאלה של נוגדנים נגד PV, תוספת של מים הכינון מחדש לא הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים נפח שווה של נוגדנים נגד PV מחדש. עבור אנטי PV1 2, 2 3, 1 או 3: מיקס 1.8 מ&quot;ל של כל נוגדן מחדש (1.8 מ&quot;ל + 1.8 מ&quot;ל = 3.6 מ&quot;ל של תערובת כל אחת). עבור אנטי PV1 2 3: מיקס 1.2 מ&quot;ל של כל נוגדן מחדש (1.2 מ&quot;ל + 1.2 מ&quot;ל + 1.2 מ&quot;ל = 3.6 מ&quot;ל). הערה: דגימות PV יכול להכיל תערובת של סרוטיפים שונים של PV. כדי לזהות סרוטיפ אחת של PV בדגימות בתערובת של PVS, בריכות נגד PV נוגדנים (כלומר 1 2, 2 3, 3 1, 1 +2 +3) הוא הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 1 / 5 נפח של FCS (0.72 מ&quot;ל) זה אנטי PV (1 2, 2 3, 3 +1, או 1 +2 +3) נוגדן (3.6 מ&quot;ל כל אחד) (FCS 18.2% הסופי). הערה: תוספת של FCS הוא הפחתה של התלכדות בלתי ספציפיים של החלקיקים ג&#39;לטין הנגרמת על ידי נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את בריכות נוגדן ב -20 ° C עד לשימוש assay הרשות. </li></ol> 3. הכינון של חלקיק ג&#39;לטין רגיש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 מ&quot;ל של חיץ הכינון מחדש כלול בערכה על בקבוקון אחד של חלקיק ג&#39;לטין רגיש (כאמור אבקת להקפיא מיובש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב על ידי לחיצה עדינה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את החלקיקים רגיש מחדש ב 4 ° C. החלקיקים ג&#39;לטין מחדש יכול להיות פעיל לפחות 2 שבועות שמר על 4 ° C, אבל צריך להיות מוכן לפני assay. </li></ol> הערה חשובה: אל תערבב הרבה שונים של חלקיקים ג&#39;לטין רגיש, כי התמונה התלכדות של חלקיקים שאינם רגישים ג&#39;לטין יכול להיות שונה על ידי הרבה של החלקיקים. עבור כל ניסוי, הרבה אחת של חלקיק ג&#39;לטין רגיש אמור לשמש. 4. הרשות assay עבור PV זיהוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צלחת מיקרו טיטרציה. לצורך זיהוי של דגימה אחת וירוס, אנחנו צריכים 5 + בארות אחד לפחות שליטה שלילי (חלקיק רגיש ללא וירוסים נוגדנים, גם # 6 ב להלן. ראה שום שליטה וירוס נוגדנים בדוגמה). סה&quot;כ מספר בארות הוא 5 + x דגימות לפחות שליטה assay. הערה חשובה: נא לקחת לפחות אחד לא לשלוט וירוס הנוגדן assay. בקבוקון אחד של החלקיקים הוא כ רגיש לזיהוי של 10 דגימות נגיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 12 μL / היטב אנטי PV נוגדן או GM לצלחת מיקרו טיטרציה. סידור הצלחת הוא כדלקמן (ראה גם דוגמה בהמשך). בדגימות ללא נוגדנים (טוב # 1 ו - 6), להוסיף 12 μL של GM במקום אנטי PV נוגדן. הערה חשובה: אם רבים דגימות PV צריך להיבדק אצל assay זה, פיפטה רב או מנפק יהיה מועיל עבור שלב זה. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ובכן # 1 </td><td> ובכן # 2 </td><td> ובכן # 3 </td><td> ובכן # 4 </td><td> ובכן # 5 </td><td> ובכן # 6 </td></tr><tr><td> ג&#39;נרל מוטורס </td><td> אנטי P1 2 3 </td><td> אנטי P1 2 </td><td> אנטי P2 3 </td><td> ani-P1 3 </td><td> ג&#39;נרל מוטורס </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 12 μL / היטב מדגם וירוס. במדגם אחד ללא וירוס (טוב # 6), להוסיף 12 μL של GM במקום פתרון וירוס. הערה: מדגם וירוס הוא supernatant התרבות של תאים נגועים, תאים L20B בדרך כלל או תאים RD. הערה חשובה: אם רבים דגימות PV צריך להיבדק אצל assay זה, פיפטה רב יהיה מועיל עבור שלב זה. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ובכן # 1 </td><td> ובכן # 2 </td><td> ובכן # 3 </td><td> ובכן # 4 </td><td> ובכן # 5 </td><td> ובכן # 6 </td></tr><tr><td> וירוס מדגם </td><td> וירוס מדגם </td><td> וירוס מדגם </td><td> וירוס מדגם </td><td> וירוס מדגם </td><td> ג&#39;נרל מוטורס </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח חלקיק מחדש פתרון רגיש מתוך 4 ° C לטמפרטורת החדר, לטפוח בעדינות לחלוטין להשעות את החלקיקים. הערה חשובה: לאחר השעיה מלאה של החלקיקים על ידי הקשה עדינים, חלקיקים יש להוסיף מיד את הצלחות לפני החלקיקים המרחפים precipitaטה והצורה הלא הומוגנית פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μL / טוב של חלקיק רגיש לכל הבארות. הערה חשובה: לאחר תוספת של חלקיקים רגישים, הצלחת לאלתר להיות כפופים להם לצלחת ערבוב להתחיל תגובה אחידה של הדגימות. לפיכך, תוספת של חלקיק רגיש צריך להתבצע באמצעות מתקן לצמצם פער הזמן בין דגימות הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת מיקרו טיטרציה על צלחת מיקסר מערבבים את הצלחת למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת מיקרו טיטרציה על נייר לבן (מטעמי נוחות של תצפית ויזואלית) על השולחן בטמפרטורת החדר (15 ~ 30 ° C) עבור 2 ח הערה חשובה: אל תזיז את הצלחת במהלך ואחרי התגובה להסתכלות התוצאות והתמונות לוקח. התלכדות שנוצר אינו יציב מופרעת בקלות על ידי הזזת צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות של הצלחת. הערה חשובה: נוף חלקי של התמונות לא יכול לתת מספיק נתונים לבדיקה ביקורת מאוחר יותר של תוצאות לפרשנות. כמה תמונות יש לנקוט כדי לכסות את כל הבארות של הצלחות התמקדות התמונה התלכדות של בארות. </li></ol> 5. פרשנות של התוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי בארות חיוביים ושליליים. השווה את התלכדות בדגימות עם זה של שליטה וירוס נוגדנים לא (משקעים של חלקיקים ג&#39;לטין, התלכדות לא) (איור 1 ו - 2). תמונות של התלכדות כי יש להבחין בבירור מן הנגיף לא ולא לשלוט נוגדן (לא התלכדות, שליטה שלילי) יש לשפוט חיובית, ותמונות של התלכדות דומים שליטה שלילי צריך להישפט כמו שלילית. דוגמאות שמראות התלכדות ברורה אך חלקית בלבד יכול להישפט חיובית, אבל שיא כמו &#39;חיובי (התלכדות חלקית) &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי של PV. לפרש את תוצאות המבוססות על בארות חיוביות ושליליות עם אנטי PV הנוגדנים לזהות קפסיד PV. עקרון הפרשנות של התוצאה היא דומה לזו של בדיקת נטרול במערכת תרבית תאים (לדוגמה חיובית עבור נוגדן אנטי-P1 2 עולה כי המדגם מכיל 3 סוג PV). </li></ol> 6. נציג תוצאות התוצאה נציג הרשות assay PV זיהוי מוצג באיור 1. כל זני PV נוצר התלכדות של חלקיקים רגישים ג&#39;לטין (אין נוגדנים דגימות). בנוכחות נוגדנים המתאימים אנטי PV, משקעים של חלקיקים ג&#39;לטין (התלכדות לא) דומה וירוס לא ולא לשלוט נוגדנים (שליטה שלילי) נצפתה (למשל, PV1 (סבין) בנוכחות אנטי P1 או 2 אנטי P3 1 נוגדנים). <img src="/files/ftp_upload/2824/2824fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. וירוס פתרונות זיהוי PV ידי assay הרשות. PV1 של (סבין), PV2 (סבין), ו PV3 (סבין) (titers וירוס של 1.2 x 10 8 CCID 50 / 12 μL, 8.2 x 10 7 CCID 50 / 12 μL, ו 3.5 x 10 7 CCID 50 / 12 μL, בהתאמה) שימשו לזיהוי על ידי assay הרשות. אין וירוסים אין שליטה נוגדנים הראתה משקעים של חלקיקים ג&#39;לטין (לא התלכדות, שליטה שלילי). <img src="/files/ftp_upload/2824/2824fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. פרשנות בארות חיוביים ושליליים. פתרונות וירוס של PV1 (סבין), PV2 (סבין), ו PV3 (סבין) (titers וירוס של 2.4 x 10 μL 8 50/25 CCID, 1.7 x 10 8 CCID 50 / 25 μL, ו 7.3 x 10 7 CCID 50 / 25 μL, בהתאמה) היו מדוללים 1 / 20 עד 1 / 320, ולאחר מכן 25 μL של דגימות בדילול נבחנו על ידי הרשות assay ללא אנטי PV נוגדנים.

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10. , (2004).</li><li>Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+particle+agglutination+method+with+soluble+virus+receptor+for+identification+of+poliovirus.">Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus.</a> J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).</li><li>Bibb, J. A., Witherell, G., Bernhardt, G., Wimmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+poliovirus+with+its+cell+surface+binding+site.">Interaction of poliovirus with its cell surface binding site.</a> Virology. 201, 107-115 (1994).</li><li>Koike, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poliovirus+receptor+protein+is+produced+both+as+membrane-bound+and+secreted+forms.">The poliovirus receptor protein is produced both as membrane-bound and secreted forms.</a> Embo J. 9. , 3217-3224 (1990).</li><li>Mendelsohn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+a+human+poliovirus+receptor+gene+into+mouse+cells.">Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83, 7845-7849 (1986).</li><li>Mendelsohn, C. L., Wimmer, E., Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+receptor+for+poliovirus:+molecular+cloning,+nucleotide+sequence,+and+expression+of+a+new+member+of+the+immunoglobulin+superfamily.">Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily.</a> Cell. 56, 855-865 (1989).</li><li>Arita, M., Koike, S., Aoki, J., Horie, H., Nomoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+poliovirus+with+its+purified+receptor+and+conformational+alteration+in+the+virion.">Interaction of poliovirus with its purified receptor and conformational alteration in the virion.</a> J. Virol. 72, 3578-3586 (1998).</li><li>McDermott, B. M., Rux, A. H., Eisenberg, R. J., Cohen, G. H., Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+binding+affinities+of+poliovirus+for+its+cellular+receptor.">Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 23089-23096 (2000).</li><li>Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+L+cells+expressing+the+human+poliovirus+receptor+for+the+specific+detection+of+polioviruses+in+vitro.">Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro.</a> J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).</li><li>Avoort, H. G. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+five+methods+for+intratypic+differentiation+of+polioviruses.">Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).</li><li>Kilpatrick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+group-,+serotype-,+and+vaccine+strain-specific+identification+of+poliovirus+isolates+by+real-time+reverse+transcription-PCR+using+degenerate+primers+and+probes+containing+deoxyinosine+residues.">Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).</li></ol>

Souji Masujima הוא עובד של מוצר חדש מחלקת עיצוב, Fujirebio בע&quot;מ

הנקודה הייחודית של assay זו הרשות היא ניצול של המולקולה PVR במקום אנטי PV נוגדנים לצורך זיהוי של PV 2. זה מאפשר אינטראקציה ספציפית של חלקיקי ג&#39;לטין רגיש עם PV עם זיקה אחיד לכל שלושת קפסיד של PV 3-6. השתמשנו צורה immunoadhesin של PVR (PVR-IgG2a) עבור סנסיטיזציה של חלקיקי ג&#39;לטין, כי צו?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> רגיש, ג&#39;לטין חלקיקים </td><td> Fujirebio בע&quot;מ </td><td></td><td> מבחן הערכה </td></tr><tr><td> הכינון חיץ </td><td> Fujirebio בע&quot;מ </td><td></td><td> מבחן הערכה </td></tr><tr><td> Microtitration צלחת </td><td> Fujirebio בע&quot;מ </td><td></td><td> מבחן הערכה </td></tr><tr><td> Anti-PV נוגדן </td><td> RIVM </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

particle agglutination method for poliovirus identification

ב גלובל פוליו חיסול היוזמה, אבחנה מעבדה משחק תפקיד קריטי ידי בידוד וזיהוי PV מן דגימות צואה של שיתוק רפה (AFP) במקרים אקוטיים. בארגון הבריאות העולמי (WHO) גלובל פוליו מעבדה רשת, PV בידוד וזיהוי כרגע מתבצע באמצעות תרבית תאים של המערכת בזמן אמת RT-PCR, בהתאמה. בעידן שלאחר מיגור של PV, הליכי זיהוי פשוטה ומהירה יהיה מועיל לאישור מהיר של מקרי פוליו במעבדות הלאומיות. במחקר הנוכחי, אנו נראה את ההליך של assay הרשות חדשנית שפותחה לצורך זיהוי PV. זה assay הרשות מנצל האינטראקציה של מולקולת PV (PVR) הקולטן virion כי הוא זיקה מסוימת ואחידה לכל קפסיד של PV. ההליך הוא פשוט (אחד הליך צעד צלחות תגובה) ומהירה (ניתן להשיג תוצאות בתוך שעות 2 של התגובה), והתוצאה היא נצפתה חזותית (תצפית של התלכדות של חלקיקי ג&#39;לטין).

Watch this Scientific Journal Video about Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification at JoVE.com

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

החלקיקים פיתחה לאחרונה רומן התלכדות (רש&quot;פ) assay ניצול קולטן מולקולה וירוס איפשר זיהוי מהיר וקל של poliovirus (PV). במאמר זה, אנו נראה את הליך assay הרשות לצורך זיהוי PV.

התלכדות חלקיקים שיטת זיהוי poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

particle-agglutination-method-for-poliovirus-identification

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.2K Views.  National Institute of Infectious Diseases. החלקיקים פיתחה לאחרונה רומן התלכדות (רש"פ) assay ניצול קולטן מולקולה וירוס איפשר זיהוי מהיר וקל של poliovirus (PV). במאמר זה, אנו נראה את הליך assay הרשות לצורך זיהוי PV.

Video: Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium. Because resistance to ampicillin and vancomycin in E. faecalis is still uncommon compared to resistance in E. faecium, the development of rapid tests allowing differentiation between enterococcal species is important for appropriate therapy and resistance surveillance. The E. faecalis OE PNA FISH assay (AdvanDx, Woburn, MA) uses species-specific peptide nucleic acid (PNA) probes in a fluorescence in situ hybridization format and offers a time to results of 1.5 hours and the potential of providing important information for species-specific treatment. Multicenter studies were performed to assess the performance of the 1.5 hour E. faecalis/OE PNA FISH procedure compared to the original 2.5 hour assay procedure and to standard bacteriology methods for the identification of enterococci directly from a positive blood culture bottle.

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A rapid protocol for the direct identification of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species from a positive blood culture using a Peptide Nucleic Acid fluorescent in situ hybridization assay (PNA FISH).

נוהל 1.5 שעה עבור זיהוי אנטרוקוקוס מינים ישירות מתרבויות דם

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1 Nef, not only retain their biological function, but can also competitively inhibit the function of the full-length protein. A set of 20 Nef scanning peptides, 20 amino acids in length with each overlapping 10 amino acids of its neighbor, were used to identify motifs in Nef responsible for its induction of apoptosis. Peptides containing these apoptotic motifs induced apoptosis at levels comparable to the full-length Nef protein. A second peptide, derived from the Secretion Modification Region (SMR) of Nef, retained the ability to interact with cellular proteins involved in Nef's secretion in exosomes (exNef). This SMRwt peptide was used as the "bait" protein in co-immunoprecipitation experiments to isolate cellular proteins that bind specifically to Nef's SMR motif. Protein transfection and antibody inhibition was used to physically disrupt the interaction between Nef and mortalin, one of the isolated SMR-binding proteins, and the effect was measured with a fluorescent-based exNef secretion assay. The SMRwt peptide's ability to outcompete full-length Nef for cellular proteins that bind the SMR motif, make it the first inhibitor of exNef secretion. Thus, by employing the techniques described here, which utilize the unique properties of specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, one may accelerate the identification of functional motifs in proteins and the development of peptide-based inhibitors of pathogenic functions.

Techniques to dissect the mechanisms underlying the secretion of HIV-1 Nef in exosomes are described. Specific short peptides derived from Nef and protein transfection were exploited to determine the structure, function, and binding partners of Nef&#x2019;s Secretion Modification Region. These procedures have general relevance in many mechanistic studies.

זיהוי של מוטיבים פונקציונליים והשותפים המחייבים מבוסס פפטיד

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

מבחני לזיהוי של antivirals הרומן נגד וירוס Bluetongue

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important for developing durable disease-resistant plants against wide range of pathogens. Virus-induced gene silencing (VIGS)-based forward genetics screening is a useful approach for identification of plant defense genes imparting nonhost resistance. Tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS vector is the most efficient VIGS vector to date and has been efficiently used to silence endogenous target genes in Nicotiana benthamiana.

	In this manuscript, we demonstrate a forward genetics screening approach for silencing of individual clones from a cDNA library in N. benthamiana and assessing the response of gene silenced plants for compromised nonhost resistance against nonhost pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea, and X. campestris pv. vesicatoria. These bacterial pathogens are engineered to express GFPuv protein and their green fluorescing colonies can be seen by naked eye under UV light in the nonhost pathogen inoculated plants if the silenced target gene is involved in imparting nonhost resistance. This facilitates reliable and faster identification of gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. Further, promising candidate gene information can be known by sequencing the plant gene insert in TRV vector. Here we demonstrate the high throughput capability of VIGS-mediated forward genetics to identify genes involved in nonhost resistance. Approximately, 100 cDNAs can be individually silenced in about two to three weeks and their relevance in nonhost resistance against several nonhost bacterial pathogens can be studied in a week thereafter. In this manuscript, we enumerate the detailed steps involved in this screening. VIGS-mediated forward genetics screening approach can be extended not only to identifying genes involved in nonhost resistance but also to studying genes imparting several biotic and abiotic stress tolerances in various plant species.

Virus-induced gene silencing is an useful tool for identifying genes involved in nonhost resistance of plants. We demonstrate the use of bacterial pathogens expressing GFPuv in identifying gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. This approach is easy, fast and facilitates large scale screening and similar protocol can be applied to studying various other plant-microbe interactions.

הקרנת גנטיקה קדימה VIGS בתיווך לזיהוי גני המעורבים בהתנגדות Nonhost


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these glycoprotein &#8216;spikes&#8217; is often technically challenging but important for understanding viral pathogenesis and in drug design. Here, a protocol is presented for viral spike structure determination through computational averaging of electron cryo-tomography data. Electron cryo-tomography is a technique in electron microscopy used to derive three-dimensional tomographic volume reconstructions, or tomograms, of pleomorphic biological specimens such as membrane viruses in a near-native, frozen-hydrated state. These tomograms reveal structures of interest in three dimensions, albeit at low resolution. Computational averaging of sub-volumes, or sub-tomograms, is necessary to obtain higher resolution detail of repeating structural motifs, such as viral glycoprotein spikes. A detailed computational approach for aligning and averaging sub-tomograms using the Jsubtomo software package is outlined. This approach enables visualization of the structure of viral glycoprotein spikes to a resolution in the range of 20-40 &#197; and study of the study of higher order spike-to-spike interactions on the virion membrane. Typical results are presented for Bunyamwera virus, an enveloped virus from the family Bunyaviridae. This family is a structurally diverse group of pathogens posing a threat to human and animal health.

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

ממוצע של ויראלי מעטפת גליקופרוטאין Spikes מאלקטרוני Cryotomography שחזור באמצעות Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination testing is a simple, rapid and inexpensive method for serotyping Streptococcus pneumoniae, and has also been widely applied in diagnostic microbiology. This manuscript describes the in-house production of latex agglutination reagents, quality control procedures and the application of this technique to pneumococcal serotyping.

קופסית Serotyping של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; על ידי לאטקס התלכדות

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

מבחני ויראלי המוקדם כניסה לזיהוי והערכה של אנטי תרכובות

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

מלח מרה-induced ביופילמים בתוך המעית פתוגנים: טכניקות וכימות

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...