אנו מודים לחברי במעבדה רוזנבלט לדיונים, הצעות מדעיים, והערות. אנחנו רוצים גם להודות מרי הלוראן אשר חביב סיפק את הקידוד פלסמיד-RFP UtrCH דוד גרינוולד שסיפק את CK: GFP מהונדס דג הזברה. תודה גם גרטשן המלך וצוות משאבים דג הזברה מרכזי באוניברסיטת יוטה תחזוקה טיפול מעולה של דג הזברה. עבודה זו נתמכה על ידי פרס ממציא ניו NIH-NIH NIGMS המנהל 1 DP2 OD002056-01 ל JR. GTE נתמכה על ידי NIH הדרכה רב תחומית סרטן תוכנית גרנט 5T32 CA03247-8.

זרימת עבודה בסיסיים להדמיה של אקטין Dynamics במהלך שחול תא האפידרמיס של דג הזברה פיתוח האפידרמיס של דג הזברה מתפתח מורכבת משתי שכבות נפרדות, שכבת פני השטח (או periderm) לבין שכבת הבסיס של התאים ליצור קשר עם קרום המרתף 2. התאים של שכבת פני השטח החיצוניים עוברים אפופטוזיס ו מסולקות מן הרקמה על ידי שחול 3 (איור 1). כדי להמחיש את התהליך הזה בזמן אמת, אנו מזריקים RNA קידוד חלבון פלואורסצנטי אדום התמזגו לתחום הומולוגיה calponin של utrophin, החלבון אקטין מחייב (RFP-UtrCH) 4,5, לאחד תאים דג הזברה הבמה מהונדס המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP ) תחת מרובדת epithelia האמרגן cytokeratin 8 6 (איור 2 א). למרות RFP-UtrCH מתבטא בכל מקום בגוף של בעלי חיים לאחר הזרקת RNA, אנו מתמקדים בתאי האפידרמיס שטחית המבטאים הן RFP ו-GFP לעקוב אקטין הדינמיקה במיוחד האפידרמיס (תרשים 2B). לאחר מכן, אנו לטיפול הזחלים עם G418 לגרום שחול תאים אפופטוטיים התמונה ואת האפידרמיס סיבי אקטין באמצעות מיקרוסקופ דיסק ספינינג confocal ולרכוש מערכי נתונים 4D. לפני התחלת הניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במבחנה לתמלל את RNA מתבנית DNA לינארית באמצעות mMachine mMessage SP6 Kit (Ambion) ולטהר את RNA כתרים באמצעות RNeasy Mini Kit (Qiagen). לדלל את RNA ל ~ 60ng/ul באמצעות מים סטריליים, להפוך 3-5μl aliquots ולאחסן ב -80 ° C עד מוכן להזרקה. הערה: הימנע להקפיא חוזרות / הפשרה על מנת למנוע הידרדרות של רנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תבנית להחזיק את העוברים במהלך ההזרקה ידי שפיכת 40mL agarose של 2% בטווח הבינוני העובר E3 (E3) לתוך צלחת 100 x 15mm תרבות ומיקום תבנית microinjection (Adaptive כלי המדע, # I-34) במגש הזה. לאחר agarose יש הקרושה, להסיר את התבנית כדי לחשוף את שקתות ב agarose. אחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך נימי מחטים להזרקה באמצעות זכוכית בורוסיליקט עם חוטים (OD 1.0mm, מזהה 0.78, אורך 10 ס&quot;מ) ו פולר P-97 סאטר פיפטה את ההגדרות הבאות (חום 485, משוך 50, מהירות 60, עיכוב / שעה 90, בלחץ 200 ). הערה: סוגים שונים של זכוכית ידרוש אופטימיזציה של התנאים המנויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאפרים 1% נמוכה ממיסים (LM) agarose ב-E3 ולאחסן 1mL aliquots על 42 ° C. היזהר כמו אידוי של E3 מן המניות יכולים להגדיל את ריכוז agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על דג הזברה מבוגר בתנאי מעבדה סטנדרטיים, עם קבוע אור / חושך מחזור של 14 שעות אור ו 10 שעות חושך 7. בלילה שלפני הניסוי להגדיר דגים להזדווג על ידי הנחת 3 נשים ו -2 גברים בטנק מופרדים על ידי מחיצה. למחרת בבוקר, להחליף את המים במיכל ולמשוך את המחיצה כאשר האורות נדלקים. </li></ol> 1. הזרקת RNA קידוד החלבון אקטין Tagged fluorescently הכבילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה RNA על הקרח. הוסף האדום פנול 0.5% ל RNA ביחס של 1:1 עבור ריכוז RNA הסופי של ~ 30ng/μl עומס פתרון 1μl לתוך מחט נימי רתומה גב מילוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ~ 75 1 8-cell בשלב CK: עוברים GFP ב-E3. Pipet pipet שנאספו עוברים לתבנית microinjection עם 5 ¾ פסטר בעדינות לכוון את העוברים בשוקת עם FST דומון # 5 מלקחיים. הערה: הקפד לעבוד מהר, כדי למנוע הזרקת לעובר רב תא הבמה, אשר עלולה לגרום ביטוי פסיפס של RNA מוזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת stereomicroscope מעבדה סטנדרטי לנתח, להזריק את הרנ&quot;א בחלמון של עוברי באמצעות לחץ שבשליטת microinjector (הרווארד Apparatus PLI-100 Pico-Injector). נקודה אדומה (אדום פנול) צריך להיות גלוי העובר לאחר ההזרקה. הזרק לפחות 50 עוברי עבור כל ניסוי. (ראה פרוטוקול יופיטר הקודם עבור פרוטוקול מפורט על הזרקת RNA לתוך עוברי דג הזברה 9). הערה: <ol type="A" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח של ~ 2nl אמור לשמש עבור הזרקה של רנ&quot;א לתוך אחד התאים עוברים שלב. כדי לקבוע את כמות הרנ&quot;א מוזרק, לוותר בולוס של רנ&quot;א לתוך טיפה של שמן מינרלי בשקופית מיקרומטר מכויל או תחת מיקרוסקופ עם בר סולם מובנית מהעיניות. טיפה של רנ&quot;א צריך להיות כדור מושלם. לחשב את הסכום מועברת באמצעות המשוואה: כרך (ב nl) = 4/3πr 3. התאמת עוצמת השמע מועבר על ידי שינוי בלחץ ההזרקה או זמן על המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול צריך גם לקחת להזרים את הסכום הנמוך ביותר של רנ&quot;א המאפשרת ויזואליזציה של fluorophore, כמו ריכוז גבוה של RNA יכול להיות רעיל העובר המתפתח. כדי לקבוע רמת ביטוי הולם, בניסוי במינון עקומת יש לבצע לפני הפעלת הניסוי. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין עוברים להסיר כל הביצים מופרית או פגום ומקום כל העוברים הנותרים ב 28.5 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, השתמש במיקרוסקופ לנתח ניאון כדי לבחור עוברי דג הזברה, כי יש רמה גבוהה של GFP (האפידרמיס) ו RFP (אקטין) פלואורסצנטי. מניחים את העוברים שנבחרו 28.5 ° C עד מוכן להמשיך עם הטיפול התרופה לגרום אפופטוזיס. </li></ol> 2. אינדוקציה של שחול תא הזחלים דג הזברה באמצעות G418 מצאנו כי החשיפה לאנטיביוטיקה aminoglycoside G418, או Geneticin, גורם לאפופטוזיס ו שחול של תאים אפידרמיס בפיתוח הזחלים דג הזברה 3 על ידי מנגנון בלתי ידוע. חשוב לציין כי טיפול זה עובד רק על זחלים, כי הם 4 ימים הפריה פוסט ומעלה. אנו מוצאים כי ~ 5-25 תאים ניתן למצוא extruding בכל זמן נתון מתוך סנפיר אפיתל של דג הזברה G418 הזחל טיפול. כאשר כמות תאים אפופטוטיים extruding יכול לנוע בין דגים דגים, אנו ממליצים הרכבה דגים מרובים עבור הדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף מקום 4 שלאחר יום הפריה (DPF) הזחלים דג הזברה בתערוכה הן GFP ו RFP הקרינה לתוך צלחת 35 x 10mm תרבות המכילה 3 מיליליטר (MLS) של E3. אפשר לטפל עד 25 זחלים בצלחת תרבות זו גודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להחליף את התקשורת עם 3mLs של 1mg/mL המכיל E3 של הזחלים G418 ו מדגירים את התרופה במשך 4 שעות ב 28.5 ° C. שים לב G418 אור רגיש, כל כך דואגים לשמור על תרבות צלחת מכוסה או בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר התקשורת ולהחליפו מראש חימם 28.5 ° C-E3 מדיה המכילה Tricaine 0.02% והמשך הרכבה הזחלים. </li></ol> 3. דג הזברה הזחלים הרכבה עבור הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 3 זחלים אל צינור 1.5 Eppendorf מ&quot;ל ולהסיר ביותר של E3 לאחר הכיור דגים לתחתית של התחתית. מצאנו כי עד 3 חיות יכול להיות מותקן כראוי לפני agarose מתמצק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קצה pipet לחתוך, 120ul pipet של 1% LM-agarose (42 ° C) לתוך הצינור, לערבב, ואז בעדינות pipet הזחלים תערובת agarose על coverglass בתחתית של צלחת תרבות MatTek. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות בעל פין FST בסיכה להוסיף או טונגסטן מחט מחוברת, במהירות לכוון את הזחלים ולכן הם ישר ושטוח נגד coverglass של המנה MatTek. הערה: אנו משתמשים בדרך כלל סיכה ישר לכוון הראשון הזחלים ואז סיכה בצורת האות כדי לוודא שהם שטוח נגד coverglass תוך מניעת נזק דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר agarose יש הקרושה, בעדינות למלא את המנה עם E3 המכיל 0.02% Tricaine. הערה: לחילופין, G418 ניתן להוסיף E3 בצלחת הדמיה להמשיך שחול זירוז, אם כי לטווח ארוך חשיפה 1mg/mL G418 יהרוג את הזחלים. </li></ol> 4. הדמיה חיה של אקטין דינמיקה הפרט התנהגויות תא אפיתל במהלך שחול נייד באמצעות מיקרוסקופ דיסק ספינינג Confocal מצאנו כי את כל התהליך של שחול תא אפופטוטיים מן האפידרמיס של דג הזברה מתפתח הזחלים לוקח כ 20 דקות 3. כאן אנו מדגימים כיצד הגדרת ניסוי זמן לשגות הדמיה לאסוף סדרה של מטוסים z דרך שכבה יחידה של האפידרמיס דג הזברה כדי להמחיש את התהליך שחול. מצאנו כי טיפוסי מיקרוסקופים widefield ניאון גורם משמעותי photobleaching של סיבי אקטין ואינם מאפשרים הדמיה timelapse. לכן, כדי למקסם את ההחלטה שלנו ולמנוע photobleaching, אנו משתמשים במיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב. להלן נתאר כיצד להגדיר את הניסוי באמצעות תוכנת IQ אנדור עם מיקרוסקופ ניקון, אם כי העקרונות שנדונו ניתן ליישם מיקרוסקופ דומה בחר קופצים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להפעיל את ארגון (עבור עירור של ה-GFP ב 488nm) ו HeNe (עבור עירור של RFP ב 561nm) לייזרים, מיקרוסקופ, מצלמה מנורה epifluorescent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך IQ אנדור תוכנה (גרסה 1.10.1), ליצור סדרה זמן פרוטוקול המכיל את אורכי הגל אתה רוצה תמונה, בתדירות של המרווחים בין לוכדת תמונה מספר פעמים ללכוד יש לחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות במקום צלחת MatTek המכיל הדגימה שלך על הבמה מיקרוסקופ ולהשתמש מטרה 20x עם האור המועבר להתמקד הזחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המים 40X טבילה אובייקטיבי (NA 0.8) לתוך המיקום הנכון. שימוש למטרה זו, אנו יכולים הסרט כ 20-25 תאים לכל שדה, אשר מאפשר לנו לעקוב אחר התנהגויות הסלולר במהלך שיחול בעוד גם לפתרון המשנה הסלולר דינמיקה אקטין. הערה: הרכבה זהה ואסטרטגיות הדמיה יכול להיות מיושם על מיקרוסקופים זקופה, אם כי טבילה במים 40X אובייקטיבי עם מרחק עבודה ארוך יש להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום טיפת מים על החלק העליון של היעד במהירות 40X במקום צלחת MatTek על העליונה. לאדואר: Zeiss פתרון Immersol טבילה יכול לשמש גם אם אידוי של המים היא בעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הדגימה באמצעות שלב או הארה DIC ולאחר מכן להשתמש epifluorescence 488nm להתמקד דווקא על האפידרמיס GFP חיובית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר למצב סריקה confocal. התאם את עוצמת הלייזר וזמן החשיפה לכל אחד הערוצים (488nm ו 561nm) בהתאם. תשמרי על עצמך כדי לאזן את כוח לייזר וזמן החשיפה לגילוי אופטימלי של האות שלך כדי למנוע כל photobleaching או רעילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות תאים extruding, להשתמש epifluorescence לדמיין GFP שכותרתו האפידרמיס לזהות קבוצה של תאים דפוס שושנת הקלאסי, המורכב מאוסף של תאים סביב תא עגול קטן באמצע. שימוש במצב סריקה confocal, שם צריך להיות גם הצטברות של אקטין המכרז שכותרתו נראה כמו טבעת סביב התא עגול קטן באמצע, סימן ההיכר של שחול התא. לאחר שזיהית תא extruding, להגדיר במהירות את המיקרוסקופ לרכוש 4D (XYZ-Time) מערכי נתונים confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את נקודות העליונים והתחתונים בתוך המטוס z לדמיין שכבה יחידה של האפידרמיס, כולל תא extruding, ובחר את גודל הצעד. במשך זמן לשגות הדמיה, לקבוע את המרווחים עבור לכידת תמונה ומספר חזרות. לדוגמה, אנו בדרך כלל לרכוש סדרה Z-5-פורש 10μm, עם גודל 1 מיקרומטר צעד, כל 1-2 דקות במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להציג את הנתונים, אנחנו בדרך כלל עושים את 3-D התחזיות של הסדרה z ולשמור את הנתונים להגדיר כקובץ סרט התואם מהיר זמן (Apple). באופן זה, אנו יכולים לדמיין התכווצות של טבעת אקטין והתנהגויות אפיתל המתרחשים סביב התא למות לאורך זמן. </li></ol> 5. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. סכמטי של תא שחול אפופטוטיים. סיבי אקטין מוצגים באדום, GFP אפידרמיס התאים החיוביים הם ירוקים. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. זרימת עבודה ניסויית. א סכמטי של זרימת העבודה עבור הניסוי. B. הביטוי של RFP-UtrCH באפידרמיס של CK 4dpf: GFP דג הזברה. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. עדיין במסגרות (z-תחזיות) מתוך הסרט זמן לשגות העוקב לחיות אקטין הדינמיקה במהלך תהליך של שחול תא אפיתל. חצים מציינים את טבעת של אקטין נוצר על ידי תאים שכנים אשר חוזים וסוגר במשך 2 דקות.

<ol>
	<li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).</li><li>Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P115+RhoGEF+and+microtubules+decide+the+direction+apoptotic+cells+extrude+from+an+epithelium.">P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium.</a> J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).</li><li>Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li><li>Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8.">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li></ol>

בעלי חיים הבטחת הרווחה כל ההליכים שבוצעו באמצעות פרוטוקול זה דג הזברה, Danio rerio, אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת יוטה (הבטחת לרווחת בעלי חיים # 10-07017).

פרוטוקול המתואר כאן מדגים שיטה פשוט וברור כדי להמחיש את התהליך של שחול ברקמות האפיתל לחיות. סוג זה של הניסוי מאפשר לנו לבחון את הדקויות של אקטין דינמיקה לא העריכו בעבר מנתח רקמות קבוע, ולכן, משלים שיטות immunofluorescent משותף. אנו יכולים להשתמש בפרוטוקול זה בשילוב עם מעכבי כ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> סוג </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> מגיב </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> mMessage mMachine SP6 Kit </td><td> מגיב </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td><td></td></tr><tr><td> מעבר טנקים </td><td> כלי </td><td> Thoren Aquatic מערכות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> משאבה Pipet </td><td> כלי </td><td> בל מוצרי אמנות </td><td> F3789 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ¾ Pipet פסטר </td><td> כלי </td><td> VWR </td><td> 14672-608 </td><td></td></tr><tr><td> Microinjection עובש </td><td> כלי </td><td> מסתגלת המדע כלים </td><td> אני-34 </td><td></td></tr><tr><td> תרבות 100x15mm פלייט </td><td> כלי </td><td> דיג </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Flamming / בראון Micropipet פולר </td><td> כלי </td><td> סאטר החברה Instrument </td><td> דגם P97 </td><td></td></tr><tr><td> בורוסיליקט זכוכית נימים עם נימה </td><td> כלי </td><td> סאטר החברה Instrument </td><td> B1400-78-10 </td><td> OD 1.0mm, מזהה 0.78mm, אורך 10 ס&quot;מ </td></tr><tr><td> אחסון אלקטרודה צנצנת </td><td> כלי </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> E210 </td><td></td></tr><tr><td> פנול אדום </td><td> מגיב </td><td> סיגמא </td><td> P0290 </td><td> 0.5% ב DPBS </td></tr><tr><td> לחץ שבשליטת Microinjector ו Micromanipulator </td><td> כלי </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> PLI-100 </td><td></td></tr><tr><td> תרבות 35x10mm דיש </td><td> כלי </td><td> Cellstar </td><td> 627-160 </td><td></td></tr><tr><td> G418 (Geneticin) </td><td> מגיב </td><td> GIBCO </td><td> 10131-035 </td><td> 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ב DH 2 0 </td></tr><tr><td> דומון # 5 מלקחיים </td><td> כלי </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11253-20 </td><td></td></tr><tr><td> 12cm מחזיק פין </td><td> כלי </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 26016-12 </td><td></td></tr><tr><td> הכנס סיכות </td><td> כלי </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 26007-02 ו-03 </td><td></td></tr><tr><td> תחתית זכוכית מהודרת עם תרבות coverglass 1.5 </td><td> כלי </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> נמוכה ממיסים agarose </td><td> מגיב </td><td> דיג </td><td> BP1360-100 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> מגיב </td><td> סיגמא </td><td> A-5040 </td><td></td></tr><tr><td> הביתור מיקרוסקופ </td><td> מיקרוסקופ </td><td> לייקה </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> הביתור מיקרוסקופ </td><td> מיקרוסקופ </td><td> ניקון </td><td> SMZ645 </td><tד&gt; </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלורסנט הביתור </td><td> מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> S2X12 </td><td></td></tr><tr><td> טווייה מיקרוסקופ דיסק Confocal </td><td> מיקרוסקופ </td><td> ניקון </td><td> Eclipse טי </td><td> לבוש עם ראש דיסק Yokagawa ספינינג </td></tr><tr><td> מצלמת CCD </td><td> מצלמה </td><td> אנדור </td><td> DV-885-VP </td><td> 1002x1004x8 מיקרון מרובע פיקסלים </td></tr></tbody></table>

live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish

תחזוקה homeostatic של רקמות אפיתל דורש את הסרת מתמדת של תאים פגומים מבלי לשבש תפקוד מחסום. המחקרים שלנו מצאו כי תאים מתים לשלוח אותות חיים לשכנים שלהם הטופס חוזה טבעת של אקטין שרירן כי זה פולט מתוך גיליון אפיתל ואילו לסגור פערים שאולי נבעה היציאה שלה, תהליך שמכונה שחול תא 1. בהירות אופטית של דג הזברה מתפתח מספק מערכת מצוינת להמחיש שחול לחיות epithelia. כאן אנו מתארים שיטה לגרום ו שחול התמונה האפידרמיס דג הזברה הזחל. כדי להמחיש שחול, אנו מזריקים בדיקה אדום חלבון פלואורסצנטי שכותרתו עבור אקטין-F לתוך אחד התאים הטרנסגניים בשלב עוברי דג הזברה לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק של האפידרמיס להשרות אפופטוזיס על ידי תוספת של G418 אל הזחלים. לאחר מכן, אנו משתמשים זמן לשגות הדמיה במיקרוסקופ על דיסק מסתובב confocal לצפות בדינמיקה אקטין והתנהגויות תא אפיתל בתהליך של תאים אפופטוטיים שחול. גישה זו מאפשרת לנו לחקור את התהליך שחול ב לחיות epithelia ותספק שדרה ללמוד מדינות מחלה הנגרמת על ידי הכישלון לחסל תאים אפופטוטיים.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish at JoVE.com

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

תאים מתים נמתחים מרקמות אפיתל על ידי התכווצות מתואמת של תאים שכנים מבלי לשבש תפקוד מחסום. בהירות אופטית של דג הזברה מתפתח מספק מערכת מצוינת להמחיש שחול לחיות epithelia. כאן אנו מתארים שיטות לגרום ו שחול התמונה האפידרמיס דג הזברה הזחל ברזולוציה הסלולר.

הדמיה חיה של שחול Cell מן האפידרמיס של דג הזברה פיתוח

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

live-imaging-cell-extrusion-from-epidermis-developing

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K Views.  University of Utah. תאים מתים נמתחים מרקמות אפיתל על ידי התכווצות מתואמת של תאים שכנים מבלי לשבש תפקוד מחסום. בהירות אופטית של דג הזברה מתפתח מספק מערכת מצוינת להמחיש שחול לחיות epithelia. כאן אנו מתארים שיטות לגרום ו שחול התמונה האפידרמיס דג הזברה הזחל ברזולוציה הסלולר.

Video: Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection של איברים מן דג הזברה למבוגרים

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...