Name: microdissection of black widow spider silk-producing glands
Uploaded: 2011-01-11T23:59:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי אפיון רוי NSF MCB-0950372 גרנט מולקולרית זכאי של משי עכביש האלמנה השחורה.

1. הרדמה העכביש ובידוד של הבטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת העכביש מתוך צנצנת זכוכית לתוך קופסת קרטון מצופה פלסטיק (איור 1 א). בדרך כלל אנו אוספים עכבישים מ גזעים, מוסכים או שיחים הבית אותם במעבדה בצנצנות זכוכית. בגלל העכביש לא יכול לטפס את יריעת הניילון, הוא מספק שיטה יעילה להעביר את העכביש מתוך צנצנת זכוכית או קפה יכולים לתוך בקבוקון קטן לצורכי הרדמה. בעוד הטיפול עכביש בשלב זה, אתה צריך ללבוש שני זוגות של כפפות גומי, או כפפות גינון למטרות בטיחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד עכביש הוא בתיבה מצופה פלסטיק, הגישה עכביש מהישבן שלה ולתת את השקופית עכביש לתוך הבקבוקון תרבות הפלסטיק. לאחר שהעכביש נכנס הבקבוקון, מיד במקום תקע מעל (איור 1B). אנו ממליצים להשתמש בקבוקון כי הוא כ 101.6 מ&quot;מ x 31.75 מ&quot;מ (אורך x D). זו מקטינה את כמות הגז פחמן דו חמצני הדרוש לשלב הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכביש על ידי החדרת גז דו תחמוצת הפחמן ב 5-10 פאונד לאינץ&#39; מרובע דקות 10 (תרשים 1C). זו כמות הגז רק לדפוק את העכביש החוצה סביב 5 דקות, אז לאחר הרדמה אתה חייב להמשיך מיד צעדים 1.4-1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את עכביש מרדים לתוך צלחת לנתיחה קטנים להשתמש במלקחיים כדי למקם את הצד הגבי עכביש מעלה (שעון חול אדום פונה כלפי מטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפ (גבעול צר המחבר את cephalothorax ואת הבטן) pedicel לשחרר את הבטן משאר העכביש (1D איור). חנות cephalothorax במקפיא לילה בצלחת פטרי וזורקים לאחר קפוא למחרת. היזהר בעת הזזת cephalothorax כמו ניבים של העכביש נמצאים על מגזר זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדקו את הבטן לחומר Sylgard בצלחת לנתיחה קטנים באמצעות סיכה חרק אחד. הכנס את הסיכה חרקים דרך החור עשוי לקצץ את pedicel (איור 1E). זה יכול בקלות להיות מזוהה כאתר שבו הנוזל הוא העולה מתוך גזיר של pedicel. ודא spinneret (סוף היפוכו של pedicel) מכוונת כלפי מטה (קרוב אליך). </li></ol> 2. הסרת שלד חיצוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את החתך הראשון באמצעות שלד באמצעות זוג microscissors, החל החור מגזיר pedicel. גזור רוחבית עד הצד הגבי הוא הגיע משני הצדדים (איור 1F). בעזרת זוג מלקחיים, לקלף קטע האחורי שלד הקדמי והכנס סיכה השני במיקום זה. בעקבות הכניסה של סיכה השנייה, להפוך את מגש לנתח caudally (90 ° זווית) של חתכים לרוחב הראשוני ולהמשיך חיתוך עד spinnerets הם הגיעו (איור 1G). חתך זה יהיה מאונך או אנכי לחתוך לרוחב הראשונית. אין לחתוך את spinnerets כאשר חתך אנכי מורכב (יחסית האחורי אל שעון החול ויש לה מראה עגולה). אי להכניס את הסיכה השני יהיה תוצאה בבטן ספינינג כאשר חתכים אנכיים מבוצעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבטן טבול לנתח פתרון חיץ (0.1 מ כלוריד נתרן, 0.015 ציטראט M נתרן, 0.1% Diethyl Pyrocarbonate). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל שלד הנותרים בחזרה החל החתך, הראשונית לרוחב. כאשר זו תושלם, רקמת שומן צריך להיות נראה בבירור (איור 1H). </li></ol> 3. בידוד של משי לייצור בלוטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים שימוש להתחיל מתגרה ממנו את שכבת השומן (איור 1H). השומן יהיה לבנבן למראה צהבהב. המשך עד שרוב השומן הוא להסיר את בלוטות משי גלויים לעין. בלוטת tubuliform מורכב משלושה זוגות, צינורות גליליים ארוכים מאוד, כי הם בשפע בחלל הבטן. Ampullate הגדולות, אשר נמצא בזוגות, הוא ampulla גדול, בצורת חצי סהר עם זנב ארוך דיסטלי מפותלים צינור הפרוקסימלי כי ירידה רוחב כפי גישות spinnerets של עכביש. Ampullate קטין דומה מאוד מורפולוגיה כדי ampullate העיקרי, אבל הוא קטן יותר באופן משמעותי. בלוטת flagelliform, גם המתרחשים בזוגות, הוא עגול multilobular עם גלילי קטן זיג זג צינור המשתרע לעבר spinnerets. בלוטת המצרפי (נמצא בזוגות) הוא גדול מאוד, בלוטת multilobular כי יש צינור ההפרשה גדול מאוד אשר גדול, אונות סדיר על זה. בלוטות aciniform להתרחש במספרים גדולים ומזכירים קצר, תחזיות אצבע קטנה. בלוטת pyriform היא בלוטה קטנה בבטן יש הרבה נדחס, צינורות גליליים המזכירים מאוורר עם הרבה צינורות הפרשה קטנה להאריך עד spinnerets. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו ממליצים על הסרת בלוטות לפי הסדר הבא: tubuliform, ampullate הגדולות, flagelliform, ampullate קטין, צבירה, aciniform, ואז pyriform (איור 2A-B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל tubuliform, להקניט את בלוטות אלה של שאר הבלוטות דואר - הם צריכים להיות יושב על גבי בלוטות אחרות (איור 2 א). ישנם שלושה זוגות של בלוטות tubuliform עכביש בודד. לאפשר להם לצוף חופשי אבל להישאר מחובר spinnerets שלהם על ידי צינורות שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להקניט משם בלוטות ampullate הגדולות. ישנן שתי בלוטות ampullate העיקריים נוכח עכביש אחד. במהלך הליך ההסרה, לוודא הצינורות נשארים מחוברים בלוטות (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להקניט את שאר הבלוטות אחד מהשני, עובדים בזהירות כדי למנוע ניקוב של כל הבלוטות, בעיקר המצרפי בלוטות flagelliform. בלוטת כל צריך להיות חופשי צף כל הדרך אל נקודת היציאה שלה שלד ועד spinnerets. בלוטות אלה מצויים גם בזוגות. הסר כל על ידי בלוטת צובט את צינור עם מלקחיים ובזהירות למשוך אותו עד שזה נשבר הרחק מנקודת היציאה. Ampullate הגדולות, flagelliform, ampullate קטין, ובלוטות המצרפי נמצאים בזוגות. בלוטות aciniform ו pyriform להתרחש זוגות רבים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כל על ידי בלוטת צובט את צינור עם מלקחיים ובזהירות למשוך אותו עד שזה נשבר הרחק מנקודת היציאה על ידי spinneret. אנחנו בדרך כלל לאחסן בלוטות הרטובה, עם זאת, אנחנו לא להוסיף למאגר נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו בלוטות יוסרו, למקם אותם לתוך סטרילי מראש שכותרתו 1.5 צינורות microcentrifuge מ&quot;ל. בלוטות הפרט מוצגים באיור 3A-G. זכור את בלוטות על הקרח ואז פלאש להקפיא אותם בחנקן נוזלי. בעקבות הקפאת פלאש בחנקן נוזלי, למקם אותם בבית -80 ° C לאחסון. </li></ol> 4. נציג תוצאות לאחר הסרת בלוטות שונות, זהירות קיצוניים צריך לקחת בזמן הטיפול flagelliform ובלוטות צבירה, כמו אלה שני מבנים ניתן ניקב בקלות פגום עם מלקחיים. יתר על כן, ראוי לציין כי מורפולוגית בלוטות flagelliform ו המצרפי נראים דומים מאוד לפני הסרת שלהם והם שזורים זה בזה לעתים קרובות אחד עם השני. כדי למנוע זיהום צולבות של רקמות אלו על ההסרה, מבתר צריך בזהירות להקניט את המבנים האלה בנפרד. בנוסף, על החשיפה הראשונית של משי לייצור בלוטות, הבלוטות aciniform ו pyriform יהיה הקשה ביותר מיד לדמיין בשל גודל קטן שלהם ואת המיקום האנטומי. לעתים קרובות יש נוכחות של ביצים רבות. יתר על כן, טיפול נוסף צריך להילקח בעת הסרת בלוטת pyriform, כמו רקמת זה דביק מאוד בדרך כלל לדבוק מלקחיים שלך. כאשר תהליך זה נעשה כראוי, ניתן להשיג את כל שבעת משי לייצור בלוטות מן עכביש בודד באופן מטוהרים. בדרך כלל, אפשר לשחזר את הכמויות מיקרוגרם של רנ&quot;א הכולל חלבון מן לנתיחה עכביש בודד. דוגמה באמצעות RNA סך qPCR לבחון את רמות ה-mRNA של גן מוגבלת fibroin tubuliform, TuSp1, מוצג (איור 4). ניסויים נציג שכוללות חלבון lysates שנאספו הבלוטות למשל, פתרון העיכול tryptic ואחריו MS ניתוח (יכול לשמש גם לניתוח MS / MS) או ניתוח הרכב חומצות אמינו מוצג (איור 5-6, בהתאמה). <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1a.jpg" alt="איור 1a" /><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1e.jpg" alt="איור 1e" /> באיור 1. טיפול, הרדמה, והסרה של שלד חיצוני מהבטן של עכביש אלמנה שחורה נקבה. א) העברת העכביש לתוך קופסת קרטון מצופה פלסטיק כדי להקל על העברת עכביש לתוך בקבוקון פלסטיק קטן. ב) Spider להציב לתוך בקבוקון פלסטיק עם תקע. ג) הרדמה העכביש עם גז דו תחמוצת הפחמן. ד) הפרדת cephalothorax מן הבטן באמצעות microscissors. E) Immobilization של הבטן במגש לנתח באמצעות סיכות חרקים. F) צפו לאחר חתך לרוחב הוא עשה עם מספריים חלק שלד הוא התגלגל חזרה עם מלקחיים. G) חתכים נעשים בניצב לחתוך לרוחב הראשונית. ג) הסרת שלד חיצוני וחשיפה של שכבת שומן. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. ויזואליזציה של שבע משי לייצור בלוטות שונות תוך פגע בבטנו של העכביש כמו גם הרקמות הסובבות. א) תמונות של tubuliform, ampullate הגדולות, flagelliform, במצטבר, רקמות ampullate קטין בהגדלה של 12X. ב) תמונה של בלוטות aciniform ו pyriform בהגדלה של 12X. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3a.jpg" alt="איור 3a" /><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3e.jpg" alt="איור 3E" /> איור 3. תצלומים של שבעת משי לייצור בלוטות לאחר הוצאתם מן הבטן. כל התמונות שנתפסו בהגדלה 20X למעט aciniform ו pyriform בלוטות, אשר נעשו ב 40X. א) גדולampullate בלוטת; B) ampullate ראשיות ומשניות (צד ימין) לשם השוואה גודל: C) tubuliform: D) flagelliform; E) במצטבר; F) aciniform: G) pyriform. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. הנציג תוצאות דפוס הביטוי של הגן משי, TuSp1, לאחר מדידות TuSp1 רמות ה-mRNA של משי לייצור בלוטות שונות (למעט בלוטת pyriform) באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) בידוד הבאים של רנ&quot;א הכולל בלוטות. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. דוגמה של ניתוח MS של תמציות חלבון המתקבל בלוטת pyriform הבאים עיכול, פתרון tryptic. הערה: x2 מייצג 2 פי הגדלה של עוצמת הספקטרום. ספקטרום מסות פפטיד יון שמתאימים אזורי fibroin PySp1 מוצגים עם סמל #. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig6.jpg" alt="איור 6" /> איור 6. תוצאה אופיינית של פרופיל הרכב חומצות האמינו של חלבונים המופקים בלוטת tubuliform. הערה: ASX = ASP ו ASN; GLX = Glu ו Gln. צבע כחול משקף חומצות אמינו עם קבוצות שרשרת קוטבי צד ואילו צבע אדום מייצג את שאריות חומצת אמינו עם אי - קוטבי קבוצות שרשרת בצד.

<ol>
	<li>Vollrath, F., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).</li><li>Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).</li><li>Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endeavour. 10, 31-31 (1986).</li><li>Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).</li><li>Lewis, R. V., Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).</li><li>Colgin, M. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).</li><li>Tian, M., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).</li><li>Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. 44 (30), 10020-10020 (2005).</li><li>Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).</li><li>Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).</li><li>Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

המתודולוגיה שלנו microdissection של משי לייצור בלוטות מן עכביש האלמנה השחורה מציעה אמצעי יעיל להשגת מטוהרים לייצור משי בלוטות. והניתוחים ניתן להשלים 1.5-3 שעות, מניב סט שלם של שבע נפרדות לייצור משי בלוטות מ cobweavers. קבלת מטוהרים משי בלוטת דגימות מאפשרת לחוקרים את היכולת לבצע מג?...

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0420-1</td><td>0.1 M in water</td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758 - 5 ml</td><td>0.1% v/v</td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804 - 1 kg</td><td>0.015 M in water</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica MZ16</td><td></td></tr><tr><td>Digital microscope camera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC320</td><td>Software - Leica Application Suite v2.8.1</td></tr><tr><td>Vannas scissors</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel forceps</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501764</td><td>Mini Dumont #M5S</td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Indigo Instruments</td><td>33414-2</td><td>Insect pins #2</td></tr><tr><td>Small or large dissection dishes</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DD-50-S or DD-90-S</td><td>52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; culture vials</td><td>Carolina Biological</td><td>FR-17-3076</td><td>Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm</td></tr></tbody></table>

microdissection of black widow spider silk-producing glands

עכבישים מודרנית ספין ביצועים גבוהים סיבי משי עם מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים, כולל ללכוד, טרף תנועה והגנה על פיתוח 1,2 צאצאים. עכבישים לבצע משימות אלה על ידי ספינינג כמה סוגי סיבים שונים שיש להם תכונות מכניות שונות. התמחות כזו של סוגי סיבים אירעה דרך באבולוציה של משי בלוטות ייצור שונות, אשר לתפקד biofactories קטן. אלה מייצרים biofactories ולאחסן כמויות גדולות של חלבונים משי לייצור סיבים. באמצעות סדרה מורכבת של אירועים ביוכימיים, חלבונים אלה משי מומרים מנוזל לחומר מוצק על שחול. מחקרים הוכיחו כי מכונות משי עכביש חזקים יותר מפלדה גבוהה מתיחה 3. ניתוח להבין את הקשר בין המבנה והתפקוד של הנושאים עכביש המשי חשפו כי קורי עכביש מורכב בעיקרו של חלבונים, או fibroins, כי יש לחסום חוזר בתוך רצפי חלבונים שלהם 4. חתימות מולקולרית נפוצים התורמים לחוזק מתיחה מדהימה הרחבה של משי עכביש נמצאים פרומים דרך ניתוח cDNAs משי המתורגם. בהינתן מאפייני החומר יוצא דופן של עכביש המשי, מעבדות מחקר ברחבי העולם מתחרים להבין לחקות את תהליך ספינינג לייצר סיבי משי סינתטי עבור יישומים מסחריים, צבאיים ותעשייתיים. אחד האתגרים העיקריים ספינינג קורי עכביש מלאכותיים במעבדה מחקר כרוך הבנה מלאה של התהליכים הביוכימיים המתרחשים במהלך שחול של סיבי המשי לייצור בלוטות. כאן אנו מציגים שיטה הבידוד של שבע משי לייצור שונים מן הבלוטות cobweaving עכביש האלמנה השחורה, הכוללת את בלוטות ampullate ראשיות ומשניות [מייצרת גרר ופיגומים משי] 5,6, tubuliform [במקרה מסנתז משי ביצה] 7 , 8, flagelliform [פונקציה ידוע קלח-אורגים], במצטבר [עושה משי דבק], aciniform [מסנתז גלישת טרף במקרה האשכולות ביצה] 9 ו pyriform [מייצרת משי מצורף דיסק] 10. גישה זו מבוססת על הרדמה העכביש עם גז דו תחמוצת הפחמן, ההפרדה הבאות של cephalothorax מן הבטן, והוא microdissection של הבטן כדי להשיג את משי לייצור בלוטות. בעקבות ההפרדה של משי לייצור בלוטות שונות, רקמות אלה ניתן להשתמש כדי לאחזר מקרומולקולות ביוכימיים שונים עבור ניתוחים שונים, כולל כמותי בזמן אמת PCR, הצפוני והמערבי סופג, ספקטרומטריית מסה (MS או MS / MS) מנתח לזהות חדש רצפי חלבון משי, לחפש חלבונים להשתתף במסלול הרכבה משי, או להשתמש רקמות שלמות על תרבית תאים או ניסויים היסטולוגית.

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands at JoVE.com

Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

כאן אנו מתארים אסטרטגיה יעילה להסיר את משי לייצור בלוטות מהבטן של הנקבה עכבישים אלמנה שחורה. הליך זה מאפשר בידוד מהיר של משי לייצור שבע ברורים בלוטות באופן מטוהרים, תהליך חשוב עבור החוקרים ללמוד ייצור והרכבה עכביש המשי סיבים.

Microdissection של האלמנה השחורה עכביש המשי לייצור בלוטות

Modern spiders spin high-performance silk fibers with a broad range of biological functions, including locomotion, prey capture and protection of ...

microdissection-of-black-widow-spider-silk-producing-glands

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

15.7K Views.  University of the Pacific. כאן אנו מתארים אסטרטגיה יעילה להסיר את משי לייצור בלוטות מהבטן של הנקבה עכבישים אלמנה שחורה. הליך זה מאפשר בידוד מהיר של משי לייצור שבע ברורים בלוטות באופן מטוהרים, תהליך חשוב עבור החוקרים ללמוד ייצור והרכבה עכביש המשי סיבים.

Video: Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation biomaterials with high performance properties. The development of these new structural materials must be rapid, cost-efficient and involve processing methodologies and products that are environmentally friendly and sustainable. Spiders spin a multitude of different fiber types with diverse mechanical properties, offering a rich source of next generation engineering materials for biomimicry that rival the best manmade and natural materials. Since the collection of large quantities of natural spider silk is impractical, synthetic silk production has the ability to provide scientists with access to an unlimited supply of threads. Therefore, if the spinning process can be streamlined and perfected, artificial spider fibers have the potential use for a broad range of applications ranging from body armor, surgical sutures, ropes and cables, tires, strings for musical instruments, and composites for aviation and aerospace technology. In order to advance the synthetic silk production process and to yield fibers that display low variance in their material properties from spin to spin, we developed a wet-spinning protocol that integrates expression of recombinant spider silk proteins in bacteria, purification and concentration of the proteins, followed by fiber extrusion and a mechanical post-spin treatment. This is the first visual representation that reveals a step-by-step process to spin and analyze artificial silk fibers on a laboratory scale. It also provides details to minimize the introduction of variability among fibers spun from the same spinning dope. Collectively, these methods will propel the process of artificial silk production, leading to higher quality fibers that surpass natural spider silks.

Despite the outstanding mechanical and biochemical properties of spider silks, this material cannot be harvested in large quantities by conventional means. Here we describe an efficient strategy to spin artificial spider silk fibers, which is an important process for investigators studying spider silk production and their use as next-generation biomaterials.

ייצור סינתטי קורי עכביש בקנה מידה מעבדה

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Bioengineering

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, and the majority of extant heteropterans retain this trophic strategy. Some heteropterans have transitioned to feeding on vertebrate blood (such as the kissing bugs, Triatominae; and bed bugs, Cimicidae) while others have reverted to feeding on plants (most Pentatomomorpha). However, with the exception of saliva used by kissing bugs to facilitate blood-feeding, little is known about heteropteran venoms compared to the venoms of spiders, scorpions and snakes.
One obstacle to the characterization of heteropteran venom toxins is the structure and function of the venom/labial glands, which are both morphologically complex and perform multiple biological roles (defense, prey capture, and extra-oral digestion). In this article, we describe three methods we have successfully used to collect heteropteran venoms. First, we present electrostimulation as a convenient way to collect venom that is often lethal when injected into prey animals, and which obviates contamination by glandular tissue. Second, we show that gentle harassment of animals is sufficient to produce venom extrusion from the proboscis and/or venom spitting in some groups of heteropterans. Third, we describe methods to harvest venom toxins by dissection of anaesthetized animals to obtain the venom glands. This method is complementary to other methods, as it may allow harvesting of toxins from taxa in which electrostimulation and harassment are ineffective. These protocols will enable researchers to harvest toxins from heteropteran insects for structure-function characterization and possible applications in medicine and agriculture.

Although many insects in the suborder Heteroptera (Insecta: Hemiptera) are venomous, their venom composition and the functions of their venom toxins are mostly unknown. This protocol describes methods to harvest heteropteran venoms for further characterization, using electrostimulation, harassment, and gland dissection.

קציר ארס מרעלים חרקים טורפים וחרקים אחרים Heteropteran

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Environment

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee (Apis mellifera) Workers

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired glands that are located in the head of the bee are highly sensitive to the quantity and quality of pollen and pollen substitutes that the nurse bee consumes. The glands get smaller when nurses are fed deficient diets and are large when they are fed complete diets. Because nurse hypopharyngeal gland size is a robust indicator of nurse nutrition, it is essential that those studying honey bee nutrition know how to measure these glands. Here, we provide detailed methods for dissecting, staining, imaging, and measuring nurse bee hypopharyngeal glands. We present comparisons of unstained and stained tissue and data that were used to study the impact of pollen on gland size. This method has been used to test how diet impacts hypopharyngeal gland size but has further use for understanding the role of these glands in hive health.

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee Apis mellifera Workers

Hypopharyngeal gland acinus size is a robust measure of nurse honey bee nutrition. Here, we provide a detailed protocol for dissecting, staining, imaging, and measuring nurse bee hypopharyngeal gland acini.

מדידת Hypopharyngeal בלוטת Acinus בגודל דבורת הדבש (בומבוס) עובדים

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired ...

Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons

The development of peripheral nerves is an intriguing process. Neurons send out axons to innervate specific targets, which in humans are often more than 100 cm away from the soma of the neuron. Neuronal survival during development depends on target-derived growth factors but also on the support of Schwann cells (SCs). To this end SC ensheath axons from the region of the neuronal soma (or the transition from central to peripheral nervous system) to the synapse or neuromuscular junction. Schwann cells are derivatives of the neural crest and migrate as precursors along emerging axons until the entire axon is covered with SCs. This shows the importance of SC migration for the development of the peripheral nervous system and underlines the necessity to investigate this process. In order to analyze SC development, a setup is needed which next to the SCs also includes their physiological substrate for migration, the axon. Due to intrauterine development in vivo time-lapse imaging, however, is not feasible in placental vertebrates like mouse (mus musculus). To circumvent this, we adapted the superior cervical ganglion (SCG) explant technique. Upon treatment with nerve growth factor (NGF) SCG explants extend axons, followed by SC precursors migrating along the axons from the ganglion to the periphery. The beauty of this system is that the SC are derived from a pool of endogenous SC and that they migrate along their own physiological axons which are growing at the same time. This system is especially intriguing, because the SC development along axons can be analyzed by time-lapse imaging, opening further possibilities to gain insights into SC migration.

Here we describe a Schwann cell (SC) migration assay in which SCs are able to develop along extending axons.

ניתוח התפתחות תאי שוואן Murine לאורך האקסונים של גידול

The  development of peripheral nerves is an intriguing process. Neurons send out  axons to innervate specific targets, which in humans are often more than ...

Neuroscience

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

הכנה של בלוטת הרוק Submandibular מאתר מיקרוסקופ Intravital זקופה

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Immunology and Infection

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. These structures are almost always localized on plant surfaces. Among them are nectaries or glandular trichomes. The secreted compounds are often employed in interactions with the biotic environment, for example as attractants for pollinators or deterrents against herbivores.
Glands that are unique in several aspects can be found in carnivorous plants. In so-called pitcher plants of the genus Nepenthes, bifunctional glands inside the pitfall-trap on the one hand secrete the digestive fluid, including all enzymes necessary for prey digestion, and on the other hand take-up the released nutrients. Thus, these glands represent an ideal, specialized tissue predestinated to study the underlying molecular, biochemical, and physiological mechanisms of protein secretion and nutrient uptake in plants. Moreover, generally the biosynthesis of secondary compounds produced by many plants equipped with glandular structures could be investigated directly in glands.
In order to work on such specialized structures, they need to be isolated efficiently, fast, metabolically active, and without contamination with other tissues. Therefore, a mechanical micropreparation technique was developed and applied for studies on Nepenthes digestion fluid. Here, a protocol is presented that was used to successfully prepare single bifunctional glands from Nepenthes traps, based on a mechanized microsampling platform. The glands could be isolated and directly used further for gene expression analysis by PCR techniques after preparation of RNA.

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Plants glands are specialized structures responsible for the biosynthesis and secretion of many compounds involved in interactions with the biotic environment. To enable studies on their molecular and biochemical features, a mechanical micropreparation technique was established in order to isolate single metabolically active glands, here from the carnivorous plant Nepenthes.

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional characterization of venom proteins has important biomedical applications, including the identification of drug leads or probes for cellular receptors. Spiders are the most species rich clade of venomous organisms, but the venoms of only a few species are well-understood, in part due to the difficulty associated with collecting minute quantities of venom from small animals. This paper presents a protocol for the collection of venom from spiders using electrical stimulation, demonstrating the procedure on the Western black widow (Latrodectus hesperus). The collected venom is useful for varied downstream analyses including direct protein identification via mass spectrometry, functional assays, and stimulation of venom gene expression for transcriptomic studies. This technique has the advantage over protocols that isolate venom from whole gland homogenates, which do not separate genuine venom components from cellular proteins that are not secreted as part of the venom. Representative results demonstrate the detection of known venom peptides from the collected sample using mass spectrometry. The venom collection procedure is followed by a protocol for dissecting spider venom glands, with results demonstrating that this leads to the characterization of venom-expressed proteins and peptides at the sequence level.

This article provides a protocol for the extraction of venom from spiders using electrical stimulation in order to 1) conduct proteomic characterization, 2) stimulate venom gland gene expression, and 3) perform functional studies of venoms. This is followed by a description of venom gland microdissections for gene expression studies.

הפקה של ארס וארס בלוטת Microdissections מהעכבישים לproteomic וניתוח transcriptomic

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע, כל עכבר לניתוח של בלוטת מורפולוגיה וביטוי מטריצה חוץ-תאית

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and the Plasmodium parasites that cause malaria, accumulate in the secretory cavities of SG cells. Here, they are poised for transmission to their vertebrate hosts during a subsequent blood meal. As adult glands form as an elaboration of larval SG duct bud remnants that persist beyond early pupal SG histolysis, the larval SG is an ideal target for interventions that limit disease transmission. Understanding larval SG development can help develop a better understanding of its morphology and functional adaptations and aid in the assessment of new interventions that target this organ. This video protocol demonstrates an efficient technique for isolating, fixing, and staining larval SGs from Anopheles gambiae mosquitoes. Glands dissected from larvae in a 25% ethanol solution are fixed in a methanol-glacial acetic acid mixture, followed by a cold acetone wash. After a few rinses in phosphate-buffered saline (PBS), SGs can be stained with a broad array of marker dyes and/or antisera against SG-expressed proteins. This method for larval SG isolation could also be used to collect tissue for in situ hybridization analysis, other transcriptomic applications, and proteomic studies.

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

The adult mosquito salivary gland (SG) is required for the transmission of all mosquito-borne pathogens to their human hosts, including viruses and parasites. This video demonstrates efficient isolation of the SGs from the larval (L4) stage Anopheles gambiae mosquitoes and preparation of the L4 SGs for further analysis.

ניתוח וחיסון של בלוטות הרוק של Larval מ אנופלס גמביה יתושים

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and ...

Microdissection של האלמנה השחורה עכביש המשי לייצור בלוטות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ייצור סינתטי קורי עכביש בקנה מידה מעבדה

קציר ארס מרעלים חרקים טורפים וחרקים אחרים Heteropteran

מדידת Hypopharyngeal בלוטת Acinus בגודל דבורת הדבש (בומבוס) עובדים

ניתוח התפתחות תאי שוואן Murine לאורך האקסונים של גידול

הכנה של בלוטת הרוק Submandibular מאתר מיקרוסקופ Intravital זקופה

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

הפקה של ארס וארס בלוטת Microdissections מהעכבישים לproteomic וניתוח transcriptomic

בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע, כל עכבר לניתוח של בלוטת מורפולוגיה וביטוי מטריצה חוץ-תאית

ניתוח וחיסון של בלוטות הרוק של Larval מ אנופלס גמביה יתושים