המימון ניתן על ידי המכון הלאומי לבריאות (EB 001,013), מדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה קנדה המכונים לחקר בריאות. אנו מודים לד&quot;ר AP מקגיגן עבור המומחיות שלה לסייע בפיתוח של מודולים.

1) הכנת Tubing <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 2-3 מ &#39;אורך של צינורות פוליאתילן (0.76 מזהה מ&quot;מ x 1.22 מ&quot;מ OD). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נושא מחט 20 G1 לתוך קצה אחד של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור קויל מקום בנרתיק הממירים עצמית חותם (7 1 / 2 &quot;x 13&quot;). שני הקצוות של הצינור צריך להיות ממוקם בסוף unsealed של התיק והדביקה במקום עם הקלטת עיקור גז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיק חותם וגז לעקר. </li></ol> 2) נטרול של קולגן הערה: 1 מ&quot;ל של הקולגן ממלא בערך 2 מ &#39;של צינורות פוליאתילן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הסכום הדרוש של קולגן הדרושים באורך הרצוי של צינור לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל ולשמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 128 UL של 10x α-ממ לכל מ&quot;ל של קולגן על הצינור ומערבבים שוב ושוב על ידי pipetting את הפתרון. הערה: (1) הפתרון צריך להפוך צהוב כמו α-ממ מעורבב לתוך הקולגן acidified ו (2) מנסים למזער בועות כאשר ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את הקולגן ידי הוספת 0.8 סודיום ביקרבונט M עד הקולגן יש pH של 7.4. להערכה הכללית של נתרן ביקרבונט להוסיף pH עד הפתרון קולגן הצהוב הופך צבע ורוד בהיר. הערה: בדרך כלל לוקח 30-60 μL לכל מ&quot;ל כל אחד קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור קולגן מנוטרל על הקרח עד מוכן לשימוש כמו קולגן מנוטרל יהיה ג&#39;ל אם לא שמר על 4 ° C. </li></ol> 3) הטבעת של תאים (אופציונלי) הערה: בהתאם לסוג התא תאים יכול להיות מוטבע בריכוז של בין 1 מיליון תאים לכל מ&quot;ל עד 20 מיליון תאים לכל מ&quot;ל. השתמש בינוני נדרש התאים שברצונך להטביע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה מתאי ולשטוף עם 5 מ&quot;ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהוסיף 3 מ&quot;ל טריפסין-EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים טריפסין-EDTA במשך 5 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים 7 מדיה מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת את המספר הדרוש של תאים להטבעת אל צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים XG ב 300 דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת גלולה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים הקולגן לנטרל ולשמור על הקרח. </li></ol> 4) gelling של קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגית לחתוך את הקצה האטום של שקית המכילה את צינורות פוליאתילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מזרק 3 מ&quot;ל עד 20 גרם של המחט בקצה אחד של צינורות בעזרת פינצטה מעוקרים. שמור את צינורות בתיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הקצה השני של הצינור לתוך הקולגן לנטרל עד קצה הוא בחלק התחתון של צינור חרוטי באמצעות פינצטה מעוקרים. שמור את צינור חרוטי על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את הקולגן לתוך צינורות פוליאתילן ידי retracting על הבוכנה של המזרק באיטיות. הערה: אם קולגן הוא נכנס בצינור במהירות ואז יהיה בועות הטופס הקולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר משיכת קולגן באמצעות צינורות, למשוך את המחט 20 גרם מתוך צינורות ולשים בשני הקצוות בחזרה לשקית. את השקית Tape עצומות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התיק על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. אם קולגן מכילה תאים ואז להעיף את התיק מעל 15 דקות מדי. כך התאים אינם להשתקע לצד אחד של המודול. </li></ol> 5) חיתוך של Tubing מכיל קולגן בג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כותרות החיטוי ואת להב עבור המכשיר חיתוך מגש להחזיק בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את מכשיר חיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות מקום מגש סטרילי מול חיתוך המכשיר לטעון את צינורות לתוך מכשיר החיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת צינור חרוטי 50 מ&quot;ל המכיל 25 מ&quot;ל של התקשורת בנקודת היציאה של המכשיר חיתוך לאסוף את המודולים לחתוך. הערה: המדיה המכילה השתמש FBS אפילו בלבד קולגן מודולים כמו המודולים לא נפרד מן צינורות ללא FBS בתקשורת. אם המודולים מכילים תאים להשתמש בתקשורת נדרש התאים מוטבע. אם אין תאים מוטבע המודולים להשתמש בתקשורת עבור לתאי אנדותל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מכשיר חיתוך לחתוך 2 מ&quot;מ של צינורות באורכים וחתך את הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לחתוך מודולים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות בצינור חרוטי 50 מ&quot;ל. </li></ol> 6) הסרת מודולים קולגן מ - Tubing <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס צינור חרוטי 50 מ&quot;ל המכיל מודולים צינורות במשך 10 שניות. הערה: כאשר עדין המפריד מודולים מוטבע עם צפיפות התאים גבוהה כדי למנוע שבירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו מודולים ליישב לתחתית של התחתית. לוקח בערך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פה רחב פיפטה 10 מ&quot;ל סרולוגיות העברת מודולים התיישבו על צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 6.1-6.3 פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לשלב 7 כדי מודולים מעיל עם לתאי אנדותל או מודולים להעביר לצלחת ללא רקמה תרבות מטופלים. </li></ol> 7) ציפוי מודולים עם לתאי אנדותל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליישב מודולים לתוך החלק התחתון של צינור חרוטי 15 מ&quot;ל עם 5 מ&quot;ל של המדיה עבור הדואר משובצים בתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה מתאי אנדותל ולשטוף עם 5 מ&quot;ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהוסיף 3 מ&quot;ל טריפסין-EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים טריפסין-EDTA במשך 5 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים 7 מדיה מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים. זקוק 5x10 6 תאים אנדותל לכל מ&quot;ל של מודולים ארוז בחלק התחתון של צינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים XG ב 300 דקות ו - 5 resuspend ב 5 מ&quot;ל מדיה תא האנדותל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 5 מ&quot;ל של התקשורת המכיל בתאי האנדותל של מודולים. הערה: זה נותן יחס של 50:50 בין שני סוגי המדיה אשר מצאנו לעבוד ההישרדות והפעילות של שני סוגי התאים. מבחן השימוש מדיום שיתוף התרבות גובשה כדי להבטיח תחזוקה נאותה של פנוטיפים של שני סוגי התאים לפני השימוש בו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מודולים עם לתאי אנדותל הן סטטי דינמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת תערובת סטטי עם מודולים הדגירה לתאי אנדותל על ידי היפוך ולהגדיר את הצינור זקוף על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. חזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דינאמי זרע לתאי אנדותל ידי מנענעת בעדינות את הצינור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור הדגירה סטטי פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המודולים צלחת שאינם רקמת תרבות מטופלים דגירה לילה בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום למחרת מודולים צלחת הלא רקמה חדשה תרבות שטופלו התקשורת טרי (לערבב 50:50 אם באמצעות שיתוף התרבות המערכת) כדי להסיר לתאי אנדותל פנויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מודולים כי הם מצופים בתאי האנדותל עד שהם מכסים 100% מכלל השטח של המודולים. זה בדרך כלל לוקח בערך 7 ימים. </li></ol> 8) נציג תוצאות: המודולים ייראה גלילי כשהם יוסרו מן הצינור. אם המודולים מכילים תאים משובצים ו / או מכוסים בתאי האנדותל הם יכולים החוזה עד 50% בנפח ולפתח צורה סגלגלה (איור 1). המודולים גם להיות צפופים יותר אטום כאשר נצפים על ידי מיקרוסקופ אור (איור 1). גם כאשר בתאי האנדותל הם ומחוברות על פני השטח של המודולים יש היווצרות של צמתים צמודים אשר ניתן לראות על ידי צביעה immunofluorescence של VE-cadherin (איור 2). העברת ניתוח המוניים הוכיחה כי מודולים מסוגלים לתמוך צפיפות התא גבוה (7 8x10 תאים / ס&quot;מ 3) מבלי לפתח גרעין נמקי כתוצאה תחבורה חמצן לקויה, אשר לעיתים קרובות בעייתית ברקמות גדולות יותר (למשל מודולים של קוטר גדול, D = 1.4 מ&quot;מ) (איור 3). <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: מודול ייצור והתכווצות. התכווצות מודול התרחשו במהלך שלושת הימים הבאים HUVEC-C (קו תאים אנדותל) זריעת תוצאות מודול בקוטר קטן יותר באופן משמעותי ואורך (p &lt;0.001) (A). Embedded HepG2 התאים היו מפוזרים באופן אחיד בכל פעם של ייצור בתוך מודולים שמרו על כדאיות גבוהה (B). [תאים חיים ירוק; תאים מתים אדום] [עיבוד Corstorphine 2010] <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2: VE-cadherin מכתים immunofluorescent של צמתים EC תא הדוק 10 ימים לאחר RAEC שבו מצופה על פני השטח של המודול. בר סולם = 50 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3: מכתים trichrome של מאסון של מודולים טיפוסי (בקוטר 0.76 מ&quot;מ הראשונית) ומודולים גדול (בקוטר 1.4 מ&quot;מ הראשונית) להדגים את ההשפעה של מגבלות דיפוזיה חמצן. שבעה ימים לאחר ייצור, מספר גדול של תאים מתים יצרו בתוך הליבה של מודולים גדולים (הפאנל הימני התחתון), ומשאיר רק שפה רזה (~ 200μm עבה) של תאים קיימא. לעומת זאת, מודולים קטן שמרה על התפלגות אחידה גבוה של תאים חיים. [מודולים משובץ HepG2 תאים מצופים בתאי האנדותל.] [הפיקוח Corstorphine 2010] <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4: (א) HMEC-1 seeded על poloxamine - מודולים קולגן. אחרי יום 1 של זריעת poloxamine-קולגן מודולים לשמור על צורה גלילית שלהם ויש מוגבל מצורף תכונות התא לעומת מודולים קולגן בלבד. בר סולם = 200 מיקרומטר. (ב) מיקרוסקופ אור תמונה של מודול המכיל קולגן PLGA מבוססי microspheres מתכלה. בר סולם = 500 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5: דוגמאות של מבחני חוץ גופית. (א) assay אנגיוגנזה: נימי כמו תצורות על מודול seeded עם לתאי אנדותל ניתן לאתר בקלות לכמת לאחר 5 ימים של דגירה עם שומן המופק מתאי גזע. (ב) מיקרוסקופיה Confocal תמונות של assay חי / מת על מודולים שבו staining עבור תאים חיים ירוק עבור תאים מתים אדום. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig6.jpg" alt="איור 6" /> איור 6: מודולים קולגן המכיל מוטבעים בתאי גזע mesenchymal ושכבת פני השטח של תאים אנדותל. מודולים נחשפו ללחץ גזירה (~ 0.64 dyn / cm 2) למשך 7 ימים בתא microfluidic ולהתחיל להראות היתוך בנקודות המגע. בתאי האנדותל הם מוכתמים vWF (חום) לבין גרעינים mesenchymal בתאי גזע להופיע כחול (H &amp; E). בר סולם = 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig7.jpg" alt="איור 7" /> איור 7: מאות מודולים קולגן המכיל שומן, נגזר בתאי גזע (ASC) ומצופה אדם לתאי אנדותל כלי הדם (HMEC) הם מושתל מתחת לעור עכבר ללמוד ASC / HMEC אינטראקציה in vivo עבור יישומים התחדשות שומן.

<ol>
	<li>Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+vessel+tissue+engineering+driven+by+endothelialized+modules.">Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules.</a> , (2010).</li><li>Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+factor+and+diffusion+limitations+in+collagen+gel+modules+containing+HepG2+cells.">Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2010).</li><li>Gupta, R., Van Rooijen, N., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+endothelialized+modular+constructs+implanted+in+an+omental+pouch+in+nude+rats.">Fate of endothelialized modular constructs implanted in an omental pouch in nude rats.</a> Tissue Eng. Part A 15, 2875-2887 (2009).</li><li>Leung, B. M., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+tissue+engineering+construct+containing+smooth+muscle+cells+and+endothelial+cells.">A modular tissue engineering construct containing smooth muscle cells and endothelial cells.</a> Ann Biomed Eng. 35, 2039-2049 (2007).</li><li>McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+cell-containing+gel+modules+to+assemble+modular+tissue-engineered+constructs+[corrected].">Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected].</a> Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).</li><li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+organoid+engineered+by+modular+assembly+enables+blood+perfusion.">Vascularized organoid engineered by modular assembly enables blood perfusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11461-11466 (2006).</li><li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+tissue+engineering:+fabrication+of+a+gelatin-based+construct.">Modular tissue engineering: fabrication of a gelatin-based construct.</a> J Tissue Eng Regen Med. 1, 136-145 (2007).</li><li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+sub-mm-sized+modules+containing+encapsulated+cells+for+modular+tissue+engineering.">Design and fabrication of sub-mm-sized modules containing encapsulated cells for modular tissue engineering.</a> Tissue Eng. 13, 1069-1078 (2007).</li><li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+criteria+for+a+modular+tissue-engineered+construct.">Design criteria for a modular tissue-engineered construct.</a> Tissue Eng. 13, 1079-1089 (2007).</li><li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thrombogenicity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cell+seeded+collagen+modules.">The thrombogenicity of human umbilical vein endothelial cell seeded collagen modules.</a> Biomaterials. 29, 2453-2463 (2008).</li><li>Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen/poloxamine+hydrogels:+cytocompatibility+of+embedded+HepG2+cells+and+surface-attached+endothelial+cells.">Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells.</a> Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

יש לנו מספר מפוברק שונים מיקרו רקמות באמצעות מודולים מוטבע עם סוגי תאים שונים 1-11. יש לנו מוטבע בהצלחה cardiomyocytes העיקרי, איים, בתאי גזע השומן ותאי סטרומה mesenchymal כמו גם כמה שורות תאים כולל HepG2, NIH 3T3 ו 9 שיבוט תאים בכבד. יש לנו מצופה מודולים עם מספר סוגים של תאים אנדותל כ...

<table><tbody><tr><td>Intramedic tubing PE60</td><td>BD Biosciences</td><td>427416</td><td>Different diameter of tubing can be used to change the diameter of the modules</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Purcol acidificed collagen, 3 mg/mL</td><td>Cedarlane Labs</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>20G needle</td><td>BD Biosciences</td><td>305175</td><td>Diameter of the needle needs to be similar to the diameter of the tubing</td></tr><tr><td>3 mL syringe</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Convertors Self-Seal Pouch 7 1/2&amp;#8221; x 13&amp;#8221;</td><td>Cardinal Health</td><td>92713</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Wide Tip serological pipet</td><td>BD Biosciences</td><td>357504</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serological pipet</td><td>BD Biosciences</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml serological pipet</td><td>BD Biosciences</td><td>357543</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of micro-tissues using modules of collagen gel containing cells

פרוטוקול זה מתאר את ייצור של סוג של מיקרו הרקמות נקרא מודולים. הגישה מודול מחולל אחיד, רקמות מדרגי vascularized. המודולים יכולים להיות עשויים קולגן כמו גם חומרים gelable או crosslinkable אחרים. הם כ -2 מ&quot;מ אורך ו 0.7 מ&quot;מ קוטר על ייצור אבל לכווץ בגודל עם תאים מוטבע או כאשר המודולים הם מצופים בתאי האנדותל. מודולים בנפרד הם קטנים מספיק שתאי המוטבע בתוך מגבלת דיפוזיה של חמצן וחומרים מזינים אחרים, אבל מודולים יכול להיות ארוזים יחד כדי ליצור רקמות גדול כי הם perfusable. רקמות אלה מודולרי בבנייה כי תאים מסוגים שונים יכול להיות מוטבע או מצופה על מודולים לפני שהם ארוזים יחד כדי ליצור רקמות מורכבות. ישנם שלושה שלבים עיקריים שהופך את המודולים: (1) לנטרל את הקולגן הטבעה תאים זה, (2) gelling קולגן בצינור חיתוך מודולים ו (3) ציפוי מודולים עם לתאי אנדותל.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells at JoVE.com

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

יצירה של מיקרו רקמות באמצעות ג&#39;ל קולגן גלילי, המכונה מודולים, המכילות תאים אשר מוטבעים משטח מצופה בתאי האנדותל.

ייצור של מיקרו-רקמות באמצעות מודולים של קולגן ג&#39;ל התאים המכילים

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

fabrication-micro-tissues-using-modules-collagen-gel-containing

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.7K Views.  University of Toronto. יצירה של מיקרו רקמות באמצעות ג'ל קולגן גלילי, המכונה מודולים, המכילות תאים אשר מוטבעים משטח מצופה בתאי האנדותל.

Video: Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

קולגן אני Assay Organotypic: פלטפורמה חשילה לבחינת התנהגות תא בהקשר 3-Dimensional

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim to use these principles to create tissues with predefined collagen architectures. A full understanding of the exact underlying processes of collagen remodeling to control the final tissue architecture, however, is lacking. In particular, little is known about the (re)orientation of collagen fibers in response to changes in tissue mechanical loading conditions. We developed an in&#160;vitro model system, consisting of biaxially-constrained myofibroblast-seeded fibrin constructs, to further elucidate collagen (re)orientation in response to i) reverting biaxial to uniaxial static loading conditions and ii) cyclic uniaxial loading of the biaxially-constrained constructs before and after a change in loading direction, with use of the Flexcell FX4000T loading device. Time-lapse confocal imaging is used to visualize collagen (re)orientation in a nondestructive manner.
Cell and collagen organization in the constructs can be visualized in real-time, and an internal reference system allows us to relocate cells and collagen structures for time-lapse analysis. Various aspects of the model system can be adjusted, like cell source or use of healthy and diseased cells. Additives can be used to further elucidate mechanisms underlying collagen remodeling, by for example adding MMPs or blocking integrins. Shape and size of the construct can be easily adapted to specific needs, resulting in a highly tunable model system to study cell and collagen (re)organization.

This model system starts from a myofibroblast-populated fibrin gel that can be used to study endogenous collagen (re)organization real-time in a nondestructive manner. The model system is very tunable, as it can be used with different cell sources, medium additives, and can be adapted easily to specific needs.

בונה הנדסת רקמות מבוססת הפיברין מmyofibroblasts ויישום של אילוצים ומתח כדי לגרום לתא וקולגן ארגון (בעניין)

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

שיטה משופרת להכנת סוג I קולגן מעור

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

המצאה של Myogenic בונה רקמות מהונדסות

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

Biology

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

קולגן שכבת הפקדת-ידי שכבה במכשירי microfluidic לMicrotissue ייצוב

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark of cardiac and musculoskeletal tissues. To study cell response to aligned microenvironments in vitro, several protocols have been developed to generate COL1 matrices with defined fiber alignment, including magnetic, mechanical, cell-based, and microfluidic methods. Of these, microfluidic approaches offer advanced capabilities such as accurate control over fluid flows and the cellular microenvironment. However, the microfluidic approaches to generate aligned COL1 matrices for advanced in vitro culture platforms have been limited to thin "mats" (&lt;40 &#181;m in thickness) of COL1 fibers that extend over distances less than 500 &#181;m and are not conducive to 3D cell culture applications. Here, we present a protocol to fabricate 3D COL1 matrices (130-250 &#181;m in thickness) with millimeter-scale regions of defined fiber alignment in a microfluidic device. This platform provides advanced cell culture capabilities to model structured tissue microenvironments by providing direct access to the micro-engineered matrix for cell culture.

This protocol demonstrates the use of a microfluidic channel with changing geometry along the fluid flow direction to generate extensional strain (stretching) to align fibers in a 3D collagen hydrogel (&lt;250 &#181;m in thickness). The resulting alignment extends across several millimeters and is influenced by the extensional strain rate.

מיקרו-הנדסה הידרוג'ל קולגן תלת-ממדית עם יישור סיבים לטווח ארוך

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark ...

Fabricating Engineered Nanofibrillar Collagen with Directed Patterning

Production of Nanofibrillar Patterned Collagen for Tissue Engineering

Regenerative biomaterials are designed to facilitate cell-material interactions to guide the repair of damaged tissues and organs. These materials are designed to emulate the biophysical properties of native tissue, providing cellular phenotypic and morphological guidance that contributes to the restoration of the regenerative tissue niche. Collagen, a prevalent extracellular matrix protein, is a common component of these regenerative biomaterials due to its biocompatibility and other favorable properties. The current study describes a novel and straightforward method for the fabrication of engineered nanofibrillar collagen with directed fibril patterning. Through the manipulation of shear stress, temperature, and pH, collagen fibrillogenesis and alignment are precisely controlled without requiring specialized equipment. This approach allows for the creation of nanofibrillar collagen biomaterials that mimic the native structure of tissues exhibiting either anisotropic or isotropic characteristics. The flexibility in collagen nanofibril patterning not only facilitates the study of nanoscale patterning on cell behavior but also offers diverse possibilities for patterned tissue engineering applications.

The following protocol presents a shear-based extrusion method for the fabrication of collagen hydrogels with nanoscale patterned fibrils, which can be applied to a broad range of tissue engineering applications.

Regenerative biomaterials are designed to facilitate cell-material interactions to guide the repair of damaged tissues and organs. These materials are ...

ייצור של מיקרו-רקמות באמצעות מודולים של קולגן ג'ל התאים המכילים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video