פרויקט זה נתמך על ידי מענקים CJJ מן הקרן הלאומית למדע והחברה למדעים Biomolecular.

1. יום 1: MexB מ Pseudomonas aeruginosa מקודד על ידי pFB101. הגן MexB הוגדל מ - פ aeruginosa DNA הגנומי ונוסף על NdeI ואתרי XhoI הגבלה של + pET30b וקטור. לבנות מכיל תג בטרמינל C-hexahistidine. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמיד משמש כדי להפוך את ה coli זן C43 (DE3) 12, ואת transformants הם מצופה על אגר LB המכיל 30 UG / mL kanamycin. </li></ol> 2. יום 2: תרבויות לינה: <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בערב, 4 X 3 LB המכיל 30 מ&quot;ל תרבויות UG / mL kanamycin הם מחוסן מן המושבות transformant טריים. לחלופין, תרבויות יכול להיות מחוסן מפני סלסול קפוא. תרבויות אלו קטנים הם גדלו על מכבש על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> 3. יום 3: גידול 6 ליטר תרבויות: <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר, השתמש תרבויות לילה לחסן LB 150 מ&quot;ל המכיל 30 UG / mL kanamycin. לגדול התרבות ב 37 ° C על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעות אחר הצהריים, להשתמש תרבות קטן לחסן 6 x 1 ליטר 2XYT מדיה המכילה 30 UG / kanamycin מ&quot;ל צלוחיות Fernbach. (השתמש 25 מ&quot;ל לכל תרבות לדילול 01:40). לגדול התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים OD של 600 0.4-0.6, כ -1.5 שעות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התרבויות להגיע צפיפות נכונה, להשרות ביטוי החלבון על ידי הוספת 0.5 מ&quot;ל 1M IPTG. מכניסים את כל צלוחיות בשנות ה שייקר ולהמשיך לגדל אותם ב 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> 4. יום 4: קצירת התאים וטיהור חלבון: <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מעכבי פרוטאז, DNAse ו ליזוזים לפתרונות חיץ כדלקמן: עד 50 מ&quot;ל של חיץ resuspension התא, להוסיף 10 מ&quot;ג DNaseI (0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בריכוז הסופי), 1 מעכב השלם EDTA ללא פרוטאז הלוח, וקורט ליזוזים . עד 60 מ&quot;ל של חיץ resuspension קרום, להוסיף 1 מעכבי פרוטאז הלוח. כדי 50 מ&quot;ל נוסף של המאגר resuspension קרום, להוסיף 1 מעכבי פרוטאז הלוח. שמור את כל שלושה פתרונות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התרבויות 30 דקות 5,000 סל&quot;ד בצנטריפוגה בקנה מידה גדול כדי לקצור את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים חיץ תא resuspension 100 מ&quot;ל (50 NAP מ&quot;מ, pH 7.0, 300 mM NaCl, 2 מ&quot;מ MgCl 2, 1 מעכב השלם EDTA ללא לוח פרוטאז, 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל DNAse אני, קמצוץ של ליזוזים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את פתרון התא פעמיים באמצעות תא הלחץ הצרפתי 12,000 psi (762 מד הלחץ). אסוף את lysate תא בקבוק קר כל הזמן על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את lysate התא SS34 צינורות צנטריפוגה ו צנטריפוגות כדי להסיר שאריות תאים למשך 30 דקות בסל&quot;ד 10,000 ב 4 מעלות צלזיוס הרוטור SS-34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את supernatant לתוך צינורות Ti647.5 ultracentrifuge. צנטריפוגה 50 דקות בסל&quot;ד 40,000 ב 4C. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה, אשר מכיל את קרום התא, על כ. 25 מ&quot;ל של חיץ resuspension קרום (50 NAP מ&quot;מ, pH 7.0, 300 mM NaCl, גליצרול 5%, 1 מעכב השלם EDTA ללא לוח פרוטאז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה קרום לצינור צנטריפוגה צנטריפוגה נקי ב 40,000 סל&quot;ד ב הרוטור Ti647.5 עבור 50 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend הממברנה גלולה לרחוץ 25 חוצץ קרום מ&quot;ל resuspension (50 NAP מ&quot;מ, pH 7.0, 300 mM NaCl, גליצרול 5%, 1 מעכב השלם EDTA ללא לוח פרוטאז). </li></ol> 5. TM Solublization חלבון: <ol start="15" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי הממברנות resuspended (כ 25 מ&quot;ל), מוסיפים 6 DDM מ&quot;ל 10% (ריכוז חומר הניקוי הסופי = DDM 2%) רוק את התערובת על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את התערובת בסל&quot;ד 40,000 עבור 40 דקות על 4 מעלות צלזיוס הרוטור Ti647.5 כדי להפריד אבקת חלבון מסיס קומפלקסים של חלבונים מסיסים. שמור את supernatant, המכיל אבקת חלבון מתחמי MexB. </li></ol> 6. IMac: <ol start="17" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את supernatant המתקבל ספין במהירות גבוהה עם זיקה חרוזי מתכת טופר equilibrated במאגר resuspension. דגירה של 1 שעות על רולר בבית 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת לתוך גוף זרימת הכבידה טור וזורקים את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הטור עם 20 מ&quot;ל (10 כרכים עמודה) של הצפת מחייב לשטוף iMac (50 NAP מ&quot;מ, ה-pH 7, 300 mM NaCl, גליצרול 5%, DDM 0.2%) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute את החלבון עם חיץ elution iMac (50 NAP מ&quot;מ, pH 7.0, 300 mM NaCl, גליצרול 5%, 250 מ&quot;מ imidazole, DDM 0.2%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 15 דגימות μL של שברים elution, לערבב עם כל 15 חיץ μL SDS 2X מדגם לניתוח על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide. ספין 30sec ב microcentrifuge. ניתוח דגימות על polyacrylamide של 10% SDS ג&#39;ל לאמוד את הסכום ואת טוהר MexB בשבריר אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת שברים המכיל את אבקת חלבון מתחמי MexB ולרכז אותם concentrator ספין ב 4 ° C. היזהר כי החלבון אינו המשקע החוצה זה sטפ. </li></ol> 7. סינון ג&#39;ל עמודה: <ol start="23" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לאזן 12 Superose HL 30/10 טור עם חיץ 24 מ&quot;ל ריצה (50 NAP מ&quot;מ, pH 7.0, 300 mM NaCl, גליצרול 5%, 0.2% בטא octylglucoside), ולחכות הבסיס שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את טעינת מערכת אקטע לולאה עם חיץ פועל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן הפתרון חלבון באמצעות מסנן מזרק לפני החלת אותו הטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען עד 240 μL של הפתרון חלבון על הטור, עם ריכוז חלבון של עד 5 מג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלה 1.5 כרכים עמודה (36 מ&quot;ל) של חיץ, לאסוף את השברים 0.25 מ&quot;ל. אבקת חלבון מתחמי MexB צריך elute כמו לשיא בסביבות 10-15 מ&quot;ל של נפח elution. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו 5 דגימות μL של שברים שיא. מערבבים את כל מדגם 01:01 עם חיץ מדגם SDS 2X. ניתוח דוגמאות על ג&#39;ל polyacrylamide 10% כדי לאמוד את הסכום ואת טוהר MexB בשבריר כל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת שברים המכיל MexB טהור. </li></ol> 8. נציג תוצאות: איור 1 כוללת ג&#39;ל polyacrylamide עם שברים טור נקווה מהעמודה iMac ו שברים בודדים מעמודה הסינון ג&#39;ל. אחרי הטור סינון ג&#39;ל חלבון מופיע טהור על ידי ג&#39;ל polyacrylamide Coomassie מוכתם. איור 2 כולל עקבות מהעמודה ג&#39;ל סינון מראה את השיא העיקרי של משחררי אבקת חלבון מורכב מהעמודה. התשואה הממוצעת של חלבון MexB הוא כ 2 מ&quot;ג 6 ליטרים של תרבות 2XYT. <img src="/files/ftp_upload/2134/2134fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. SDS-PAGE ג&#39;ל של טיהור PDCs MexB. Lane 1, משקל סמנים מולקולריים. 2, משולב שברים iMac. 3-7, טור ג&#39;ל סינון שברים. <img src="/files/ftp_upload/2134/2134fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. דוגמה סינון תוצאות ג&#39;ל ניקוי MexB קומפלקסים חלבונים (PDC).

<ol>
	<li>Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+elegant+means+of+self-protection+in+gram-negative+bacteria+by+recognizing+and+extruding+xenobiotics+from+the+periplasmic+space.">An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space.</a> J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).</li><li>Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+efflux+pump(s)+in+intrinsic+resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa:+active+efflux+as+a+contributing+factor+to+beta-lactam+resistance.">Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).</li><li>Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+MexA-MexB-OprM+in+antibiotic+efflux+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).</li><li>Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificities+of+MexAB-OprM,+MexCD-OprJ,+and+MexXY-oprM+efflux+pumps+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).</li><li>Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AcrAB+efflux+pump+plays+a+major+role+in+the+antibiotic+resistance+phenotype+of+Escherichia+coli+multiple-antibiotic-resistance+(Mar)+mutants.">AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants.</a> J. Bacteriol. 178, 306-308 (1996).</li><li>Srikumar, R., Kon, T., Gotoh, N., Poole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug+efflux+pumps+MexA-MexB-OprM+and+MexC-MexD-OprJ+in+a+multidrug-sensitive+Escherichia+coli+strain.">Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-OprJ in a multidrug-sensitive Escherichia coli strain.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 42, 65-71 (1998).</li><li>Tikhonova, E. B., Zgurskaya, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AcrA,+AcrB,+and+TolC+of+Escherichia+coli+Form+a+Stable+Intermembrane+Multidrug+Efflux.">AcrA, AcrB, and TolC of Escherichia coli Form a Stable Intermembrane Multidrug Efflux.</a> Complex. J. Biol. Chem. 279, 32116-3224 (2004).</li><li>Yoneyama, H., Ocakatan, A., Tsuda, M., Nakae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mex-gene+products+in+antibiotic+extrusion+in+Pseudomonas+aeruginosa.">The role of mex-gene products in antibiotic extrusion in Pseudomonas aeruginosa.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 611-618 (1997).</li><li>Berger, B. W., Gendron, C. M., Robinson, C. R., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+protein+and+surfactant+interactions+in+membrane-protein+crystallization.">The role of protein and surfactant interactions in membrane-protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 61, 724-730 (2005).</li><li>Jones, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactants+in+membrane+solubilisation.">Surfactants in membrane solubilisation.</a> Int. J. Pharm. 177, 137-159 (1999).</li><li>Maire, M. l. e., Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents.">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).</li><li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli:+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels.">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בנוסף multidrug, התנגדות פעילויות רבות הסלולר חיוניים, כולל תחבורה ותקשורת יון תאים תאים, תחבורה, שלפוחית, תחזוקה של המבנה התאי, והוא מארח הפתוגן אינטראקציות, לערב חלבונים אשר מוטבעות בתוך קרום התא. חלבונים הטרנסממברני לפצות מעל 30% של חלבונים ידועים הם מטרות עבור רוב התרו?...

<table><tbody><tr><td>SDS sample buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>C43(DE3) E. coli strain</td><td>Lucigen</td><td>60345-1</td><td></td></tr><tr><td>kanamycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4378</td><td></td></tr><tr><td>2XYT media</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2466-2</td><td></td></tr><tr><td>LB media</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61189-5000</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3226-1</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7651</td><td></td></tr><tr><td>Complete EDTA-free protease inhibitor tablets</td><td>Roche Group</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>NaP monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6566</td><td></td></tr><tr><td>NaP dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;n&lt;/em&gt;-dodecyl-&amp;#946;-D-maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>15ml tubes</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>See-Saw Rocker</td><td>Fisher Scientific</td><td>SSL 4</td><td></td></tr><tr><td>Talon metal affinity resin</td><td>Clontech Laboratories</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>10% polyacrylamide SDS PAGE gels</td><td>Bio-Rad</td><td>161-1454</td><td></td></tr><tr><td>Tris/glycine/SDS PAGE running buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0732</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidascope prestained molecular weight markers</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0324</td><td></td></tr><tr><td>Superose 12 30/10 column</td><td>GE Healthcare</td><td>12 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>Amicon centrifugal concentrator</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLFG R04 NL</td><td></td></tr><tr><td>Fernbach flasks</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-552-39</td><td></td></tr><tr><td>Shaker to hold Fernbach flasks</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akta system</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 l centrifuge bottles</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>969329</td><td></td></tr><tr><td>RC-5 centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SS34 fixed-angle rotor and tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall floor model Ultracentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T647.5 rotor and tubes with caps</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>08322</td><td></td></tr><tr><td>French Pressure Cell</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-032</td><td></td></tr></tbody></table>

expression, detergent solubilization, and purification of a membrane transporter, the mexb multidrug resistance protein

התנגדות Multidrug (MDR), היכולת של תא סרטני או פתוגן להיות עמידים בפני מגוון רחב של תרופות נוגדות סרטן מבנית או תפקודית ואינו קשור אנטיביוטיקה, היא בעיה רצינית הנוכחי בריאות הציבור. זו התנגדות multidrug נובע במידה רבה אנרגיה תלויי משאבות בזרימת סמים. המשאבות לגרש תרופות נוגדות סרטן או אנטיביוטיקה לתוך המדיום חיצוניים, הורדת ריכוז תאיים שלהם מתחת לסף רעילים. אנחנו לומדים התנגדות multidrug ב Pseudomonas aeruginosa, פתוגן חיידקי אופורטוניסטית שגורם לזיהומים בחולים עם סוגים רבים של פציעה או מחלה, למשל, כוויות או סיסטיק פיברוזיס, וגם חיסונית נפגעת דיאליזה סרטן, חולים להשתלה. בזרימת הגדולות MDR משאבות פ aeruginosa הם קומפלקסים משולשת המורכבת antiporter הפנימית הממברנה פרוטונים סמים (RND), ערוץ הממברנה החיצונית (OMF), לבין חלבון מקשר periplasmic (MFP) 1-8. החלבונים RND ו OMF הם חלבונים הטרנסממברני. חלבונים הטרנסממברני לפצות יותר מאשר 30% של כל החלבונים הם 65% מטרות תרופה הנוכחי. תחומים הטרנסממברני הידרופובי לייצר חלבונים מסיסים חיץ מימית. לפני חלבון הטרנסממברני יכול להיות מטוהרים, יש צורך למצוא את התנאים חוצץ המכיל חומר ניקוי עדין המאפשרים את החלבון להיות solubilized כמתחם אבקת חלבון (PDC) 11/09. בדוגמה זו, אנו משתמשים חלבון RND, פ MexB aeruginosa טרנספורטר הטרנסממברני, כדי להדגים איך לבטא צורה רקומביננטי של חלבון הטרנסממברני, solubilize אותו באמצעות דטרגנטים, ולאחר מכן לטהר את אבקת קומפלקסים חלבונים. שיטה זו בכלל ניתן ליישם את הביטוי, טיהור, ו solubilization של חלבונים רבים אחרים קרום הביע recombinantly. ניקוי קומפלקסים חלבונים יכול מאוחר יותר לשמש אפיון ביוכימי או biophysical לרבות קביעת רנטגן קריסטל מבנה או מחקרים crosslinking.

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein at JoVE.com

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

בפרוטוקול הזה אנחנו מדגימים את הביטוי, solubilization, וטיהור של חלבון קרום הביע recombinantly, MexB, כפי מורכב חלבון מסיס חומר ניקוי. MexB היא התנגדות הממברנה multidrug טרנספורטר מן החיידק Pseudomonas aeruginosa אופורטוניסטית הפתוגן.

הביטוי, solubilization דטרגנט, ועל טיהור Transporter ממברנה, חלבון ההתנגדות MexB Multidrug

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

expression-detergent-solubilization-purification-membrane-transporter

Research

JoVE Journal

Biology

21.3K Views.  University of Illinois Chicago - UIC. בפרוטוקול הזה אנחנו מדגימים את הביטוי, solubilization, וטיהור של חלבון קרום הביע recombinantly, MexB, כפי מורכב חלבון מסיס חומר ניקוי. MexB היא התנגדות הממברנה multidrug טרנספורטר מן החיידק Pseudomonas aeruginosa אופורטוניסטית הפתוגן.

Video: Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar concentration forming hydrophobic cores surrounded by hydrophilic shells in aqueous environments. The core of these micelles can be utilized to load hydrophobic, poorly water soluble drugs like docetaxel (DTX) and everolimus (EVR). Systematic characterization of the micelle structure and drug loading capabilities are important before in vitro and in vivo studies can be conducted. The goal of the protocol described herein is to provide the necessary characterization steps to achieve standardized micellar products. DTX and EVR have intrinsic solubilities of 1.9 and 9.6 &#181;g/ml respectively Preparation of these micelles can be achieved through solvent casting which increases the aqueous solubility of DTX and EVR to 1.86 and 1.85 mg/ml, respectively. Drug stability in micelles evaluated at room temperature over 48 hr indicates that 97% or more of the drugs are retained in solution. Micelle size was assessed using dynamic light scattering and indicated that the size of these micelles was below 50 nm and depended on the molecular weight of the polymer. Drug release from the micelles was assessed using dialysis under sink conditions at pH 7.4 at 37 oC over 48 hr. Curve fitting results indicate that drug release is driven by a first order process indicating that it is diffusion driven.

The goal of this protocol is to describe the preparation and characterization of physically entrapped, poorly water soluble drugs in micellar drug delivery systems composed of amphiphilic block copolymers.

הכנה ואפיון של פרט ורב-סמים נטענים בפח פיזי Micelles פולימרית

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar ...

Chemistry

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the investigation of biological materials, biofuel processing, and bio-inspired materials covering nanometer to micrometer length scales. The methods presented here for investigating physical properties (i.e., size and shape) of membrane proteins (here, MmIAP, an intramembrane aspartyl protease from Methanoculleus marisnigri) in solutions of micelle-forming detergents are well-suited for this small-angle neutron scattering instrument, among others. Other biophysical characterization techniques are hindered by their inability to address the detergent contributions in a protein-detergent complex structure. Additionally, access to the Bio-Deuteration Lab provides unique capabilities for preparing large-scale cultivations and expressing deuterium-labeled proteins for enhanced scattering signal from the protein. While this technique does not provide structural details at high-resolution, the structural knowledge gap for membrane proteins contains many addressable areas of research without requiring near-atomic resolution. For example, these areas include determination of oligomeric states, complex formation, conformational changes during perturbation, and folding/unfolding events. These investigations can be readily accomplished through applications of this method.

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

This protocol demonstrates how to obtain a low-resolution ab initio model and structural details of a detergent-solubilized membrane protein in solution using small-angle neutron scattering with contrast-matching of the detergent.

התאמת ניגודיות דטרגנט בניסויים פיזור ניוטרון זווית קטנה עבור ניתוח מבנה של חלבון ממברנה ומודלים Initio אלב

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Biochemistry

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

ביטוי Solubilization, טיהור של בוראט האיקריוטים שנאים

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

אסטרטגיות לביטוי וטיהור מובילי מובילי מומסים

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, metabolites, neurotransmitters, and pharmaceuticals. Despite having emerged as attractive therapeutic targets and markers of disease, this group of proteins is still relatively underdrugged by current pharmaceuticals. Drug discovery projects for these transporters are impeded by limited structural, functional, and physiological knowledge, ultimately due to the difficulties in the expression and purification of this class of membrane-embedded proteins. Here, we demonstrate methods to obtain high-purity, milligram quantities of human SLC transporter proteins using&#160;codon-optimized gene sequences. In conjunction with a systematic exploration of construct design and high-throughput expression, these protocols ensure the preservation of the structural integrity and biochemical activity of the target proteins. We also highlight critical steps in the eukaryotic cell expression, affinity purification, and size-exclusion chromatography of these proteins. Ultimately, this workflow yields pure, functionally active, and stable protein preparations suitable for high-resolution structure determination, transport studies, small-molecule engagement assays, and high-throughput in vitro screening.

מחבר זרקור: ביטוי וטיהור של מובילי נשאי מומסים אנושיים באמצעות גנים ממוטבים של קודון 

Structural and biochemical studies of human membrane transporters require milligram quantities of stable, intact, and homogeneous protein. Here we describe scalable methods to screen, express, and purify human solute carrier transporters using codon-optimized genes.

ביטוי וטיהור בתפוקה גבוהה של נשאי מומסים אנושיים למחקרים מבניים וביוכימיים

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, ...

Purification of the Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase from Rabbit Muscle

Some P-type ATPases, such as sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA), are inherently labile membrane proteins that require specific physicochemical conditions during purification to obtain them with high purity and structural quality and in a catalytically active form. The disaccharide trehalose is a compatible solute that is synthesized and accumulated in high concentrations in the yeast cytoplasm to stabilize the membranes and proteins. The use of trehalose as an additive in the protocol for the purification of plasma membrane H+-ATPase results in a high-quality preparation, the hexameric structure of which is shown by biochemical analytical methods. Trehalose can, therefore, be used as a stabilizing additive for the purification of membrane proteins (P-ATPases). This protocol describes the modification of the classical protocol for SERCA purification by subjecting SERCA to centrifugation on a trehalose concentration gradient. The inclusion of this carbohydrate led to the purification of SERCA in a catalytically active form with high purity and, importantly, in a stable form. Partial biochemical characterization of the purified SERCA (SDS-PAGE, enzyme kinetics, FITC labeling, circular dichroism spectroscopy) showed that the enzyme is suitable for functional and structural studies. The use of trehalose in the purification protocol of P-type ATPases and other labile membrane (and cytosolic) proteins is suggested.

This protocol describes an improved SERCA purification method, which includes the disaccharide trehalose in the final centrifugation step. This carbohydrate stabilizes proteins under harsh conditions. The purified SERCA was catalytically active and displayed high purity, making it suitable for structural and functional studies.

טיהור הרטיקולום הסרקו-אנדופלזמי Ca2+-ATPase משריר הארנב

Some P-type ATPases, such as sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA), are inherently labile membrane proteins that require specific ...

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution of efflux pumps from the Gram-negative bacteria Pseudomonas aeruginosa in a biomimetic environment that allows for an accurate investigation of their activity of transport. Three prerequisites are fulfilled: compartmentation in a lipidic environment, use of a relevant index for transport, and generation of a proton gradient. The membrane protein transporter is reconstituted into liposomes together with bacteriorhodopsin, a light-activated proton pump that generates a proton gradient that is robust as well as reversible and tunable. The activity of the protein is deduced from the pH variations occurring within the liposome, using pyranin, a pH-dependent fluorescent probe. We describe a step-by-step procedure where membrane protein purification, liposome formation, protein reconstitution, and transport analysis are addressed. Although they were specifically designed for an RND transporter, the described methods could potentially be adapted for use with any other membrane protein transporter energized by a proton gradient.

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

We present a protocol for the in vitro investigation of efflux pumps from Pseudomonas aeruginosa. This protocol allows for the generation of a robust, reversible, and tunable proton gradient within the liposome membrane and hence should be adaptable to any membrane protein energized by the protomotive force.

במבחנה של החקירה וMexAB זרימת המשאבה מPseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl- from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Proteoliposome מבוסס הזרימה Assay כדי לקבוע מאפייני מולקולה בודדת של Cl<sup-&gt;</sup&gt; ערוצים ומסועים

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable efforts have been made in this field, but techniques enabling automated high-throughput transport analysis in combination with solvent-free lipid bilayer techniques required for the analysis of membrane transporters are rare. This class of transporters however is crucial in cell homeostasis and therefore a key target in drug development and methodologies to gain new insights desperately needed.
The here presented manuscript describes the establishment and handling of a novel biochip for the analysis of membrane protein mediated transport processes at single transporter resolution. The biochip is composed of microcavities enclosed by nanopores that is highly parallel in its design and can be produced in industrial grade and quantity. Protein-harboring liposomes can directly be applied to the chip surface forming self-assembled pore-spanning lipid bilayers using SSM-techniques (solid supported lipid membranes). Pore-spanning parts of the membrane are freestanding, providing the interface for substrate translocation into or out of the cavity space, which can be followed by multi-spectral fluorescent readout in real-time. The establishment of standard operating procedures (SOPs) allows the straightforward establishment of protein-harboring lipid bilayers on the chip surface of virtually every membrane protein that can be reconstituted functionally. The sole prerequisite is the establishment of a fluorescent read-out system for non-electrogenic transport substrates.
High-content screening applications are accomplishable by the use of automated inverted fluorescent microscopes recording multiple chips in parallel. Large data sets can be analyzed using the freely available custom-designed analysis software. Three-color multi spectral fluorescent read-out furthermore allows for unbiased data discrimination into different event classes, eliminating false positive results.
The chip technology is currently based on SiO2 surfaces, but further functionalization using gold-coated chip surfaces is also possible.

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

תחבורת ממברנה תהליכים נותחה על ידי מערכת שבב nanopore מקבילה מאוד ברזולוצית חלבון יחידה

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

הביטוי, solubilization דטרגנט, ועל טיהור Transporter ממברנה, חלבון ההתנגדות MexB Multidrug

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הכנה ואפיון של פרט ורב-סמים נטענים בפח פיזי Micelles פולימרית

התאמת ניגודיות דטרגנט בניסויים פיזור ניוטרון זווית קטנה עבור ניתוח מבנה של חלבון ממברנה ומודלים Initio אלב

ביטוי Solubilization, טיהור של בוראט האיקריוטים שנאים

ביטוי וטיהור בתפוקה גבוהה של נשאי מומסים אנושיים למחקרים מבניים וביוכימיים

ביטוי וטיהור בתפוקה גבוהה של נשאי מומסים אנושיים למחקרים מבניים וביוכימיים

ביטוי וטיהור בתפוקה גבוהה של נשאי מומסים אנושיים למחקרים מבניים וביוכימיים

טיהור הרטיקולום הסרקו-אנדופלזמי Ca²⁺-ATPase משריר הארנב

במבחנה של החקירה וMexAB זרימת המשאבה מPseudomonas aeruginosa

Proteoliposome מבוסס הזרימה Assay כדי לקבוע מאפייני מולקולה בודדת של Cl

תחבורת ממברנה תהליכים נותחה על ידי מערכת שבב nanopore מקבילה מאוד ברזולוצית חלבון יחידה