העבודה שלנו על לוקליזציה RNA נתמכת על ידי מענק מ-NIH (R01GM071049) כדי KLM.

חלק 1: שעתוק של mRNA שכותרתו fluorescently. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize DNA פלסמיד המכיל את הרכיב לוקליזציה RNA או רצף רלוונטיים אחרים ואת resuspend ב 1 מיקרוגרם / μl עם DEPC שטופלו H 2 O. תבנית ה-DNA חייב להיות מקדם אתרים במעלה עבור שעתוק על ידי T7, SP6, או T3 RNA פולימראז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ריאגנטים הבא צינור 1.5mL סטרילי: <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> א 10X Tx חוצץ (ראה M &amp; M) </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> ב 20X כובע / NTP לערבב (ראה M &amp; M) </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> ג 1 mM אלקסה פלואוריד 546-14-UTP (Invitrogen) </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> ד UTP, [α P-32] (1 μCi / μl) (פרקין אלמר) </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> ה DEPC-H 2 O </td><td> 11 μl </td></tr><tr><td> ו 0.2 מ DTT </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> ז RNasin (Promega) </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> ח תבנית ה-DNA ליניארי </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> i. RNA פולימראז (Promega) </td><td> 1 μl </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות ריאגנטים צנטריפוגות קצרה (10 שניות. Microcentrifuge ב א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 2-4 שעות ב 37 ° C, המכסה את הצינור עם רדיד אלומיניום על מנת למנוע photobleaching של fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​RNase ללא DNase (Promega) לבזות תבנית ה-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 15 דקות בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 79 μl 20 mM EDTA (pH 8.0) כדי לעצור את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר μl 1 לצינור נפרד, שכותרתו &quot;קלט&quot; ולשמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התגובה דרך טור 1 G50 מ&quot;ל (ראה חומרים ושיטות), אשר יכלול נוקלאוטידים מאוגדים תוך למעט mRNA באורך מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכז את הרנ&quot;א על ​​ידי המשקעים אתנול: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl 100% אתנול, 10 μl 7m CH 3 COONH 4, 1 המוביל μl RNA (tRNA שמרים, 10 מיקרוגרם / μl) או 1 הגליקוגן μl (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב עד להקפיא מוצק ב -80 מעלות צלזיוס למשך&gt; 30 דקות או על קרח יבש במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין במהירות המרבית microcentrifuge במשך 15 דקות, supernatant למזוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו עם 150 μl של אתנול 75%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין במשך 3 דקות במהירות המרבית supernatant microcentrifuge, למזוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את גלולה בשעה 37 ° C במשך 3 דקות, להבטיח כי כל אתנול התאדו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב 11 μl DEPC-H 2 O ולהסיר 1 μl אל צינור נפרד, שכותרתו &quot;שילב&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את ההתאגדות אחוזים לדלל את RNA ל 50 ננומטר (ראו חומרים ושיטות חישוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA צריך להיות קפוא 5 aliquots μl, לשימוש יחיד כדי למנוע הקפאה / הפשרה מחזורי והוא יכול להיות מאוחסן במשך מספר שבועות ב -80 ° C. </li></ol> חלק 2: הכנת Microinjection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA אופן ההכנה: הפשירי aliquot של רנ&quot;א (50 ננומטר), ו לפגל את הרנ&quot;א על ​​70 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות. ספין במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר microcentrifuge במהירות המרבית כדי להסיר חלקיקים, ולשמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הביצית אופן ההכנה: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח להסרת השחלות מ Xenopus laevis הנקבות (נסקו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך לחתיכות של השחלה laevis Xenopus לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל המכיל 25 מ&quot;ל של תמיסת collagenase (ראה חומרים ושיטות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער בעדינות על 18 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, או עד ביציות מופרדות בבירור מן השחלה. בשל אצווה וריאציה אצווה, זמן collagenase הטיפול עשוי להשתנות ולהיות במעקב צמוד באמצעות בדיקה ויזואלית על מנת להבטיח defoliculation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר ביציות להתיישב צינור, להסיר ולשטוף פתרון ביציות עם חיץ MBSH (ראה חומרים ושיטות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף פעמיים נוספות עבור סכום כולל של שלושה שוטף. זה פרוטוקול בידוד הביצית דומה לזה המפורט כהן ואח&#39;. 2009. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידנית בשלב המיון III / IV ביציות (דומון, 1972) במאגר MBSH תחת מיקרוסקופ לנתח סטנדרטי. שלב III ביציות הן אטומות לחלוטין אך לבן, ואילו השלב הרביעי ביציות נעשים קצת יותר גדולים ומנוקדים פיגמנט. ביציות כי הם שקופים מעט צעירים מדי וביציות כי פיגמנט מלא או הפצה מקוטב התערוכה פיגמנט הם זקנים מדי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחט אופן ההכנה: Pull and שפוע מחטים לקוטר החיצוני של 0.05 מ&quot;מ ~. (אנו משתמשים דראמונד מדעי 3.5 אינטש נימים (סדר # 3-000-203-G / X), ושות כלי סאטר micropipette חולץ וכן חברת WPI beveller). </li></ol> חלק 3: Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיול מחט עם DEPC-H 2 O 2 nl לספק לכל זריקה. אנחנו מול עומס מחט שלנו באמצעות גז מונחה microinjector (ראה חומרים ושיטות), ו לכייל גודל טיפה באמצעות מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען RNA לתוך מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מיון ביציות לתוך צלחת זריקה המכילה מאגר MBSH. אנו microinject על צלחת עם שכבה של גומי מוקצף שחור. ביציות חיוור להתבלט גם על backgrou לבןnd. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להזריק כל הביצית עם 2 nl של רנ&quot;א על ​​50 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרש RNA, לשטוף עם מחט DEPC-H 2 O, ו לטעון RNA הבא להזרקה. </li></ol> חלק 4: תרבות הביצית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום ביציות בבאר צלחת 24 סטרילית היטב (Sigma Aldrich). אנחנו תרבות של עד אלף ביציות לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חוצץ ולהחליף 400 μl O ocyte C ulture M edium (OCM; לראות חומרים ושיטות) לכל טוב. מניחים צלחת בתוך התרבות מיכל אוויר חזק פלסטיק עם מגבת נייר רטוב כדי לשמור על סביבה לחה במהלך התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ביציות בגיל 18 ° C עבור נקודות זמן הנעים בין 8 ל 48 שעות. </li></ol> חלק 5:, קיבוע התייבשות ואחסון של ביציות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין את כל ביציות מת במקום ביציות לשרוד צלוחיות זכוכית. אנחנו באופן שגרתי להתבונן&gt; הישרדות 90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום ביציות ב MEMFA מקבע (ראה חומרים ושיטות) ורוק במשך 20 דקות. הגנו על ביציות מן האור על ידי כיסוי עם רדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ביציות ידי הסרת מקבע והחלפת עם נפח שווה של חיץ MBSH. חזור על פעולה זו עוד פעם לשטוף עבור סכום כולל של שני שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ביציות לתוך מתנול anhydrous: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חצי נפח, להחליף עם מתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב &quot;a&quot; פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל הפתרון, להחליף עם מתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף מתנול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביציות ניתן לאחסן ב -20 ° C עד מוכנים התמונה. </li></ol> חלק 6: הדמיה לוקליזציה RNA באמצעות מיקרוסקופיה confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הדמיה, להוסיף סליקה של מוריי בינוני (02:01 בנזיל בנזואט, בנזיל אלכוהול) כדי FluoroDish כוס התחתונה (WPI Inc) כדי לכסות את פני השטח הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות העברת ביציות של מתנול כדי FluoroDish, צמצום נפח של מתנול העבירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה על מיקרוסקופ confocal הפוכה (השתמשנו בהצלחה LSM510 Zeiss ו TCS לייקה SP2). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1704/1704fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1:.. ויזואליזציה של לוקליזציה RNA subcellular ידי Microinjection מדביקים לו תווית של תמלילי fluorescently microinjection א בעקבות, RNA שכותרתו עם אלקסה פלואוריד 546 מוגבל בתחילה לגרעין B. אחרי שמונה שעות של תרבות, RNA שכותרתו fluorescently השליטה ניתן לראות באופן אחיד מופץ הציטופלסמה של הביצית. C. עם זאת, RNA שכותרתו fluorescently המכיל רצפים כי לגייס את מכונות התחבורה ניתן לראות תהליך של לוקליזציה subcellular לקוטב הצמחי של הביצית (לכיוון למטה). בר סולם = 50 מיקרומטר.

<ol>
	<li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes.">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li><li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li><li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+transport+in+ovo:+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs.">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li><li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes.">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li><li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTB/hnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes.">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li><li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes.">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li><li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes.">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li><li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin.">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li></ol>

ניסויים בעזרת חיות מעבדה בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת בראון.

כאן יש לנו הציגה פרוטוקול המאפשר הדמיה לוקליזציה mRNA ב ביציות Xenopus. שיטה זו, באמצעות שכותרתו fluorescently תעתיקי רנ&quot;א יש אות גבוה יחס רעש ממה שהושג בעבר עם digoxigenin שכותרתו תמלילי והוא פשוט יותר מהר מאשר ב-situ גישות מבוסס (Mowry ו מלטון, 1992, Gautreau et al. 1997). באמצעות שיטה זו, אנו י?...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

חיץ 10X Tx <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 60 מ&quot;מ MgCl 2 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 400 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 7.5) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 מ&quot;מ spermidine-HCl </li></ul> 20x כובע / NTP לערבב <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 mM CTP </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 mM ATP </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 9 מ&quot;מ UTP </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מ&quot;מ GTP </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 מ&quot;מ G (PPP) G שווי אנלוגי (ניו אינגלנד Biolabs) </li></ul> G-50 טור <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מימה גרם Sephadex G-50 חרוזים (Sigma Aldrich) ב 100 מ&quot;ל deionized H 2 O. DEPC לטיפול למשך 30 דקות. ו החיטוי. חנות מניות שלם בטמפרטורת החדר. לפני השימוש, מוסיפים את הבאים RNase ללא פתרונות: </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 מ&quot;ל 0.2 M EDTA </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 מ&quot;ל 1 M טריס pH 8.0 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 מ&quot;ל 20% SDS </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות להשלים G-50 פתרון ב 4 ° C. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לבטל את הבוכנה של מזרק 3 מ&quot;ל (BD Biosciences) והמקום חבית של המזרק לתוך שפופרת 15 מ&quot;ל חרוטי (קורנינג). הכנס את המזרק עם כמות קטנה של צמר זכוכית (תוסף בערך בגודל חצי פרוטה). </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> להשלים מערבולת ה-G-50 הפתרון resuspend חרוזים. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל G-50 הפתרון בעמודה ריקה. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין דקה 1 ב 1000 x g בצנטריפוגה benchtop. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl DEPC שטופלו deionized H 2 O כל עמודה. ספין. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף פעמיים נוספות עבור סכום כולל של שלושה שוטף. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לחבית המזרק צינור טרי 15 מ&quot;ל חרוטי. </li></ul> Collagenase פתרון <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 75 מ&quot;ג collagenase מ Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 25 מ&quot;ל 0.1 M KPO 3 + (pH 7.4) </li></ul> MBSH חיץ <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 88 mM NaCl </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 mM KCl </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.4 mM NaHCO 3 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.82 mM MgSO 4 X 7H 2 O </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.33 mM Ca (NO 3) 2 X 4H 2 O </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.41 mM CaCl 2 X 2 O 6 שעות </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> HEPES 10 מ&quot;מ (pH 7.6) </li></ul> תרבות הביצית בינוני <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 50% L15 בינוני </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> HEPES 15 מ&quot;מ (pH 7.6) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​אינסולין </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​גנטמיצין </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 U / ml nystatin </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 U / ml פניצילין </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין </li></ul> MEMFA פתרון <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1 מ מגבים (pH 7.4) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מ&quot;מ EGTA </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 mM MgSO 4 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 3.7% פורמלדהיד </li></ul> מחשוב תשואה RNA <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע לאלף הופעות &quot;קלט&quot; ו &quot;שילב&quot; דגימות באמצעות מונה נצנץ סטנדרטי. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> שילוב = (&quot;שילב&quot;) / (10 x &quot;קלט&quot;) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> שילוב ערכים אופייניים נעים בין ~ 0.03 ו 0.10. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> התשואות התיאורטיות מירבי polymerases שונים: T7, T3, SP6 - 2.64 מיקרוגרם </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובת התשואה מיקרוגרם = (תשואה מקסימלית של פולימראז בשימוש) X (שילוב) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל RNA ל 50 ננומטר = (מיקרוגרם RNA) / 320 / (אורך של רנ&quot;א בבסיסי) / (5X10 -8) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> התגובה בדרך כלל תשואות ~ 50-100 μl של רנ&quot;א על ​​50 ננומטר. </li></ul>

visualizing rna localization in xenopus oocytes

לוקליזציה RNA הוא מנגנון שימור של הקמת הקוטביות בתא. Vg1 mRNA localizes לקוטב הצמחי של ביציות Xenopus laevis ופועלת במרחב להגביל ביטוי גנים של חלבון Vg1. פיקוח הדוק של הפצה Vg1 באופן זה נדרש מפרט שכבת נאות נבט בעובר המתפתח. אלמנטים RNA הרצף UTR 3 &quot;של ה-mRNA, את אלמנט Vg1 לוקליזציה (VLE) נדרשים ומספיקים להעביר ישירות. כדי לחקור את ההכרה והובלה של mRNA Vg1 in vivo, פיתחנו טכניקה הדמיה המאפשרת ניתוח נרחב של טרנס גורם מנגנוני הובלה מכוונת דרך readout ויזואלית פשוטה. כדי להמחיש לוקליזציה RNA, אנו לסנתז שכותרתו fluorescently RNA VLE ו microinject זו תעתיק לתוך ביציות בודדים. אחרי תרבות הביצית כדי לאפשר הובלה של RNA מוזרק, ביציות הן קבועות מיובש לפני הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה confocal. ויזואליזציה של דפוסי לוקליזציה mRNA מספק readout לניטור מסלול שלם של רנ&quot;א התחבורה לזיהוי תפקידים בהכוונת RNA תחבורה cis-משחק גורמים בתוך התמליל ואת טרנס משחק הגורמים לאגד את VLE (Lewis et al. 2008, Messitt et al. 2008). הרחבנו את הטכניקה הזו באמצעות לוקליזציה בשיתוף עם RNAs נוספים חלבונים (גניון ו Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), בשילוב עם הפרעה של חלבונים המנוע את cytoskeleton (Messitt et al. 2008) לחקור המנגנונים לוקליזציה mRNA.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes at JoVE.com

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

ויזואליזציה של<em&gt; In vivo</em&gt; RNA תחבורה מושגת על ידי microinjection של תעתיקי רנ&quot;א שכותרתו fluorescently לתוך<em&gt; Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו מיקרוסקופיה confocal.

הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

visualizing-rna-localization-in-xenopus-oocytes

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

11.5K Views.  Brown University. ויזואליזציה של In vivo RNA תחבורה מושגת על ידי microinjection של תעתיקי רנ"א שכותרתו fluorescently לתוך Xenopus ביציות, ואחריו מיקרוסקופיה confocal.

Video: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב<em&gt; Xenopus</em&gt; ביציות על ידי spectrophotometry קליטה האטומית: חלופית למבחני radioisotope

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

<em&gt; Xenopus</em&gt; טכניקת ביצית Cut-פתוח וזלין גאפ מתח מהדק עם Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery (References 2 - 3, and references therein). A characteristic that makes the oocyte attractive for foreign channel expression is the poor abundance of endogenous ion channels4. This expression system has proven useful for the characterization of many proteins, among them ligand-gated ion channels.
The expression of GABAA receptors in Xenopus oocytes and their functional characterization is described here, including the isolation of oocytes, microinjections with cRNA, the removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments. The procedures were optimized in this laboratory5,6 and deviate from the ones routinely used7-9. Traditionally, denuded oocytes are prepared with a prolonged collagenase treatment of ovary lobes at RT, and these denuded oocytes are microinjected with mRNA. Using the optimized methods, diverse membrane proteins have been expressed and studied with this system, such as recombinant GABAA receptors10-12, human recombinant chloride channels13, Trypanosome potassium channels14, and a myo-inositol transporter15, 16.
The methods detailed here may be applied to the expression of any protein of choice in Xenopus oocytes, and the rapid solution change can be used to study other ligand-gated ion channels.

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

Xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור Microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הצמד תיקון הקלטה של תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב

השתלת פנים ב

Xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור Microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו

הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב

השתלת פנים ב

Xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור Microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו

הצמד תיקון הקלטה של תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus