שטיפת מי מלח לדגימת מיקרו-סביבה חיסונית של האף של הכלבים

ניתן להשתמש בשטיפת אף מלוחה כדי לדגום את המיקרו-סביבה החיסונית של האף הכלבי. מכיוון שהגישה אינה פולשנית יחסית ואינה משבשת את רקמות האף, ניתן לבצע אותה באופן סדרתי. ניתן לעבד תאים וחלבונים שנאספו מטכניקת שטיפת האף לניתוחי מעבדה שונים.

הערכת המיקרו-סביבה החיסונית המקומית של חלל האף של הכלב יכולה להיות חשובה לחקירת בריאות רקמות תקינות ומצבי מחלה, במיוחד אלה הקשורים לדלקת מקומית. ביצענו אופטימיזציה של טכניקה להערכת המיקרו-סביבה החיסונית המקומית של כלבים באמצעות שטיפת אף סדרתית. בקצרה, כאשר כלבים מורדמים וממוקמים בשכיבה על עצם החזה, מי מלח סטריליים שחוממו מראש נשטפים לנחיר הפגוע באמצעות קטטר גומי רך וגמיש. זרימת הנוזל החוזרת נאספת לצינורות חרוטיים, ותהליך זה חוזר על עצמו. הנוזלים המכילים תאים וחלבונים שנעקרו מאוגדים, ודגימות שטיפת האף המאוגדות מסוננות דרך מסננת תאים כדי להסיר פסולת גדולה וריר. הדגימות עוברות צנטריפוגה וכדורי התא מבודדים לניתוח. לאחר עיבוד הדגימות, ניתוחים שעשויים לעקוב אחר שטיפת האף כוללים ציטומטריית זרימה, ניתוח טרנסקריפטומי של תאים באמצעות רצף RNA בתפזורת או חד-תאית, ו/או כימות של ציטוקינים הקיימים בנוזל השטיפה.

כלבים מפתחים באופן שגרתי מצבים דלקתיים באף לאורך חייהם. הגורם הבסיסי לנזלת חריפה או כרונית בכלבים יכול לנוע בין זיהומי (ויראלי: למשל, שפעת, פאראינפלואנזה, וירוסי הרפס; חיידקים [למשל, בורדטלה, מיקופלזמה], פטרייתי [למשל, אספרגילוזיס, קריפטוקוקוזיס]; טפילי [למשל, קרדית האף]) לניאופלסטי (למשל, ממאירויות סינונאליות, לרוב קרצינומה או היסטוטיפים של סרקומה) לחומר זר (למשל, גוף זר, נדידה תוך-אפית של שיניים עקורות) למחלות חניכיים, כמו גם נזלת דלקתית אידיופטית כלבית 1,2,3,4,5,6,7.

בנוסף לבדיקה גופנית, נעשה שימוש בגישות שונות להערכת מצב החלל הסינונאלי בכלבים עם דלקת באף. הליכי הדמיה עשויים לכלול צילומי רנטגן (שיניים, גולגולת), טומוגרפיה ממוחשבת (CT) או הדמיית תהודה מגנטית (MRI). גישה נוספת להדמיית חלל האף היא רינוסקופיה. דגימת רקמות יכולה לכלול רכישת ספוגיות אף, דגימות מברשת או ביופסיות רקמות, מהן ניתן לבצע הערכה ציטולוגית ו/או היסטופתולוגית, כמו גם הגשת דגימות לתרבית פטרייתית או חיידקית. דגימות אלו עשויות להתקבל במגוון גישות, החל מדגימה "עיוורת", ועד להנחיית הדמיה עם רינוסקופיה או הדמיה מתקדמת, ונרכשות דרך הנרס, מהלוע האף, או בגישה כירורגית של טרפינציה, רינוטומיה או סינוסוטומיה.

שטיפת אף, הכוללת מתן מי מלח סטריליים לחלל האף, שימשה גם לדגימת חלל האף של הכלב למטרות אבחון וטיפול. גרסה חלופית של טכניקת שטיפת האף ששימשה לגידולי אף נקראת הידרופלסיה באף, המתוארת כשטיפה חזקה באף, שיכולה לעקור דגימות גידול גדולות להערכה אבחנתית וכן לספק הקלה טיפולית לשיפור הסימנים הקליניים הקשורים לסרטן האף⁸.

אנו מציגים כאן גרסה נוספת של טכניקת שטיפת האף למטרה המיועדת לאסוף ולנתח תאים וחלבונים של מיקרו-סביבת חיסון האף. באמצעות גישה עדינה ולא פולשנית יחסית, ביצענו אופטימיזציה של טכניקת שטיפת האף הזו לדגימת מיקרו-סביבה חיסונית סדרתית באף. בניסויים שכללו כלבים עם חללי אף לא דלקתיים, זיהום פעיל בנגיף ההרפס וגידולים סינונאליים, הדגמנו את התועלת של שטיפת אף לאיסוף ועיבוד דגימות ליישומים במורד הזרם ^9,10.

בכתב יד זה, אנו מתארים טכניקה של שטיפת אף מלוחה לדגימה סדרתית של מיקרו-סביבת חיסון האף של הכלבים. אנו מספקים פרטי פרוטוקול לרכישת דגימת שטיפת האף ביעילות עם הפרעה מינימלית לרקמות ולאחר מכן, עיבוד הדגימות למגוון ניתוחים.

הליך שטיפת אף זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קולורדו סטייט ומועצת הסקירה הקלינית (IACUC #2425). סכימה של שיטת שטיפת האף מוצגת באיור 1.

1. הכנה לשטיפת האף

1. יום לפני הליך שטיפת האף, מלאו חמישה מזרקים של 20 מ"ל במי מלח פיזיולוגיים סטריליים (תמיסת נתרן כלורי 0.9%) וסגרו עם מכסה. מניחים את המזרקים באינקובטור המכוון ל-37 ^{מעלות צלזיוס}כדי שיוכלו להתחמם למשך הלילה.

2. מיקום הכלב לשטיפת האף

1. להרדים את הכלב לצורך ההליך (למשל, עם הזרקה תוך-ורידית (IV) של דקסמדטומידין (1-4 מיקרוגרם/ק"ג) ובוטאורפנול (0.2-0.5 מ"ג/ק"ג) דרך צנתר IV), ולאחר מכן מתן פרופופול IV (2-5 מ"ג/ק"ג) המיועד לאינטובציה; לשמור על הרדמה עם 1-2% איזופלורן משאף כדי להשפיע.) אשר את עומק ההרדמה המתאים על ידי בדיקת תגובת פלפברל וטונוס הלסת.
2. יש לשמן את העיניים כדי למנוע ייבוש במהלך ההליך.
3. עקוב אחר טלמטריית לב, לחץ דם, קפנוגרפיה וערכי אוקסימטריית דופק לאורך כל ההליך.
4. מקם את הכלב המורדם בשכיבה על עצם החזה. הנח את ראש הכלב כך שהוא יהיה בזווית טבעית ונוחה בזווית כלפי מטה מקצה שולחן הטיפולים לאיסוף דגימות שטיפת אף אופטימלי.
5. נפח את השרוול של הצינור האנדוטרכיאלי כדי להבטיח אטימה הדוקה של דרכי הנשימה.

3. ביצוע שטיפת האף

1. חותכים קטטר גומי אדום סטרילי 8 FR בבסיס כך שיתאים היטב לאחד ממזרקי 20 מ"ל הממולאים מראש המכילים את מי המלח החמים. מדוד קטטר גומי אדום סטרילי כך שהקצה הדיסטלי של הקטטר יימשך בערך עד אמצע הדרך לתוך חלל האף כאשר הוא מוחדר דרך הנחיר. אם דוגמים גידול באף, השתמש בהדמיה או בהנחיה רינוסקופית כדי להעריך את מיקום האספקטר הרוסטרלי של גידול האף למדידת אורך צנתר הגומי האדום כך שהקצה ישתרע עד להיבט הרוסטרלי של הגידול.
2. לאחר מכן, חתוך את הקטטר בקצה לאורך הצנתר התוך-אף המוגדר כך שהקצה ינחת במיקום המתאים כאשר הוא מוכנס לחלל האף. עם זאת, אפשר אורך נוסף לבסיס הקטטר המשתרע מחוץ לנחיר (אורך הצנתר מנקודת קיבוע המזרק לכניסת הנחיר, כ-3-5 ס"מ). החל סימן עם טוש קבוע על קצה הבסיס של הצנתר כדי לציין את נקודת ההתחלה, המתאימה לכניסת הנחיר; אורך הצנתר שנקבע מראש יתפרש בתוך האף, כאשר קצה הצנתר ממוקם במיקום הרצוי בתוך חלל האף.
3. ביצוע הליך שטיפת האף ידרוש השתתפות של שני אנשים. הפוך אדם אחד (אדם א') לאחראי על הזנת הקטטר לחלל האף ומתן השטיפה והאדם השני (אדם ב') לאיסוף הדגימה כשהיא יוצאת מהאף.
4. בקש מאדם א' למקם את עצמו לפני ומתחת לראשו של הכלב. בידיים עטויות כפפות, בקש מאדם א' להנחות בעדינות את קצה קטטר הגומי האדום לתוך ההיבט המדיאלי של חלל האף ולקדם אותו עד שהסימן על הקטטר מתיישר עם ההיבט החיצוני של הנחיר. במהלך תהליך זה, ודא שהקטטר מחובר למזרק המכיל את מי המלח הסטריליים המחוממים. בקש מאדם ב' להחזיק צינור חרוטי של 50 מ"ל מתחת לנחיר כשהצנתר במקומו.
5. אדם א' חוסם בעדינות את הנחיר הנגדי ומתחיל להחדיר את מי המלח לחלל האף בלחץ איטי ויציב או בעירוי פועם. כאשר ראשו של הכלב ממוקם בזווית כלפי מטה, אדם ב' אוסף את הנוזל שמתנקז מחלל האף באמצעות כוח הכבידה לתוך הצינור החרוטי של 50 מ"ל.
6. חזור על טכניקת שטיפת האף הזו עד לסך של חמש שטיפות מי מלח של 20 מ"ל, והחלף צינורות חרוטיים, לפי הצורך, כדי לאסוף את הדגימות שנאספו. רשום את הנפח הכולל של נוזל שטיפת האף שנאסף ביחס לכמות מי המלח שהוחדרה לאחר השלמת ההליך.
7. לאחר השלמתו, אם מורדמים עם דקסמדטומידין, יש לתת תוך שרירי את אותו נפח של אטיפמזול המשמש לדקסמדטומידין, ולאפשר לכלב להתאושש מההרדמה. כדי להיות זהירים, החזיקו את הכלב בשכיבה חזה כשהראש ממוקם כלפי מטה כדי להקל על ניקוז נוסף של שאריות מלח משטיפת האף.

4. עיבוד דגימת שטיפת האף

1. מערבולת ו/או פיפטה בעדינות את דגימות שטיפת האף הכלולות בצינורות החרוטיים כדי לפרק גושי פסולת ותאים. העבירו את דגימות שטיפת האף המאוגדות דרך מסנן מאמץ תאים של 70 מיקרומטר כדי להסיר פסולת גדולה וריר. צנטריפוגה את הדגימות ב-300 × גרם למשך 5-10 דקות ליצירת כדור תא.
2. אסוף את הסופרנטנט באמצעות שאיפה עם פיפטה והפקיד אותו בשפופרת נקייה לניתוח חלבונים מעניינים.
3. השעו מחדש כדורי תאים בתמיסת מלח עם פוספט (PBS) או תמיסה מועדפת לבדיקות תאים מעניינות.
4. כדי לנקות כדוריות דם אדומות מהדגימות, בצע ליזה של אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) כדי לאסוף תאים גרעיניים משטיפת האף^11,12.

בשיטת שטיפת אף זו, הדגימה שנאספה תיראה מעט עכורה, אולי עם חתיכות גלויות של פסולת תאית וריר כאשר הצינור מסתחרר. דגימה תיחשב מזוהמת בדם היקפי אם הליך השטיפה גורם בטעות לדימום, והדגימה צבועה באדום. בעוד שחלק ממי המלח המוחדרים יאבדו במהלך ההליך, שטיפה שלילית תישקל אם מי המלח ה...

ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול שטיפת האף. ביחס לכלב שעובר את הליך שטיפת האף, הכלב חייב להיות במישור הרדמה עמוק מספיק כדי שלא יגיב להנחת הצנתר או למתן השטיפה. אם הם מגיבים בהרדמה, הדבר עלול לפגוע באיכות ובכמות איסוף דגימות השטיפה, כמו גם להגביר את הסיכון לפגיעה חריפה בר?...

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

טכניקת שטיפת האף של הכלבים המתוארת כאן עברה אופטימיזציה באמצעות פרויקטים הנתמכים על ידי K01 OD03109, פרס מענק הפיילוט של CCTSI קולורדו, תוכנית המשאבים המשותפים של מועצת המחקר של מכללת CSU CVMBS ו-CO HNC SPORE CA261605: תוכנית לשיפור קריירה. איור 1 נוצר עם BioRender.com.